Effect of cysteine in maturation medium on embryos development by in vitro fertilization (ivf) in porcine

Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2 2016 Trang 19 Ảnh hưởng của cystein trong môi trường nuôi cấy tế bào trứng đến khả năng tạo phôi bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) ở h[.]

TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T2- 2016 Ảnh hưởng cystein môi trường nuôi cấy tế bào trứng đến khả tạo phôi kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (IVF) heo  Nguyễn Thanh Bình Trường Đại học Thủ Dầu Một, Bình Dương ( Bài nhận ngày 16 tháng 07 năm 2015, nhận đăng ngày 14 tháng 04 năm 2016) TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm đánh giá ảnh hưởng việc bổ sung cystein vào môi trường nuôi cấy tế bào trứng đến hàm lượng glutathione (GSH) trứng phát triển phôi kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm heo Khi bổ sung 0,6 mM cystein vào môi trường TCM 199 làm tăng lượng GSH trứng, nhận thấy rõ từ nuôi thứ 40 nồng độ GSH đạt mức cao nuôi thứ 44 (18,32 pmol/trứng) Sau ngày nuôi phôi, tổng số 1000 trứng ni chín cho thụ tinh thu 583 phôi tế bào, 408 phôi 3–4 tế bào, 264 phôi 5–8 tế bào 106 phơi dâu Trong đó, tỷ lệ thụ tinh phân chia phôi tốt trứng nuôi chín 44 giờ, với 200 phơi có tế bào (80 %), 161 phơi có 3–4 tế bào (64,4 %), 144 phơi có 5-8 tế bào (45,6 %) 62 phôi dâu (24,8 %) Kết cho thấy thời điểm bổ sung cystein vào môi trường nuôi trứng thời gian nuôi trứng ảnh hưởng đến nồng độ GSH trứng Đồng thời, tỷ lệ phát triển phôi bị ảnh hưởng thời gian ni chín nồng độ GSH trứng Từ khóa: cystein, TCM, phơi, heo, GSH MỞ ĐẦU Tạo phôi heo phương pháp thụ tinh ống nghiệm nghiên cứu từ năm cuối kỷ 20 [1] Đến nay, phương pháp nghiên cứu với mong muốn tạo phôi heo với số lượng lớn chất lượng ngày tốt để phục vụ cho mục đích nghiên cứu nghiên cứu y sinh học [2] Bằng kỹ thuật ni chín trứng ống nghiệm - thụ tinh ống nghiệm (IVM - IVF) người ta chủ động nguồn trứng phục vụ cho q trình nghiên cứu Mặc dù có nhiều tiến hệ thống IVM - IVF tỷ lệ phôi heo tạo ống nghiệm thường thấp (khoảng 20 %) chất lượng Quá trình ni chín trứng heo in vitro diễn thời gian dài (trên 36 giờ), trứng phải thực trao đổi chất Khi trứng sản sinh lượng chất oxy hóa, chất oxy hóa tích tụ nhiều khơng chuyển hóa chất chống oxy hóa gây độc cho trứng Điều làm ảnh hưởng đến chất lượng trứng phát triển phôi sau thụ tinh [3] Trang 19 Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 Glutathione (GSH) tổng hợp tế bào lồi động vật, có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi bị oxy hóa Trong q trình thụ tinh in vitro, GSH có tác dụng làm giảm lượng cần thiết để tháo xoắn nhiễm sắc thể trước hình thành tiền nhân đực [4] đóng vai trị quan trọng hình thành tiền nhân đực sau thụ tinh [5] Trong q trình phát triển phơi in vitro, GSH giúp tăng cường phát triển phôi trì hình thái trục phân bào giảm nhiễm nỗn, từ đảm bảo hình thành hợp tử bình thường [6] Cystein (Cys) ba acid amine cấu tạo nên GSH Mặc dù Cys tham gia vào q trình tổng hợp GSH nỗn mơi trường tế bào, Cys lại dễ bị oxy hóa thành cystine Khi bổ sung Cys làm tăng tổng hợp GSH nội bào [7] Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng trứng để thụ tinh ống nghiệm trứng trưởng thành giai đoạn MII có thể cực Ngoài ra, đánh giá nồng độ GSH trứng để xác định mức trưởng thành tế bào chất Đồng thời, khả thụ tinh phát triển phôi tốt trứng trưởng thành nhân tế bào chất Ở Việt Nam, nghiên cứu nuôi trưởng thành noãn thụ tinh ống nghiệm heo cịn Đặc biệt đánh giá GSH q trình ni chín trứng chưa có tỷ lệ phát triển phơi heo cịn thấp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Buồng trứng heo thu nhận từ lò mổ Vissan - 420 Nơ Trang Long, quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh Tinh dịch tươi heo đực giống Duroc cung cấp trại heo giống quốc gia Bình Minh - Tân Bình, Bình Minh, Trảng Bom, Đồng Nai Ngay sau heo giết mổ, buồng trứng heo cắt rời khỏi ống sinh dục Sau đó, buồng trứng rửa dung dịch 0,9 % NaCl có bổ sung kháng sinh (peniciline streptomycine) - lần Buồng trứng trữ bình có chứa dung dịch nước muối 0,9 % Trang 20 NaCl, có bổ sung kháng sinh chuyển phòng thí nghiệm vịng Tại phịng thí nghiệm, buồng trứng heo rửa lần với dung dịch nước muối sinh lý có kháng sinh Các nang có đường kính - mm chọn để thu nhận trứng Buồng trứng có nang đạt yêu cầu đường kính chọc hút thu dịch nang trứng ống tiêm 10 mL, kim 18G có chứa mL dung dịch Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) Dịch nang trứng thu được quan sát kính hiển vi soi để tìm nỗn Những trứng có tế bào chất đen có từ lớp tế bào ổ trở lên bám xung quanh thu nhận cho thí nghiệm Ni chín trứng Trứng ni chín mơi trường TCM – 199 bổ sung 10 % fetal calf serum (FCS), penicilline streptomycine Trứng ni vi giọt (25 nỗn/100 µL), có phủ dầu khoáng, tủ CO2 38,5 0C, % CO2, bão hòa nước Vi giọt ổn định tủ CO2 38,5 0C, % CO2, bão hòa nước trước ni Tại cuối thời gian ni chín, trứng tiến hành đánh giá nồng độ GSH Thời gian ni chín trứng để đánh giá GSH từ đến 50 nuôi, thời gian ni chín trứng để thụ tinh in vitro từ 36 đến 48 nuôi 5,5-dithiobis(2–nitrobenzoic acid) dễ bị khử nhóm sulfhydryl GSH tạo thành anion có màu vàng đo bước sóng 412 nm Đậm độ màu tỉ lệ với nồng độ GSH Chuẩn bị tinh trùng Tinh dịch tươi heo đực giống Duroc, trại heo giống Bình Minh sử dụng để chuẩn bị tinh trùng Trước tiên mL dung dịch D-PBS cho vào ống falcon Tiếp theo, mL tinh dịch cho vào đáy ống falcon cho tạo thành phân lớp tinh dịch dung dịch D-PBS Tinh trùng khỏe, thu nhận từ tinh dịch phương pháp bơi lên Quá trình bơi lên diễn TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T2- 2016 nhiệt độ phịng Sau đó, lớp dịch tinh trùng phía thu nhận ly tâm 2000 vòng phút Cuối cùng, lớp cặn thu nhận huyền phù trở lại Cặn huyền phù điều chỉnh mật độ tinh trùng môi trường TL-Hepes để đạt nồng độ 1x106 tinh trùng/mL Thụ tinh ni phơi Trứng sau hồn tất thời gian ni chín loại bỏ lớp tế bào ổ cách dùng pipette Pasteur hút đẩy nhiều lần Sau đó, trứng ủ với tinh trùng điều chỉnh mật độ vi giọt môi trường (100 µL tinh trùng/giọt), có phủ dầu khống Vi giọt mơi trường chuẩn bị cân tủ ấm 38,5 0C, % CO2 trước sử dụng Các trứng ủ với tinh trùng giờ, điều kiện 38,5 0C; % CO2, bão hòa nước Sau ủ trứng với tinh trùng giờ, nỗn thụ tinh mơi trường TL-Hepes rửa môi trường nuôi phôi (PZM – 3,0 mg/mL BSA) để loại bỏ tinh trùng khỏi hợp tử giả định Sau đó, hợp tử giả định nuôi vi giọt môi trường PZM - + mg/mL BSA (10 phôi/ 100 µL mơi trường ni phơi), có phủ dầu khống, 38,5 0C; % CO2, bão hòa nước Hợp tử giả định nuôi đến 120 theo dõi phát triển 24 nuôi Trứng nuôi mức thời gian nuôi khác 36 giờ, 40 giờ, 44 48 môi trường TCM199 + % FCS Sau ni chín, trứng thụ tinh với tinh trùng xử lý hoạt hóa mơi trường TLHepes Nồng độ tinh trùng sử dụng để thụ tinh 1x106 tinh trùng/mL Sau thụ tinh giờ, phôi giả định chuyển sang nuôi tiếp môi trường PZM3 + mg/mL BSA Phôi giả định nuôi đến 120 theo dõi phát triển 24 nuôi Xử lý số liệu Các số liệu thu thí nghiệm phân tích thống kê để so sánh khác biệt nghiệm thức phần mềm Statgraphic centurion XV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nồng độ GSH nỗn ni in vitro có bổ sung cystein Nồng độ GSH sau ni chín trứng mốc thời gian khác bổ sung 0,6 mM Cys thời điểm khác nhau, q trình ni đo mật độ quang máy quang phổ bước sóng 412 nm Thí nghiệm lặp lại lần Kết thể Bảng 1, bổ sung 0,6 mM Cys vào môi trường TCM 199 + 10 % FCS thời điểm nuôi khác (giờ - bắt đầu nuôi, 36 40) làm tăng nồng độ GSH nỗn heo so với khơng bổ sung Cys Kết phù hợp với Sawai cs [8] bổ sung Cys mơi trường khơng có serum thời gian 0, 12, 24 36 ni nỗn 48 làm tăng nồng độ GSH Bảng Nồng độ GSH noãn theo thời gian ni chín nỗn 0,6 Thời điểm bổ sung * Giờ Giờ 36 Giờ 40 Số noãn$ 90 90 90 90 36 5,48a ± 0,6 7,15b ± 0,8 5,37a ± 0,5 - Thời gian nuôi (giờ) 40 44 8,57a ± 0,6 13,18a ± 2,7 10,51a ± 1,2 15,52b ± 0,91 b 12,20 ± 0,44 16,67b ± 1,4 a 9,12 ± 0,5 18,32c ± 1,3 48 6,38a ± 3,4 8,31b ± 1,3 10,32c ± 0,5 11,40c ± 0,7 : Các ký tự khác cột thể khác biệt mặt thống kê (P< 0,05) * Kết từ thí nghiệm $ : Thí nghiệm lặp lại lần a,b,c Trang 21 Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 Đối với trứng nuôi đến 36 giờ, nồng độ GSH tăng Cys bổ sung từ đầu q trình ni nỗn (từ 5,48 pmol/noãn lên 7,15 pmol/noãn) khác biệt so với lô không bổ sung Cys Ngược lại, bổ sung Cys 36 làm giảm nồng độ GSH so với lô đối chứng (từ 5,48 ± 0,60 pmol/trứng xuống 5,37 pmol/trứng) Tuy nhiên, nồng độ GSH trứng lơ có bổ sung 0,6 mM Cys lúc 36 khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với lơ khơng bổ sung Cys Đối với nỗn nuôi đến 40 giờ, nồng độ GSH đạt cao bổ sung Cys lúc 36 (12,20 pmol/noãn) khác biệt so với lô đối chứng Mặc dù, Cys thêm vào thời điểm bắt đầu nuôi 40 làm tăng nồng độ GSH trứng không khác biệt so với lô không bổ sung Cys (10,51; 9,12 8,57 pmol/trứng) Đối với trứng nuôi đến 44 giờ, nồng độ GSH trứng ni mơi trường có bổ sung Cys tăng khác biệt so với lơ khơng có bổ sung Cys Nồng độ GSH đạt cao bổ sung Cys lúc 44 (18,32 pmol/nỗn) khác biệt so lơ đối chứng Mặc dù, nồng độ GSH trứng thêm Cys vào thời điểm bắt đầu nuôi 36 có khác biệt khơng có ý nghĩa (10,51 16,67 pmol/trứng) Đối với trứng nuôi đến 48 giờ, nồng độ GSH trứng nuôi môi trường có bổ sung Cys tăng khác biệt so với lơ khơng có bổ sung Cys Nồng độ GSH đạt cao bổ sung Cys lúc 40 (từ 6,38 ± 3,40 pmol/ trứng lên 11,40 pmol/ trứng) Đồng thời, nồng độ GSH trứng thêm Cys vào thời điểm 36 đạt 10,32 pmol/ trứng, khác biệt không ý nghĩa so với việc bổ sung Cys lúc nuôi 40 Trong đó, nồng độ GSH trứng ni có bổ sung Cys bắt đầu nuôi đạt 8,31 pmol/ trứng Trong mơi trường TCM 199 có thành phần Cys với nồng độ thấp khoảng Trang 22 0,0006 mM Hơn nữa, môi trường in vitro Cys dễ dàng bị oxy hóa, nên với nồng độ Cys có mơi trường TCM 199 khơng đủ để nỗn heo tổng hợp GSH [4] Vì thế, thí nghiệm trứng ni mơi trường TCM 199 bổ sung 0,6 mM Cys vào ba thời điểm khác q trình ni chín 0, 36 40 để đánh giá ảnh hưởng thời điểm bổ sung Cys lên nồng độ GSH trứng Nồng độ GSH đo thí nghiệm cao so với báo cáo trước Theo Wang cs (1997), nồng độ GSH trứng heo trưởng thành môi trường NCSU 23 bổ sung 0,57 mM Cys 10 % pFF 5,8 pmol/ trứng Theo Sawai cs [8], bổ sung Cys mơi trường khơng có serum thời gian 24, 36 48 làm tăng nồng độ GSH không làm ảnh hưởng đến trưởng thành nhân, xâm nhập tháo xoắn tinh trùng Điều cho thấy cần có thời gian định để Cys tổng hợp chuyển vào trứng Từ làm tăng nồng độ GSH bổ sung Cys vào môi trường Hiệu bổ sung cystein đến tỷ lệ thụ tinh Sau thụ tinh hai ngày, phơi quan sát (Hình 1) kết thể Bảng Hình Các phơi sau ngày ni (ở vật kính 10X) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T2- 2016 Bảng Tỷ lệ thụ tinh ống nghiệm Thời gian nuôi (giờ) Tỷ lệ thụ tinh (%) 36 43,2a 40 51,2ab 44 80,0c 48 58,8b a - c: Các ký tự khác cột thể khác biệt mặt thống kê (P< 0,05) Tỷ lệ thụ tinh đạt từ 43,2 – 80 % Tuy nhiên, thời gian ni chín trứng khác tỷ lệ thụ tinh trứng khác Trong đạt tỷ lệ thấp lơ có trứng ni chín 36 (43,2 %) khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với lơ nuôi 40 (51,2 %) Mặc dù tỷ lệ thụ tinh trứng nuôi 48 cao trứng ni 40 khơng có ý nghĩa thống kê (58,8 % so với 51,2 %) Tỷ lệ thụ tinh đạt cao lơ có trứng ni chín 44 (80 %) khác biệt có ý nghĩa so với lơ thí nghiệm khác Điều cho thấy với 44 ni chín in vitro trứng trưởng thành hồn tồn, thích hợp cho trình thụ tinh diễn Kết phù hợp với nhận định Alminana cs; Yoshioka cs; Yuan Krisher [9-11] tỷ lệ trứng trưởng thành (ở kỳ II có thể cực) đạt từ 75 % đến 85 % quy trình IVM có thời gian ni đến 44 giờ, trứng dùng để thụ tinh ống nghiệm cho tỷ lệ tạo phôi in vitro cao Thời gian ni chín trứng trước thụ tinh có ảnh hưởng lớn Thật vậy, nỗn có thời gian ni chín từ 36 đến 48 giờ, nên có khác biệt tỷ lệ thụ tinh lơ thí nghiệm Sau tinh trùng xâm nhập thành cơng vào tế bào chất làm tháo xoắn, hình thành tiền nhân đực, hợp tiền nhân đực tiền nhân cái, hình thành thể cực thứ hai, sau đó, phơi tiến hành lần phân chia đầu tiên, từ hợp tử với tế bào thành phơi có tế bào Khi tế bào chất trứng khơng chưa đủ trưởng thành kiện khó xảy Khi so với tác giả Việt Nam thực trình thụ tinh in vitro thành cơng heo kết cao hơn: H.T.L Duyên [12] ghi nhận tỷ lệ phôi tế bào 30,1 % xử lý tinh trùng phương pháp Gradient Percoll nuôi phôi môi trường NCSU23 + 0,4 % BSA Trong thí nghiệm này, tinh trùng xử lý phương pháp swim up, nuôi phôi PZM3 + mg/mL BSA Hiệu bổ sung cystein đến khả thu phôi Các phôi nuôi tiếp tục đến ngày thứ sau thụ tinh Sự phát triển phôi qua giai đoạn ghi nhận tương ứng lúc 72; 96 120 kể từ lúc thụ tinh Kết thể Bảng Bảng Tỷ lệ phát triển phôi qua giai đoạn Thời gian nuôi (giờ) Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn (%) phôi - tế bào phôi - tế bào phôi dâu 36 27,2a 12,0a 1,2a 40 28,8a 19,6b 5,2b 44 64,4c 45,6d 24,8d 48 42,8b 28,4c 11,2c a - d: Các ký tự khác cột thể khác biệt mặt thống kê (P< 0,05) Trang 23 Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 lệ phôi 3-4 tế bào 42,8 % (Hình 2) khác biệt so với lơ ni 36 40 Hình Các phơi 3-4 tế bào (ở vật kính 10X) Sau lần lặp lại thí nghiệm, tổng số phơi 3-4 tế bào thu từ lơ thí nghiệm 408 phơi Tỷ lệ phát triển phôi đến giai đoạn 3-4 tế bào từ 27,2–64,4 % có khác biệt lơ thí nghiệm Trong đó, thấp lơ 36 (27,2 %) không khác biệt so với lô nuôi 36 (28,8 %) Cao lô 44 (64,4 %) khác biệt so với lô thí nghiệm khác Cịn lơ ni 48 giờ, tỷ Kết thu đạt với tổng số phôi - tế bào từ lơ thí nghiệm 264 phôi Tỷ lệ phát triển phôi đến giai đoạn 5-8 tế bào cao (1245,6 %) có khác biệt lơ thí nghiệm Trong đó, thấp lô 36 (12 %) khác biệt so với lô nuôi 40 (19,6 %) Lô nuôi 48 giờ, tỷ lệ phôi - tế bào 28,4 % Cao lô 44 (45,6 %) khác biệt so với lơ thí nghiệm khác Tổng số phôi dâu tạo thành từ lô thí nghiệm 106 phơi Tỷ lệ phơi dâu từ 1,2–24,8 % có khác biệt lơ thí nghiệm Trong đó, thấp lơ 36 (1,2 %) khác biệt so với lô nuôi 40 (5,2 %) Lô nuôi 48 giờ, tỷ lệ phôi dâu 11,2 % khác biệt so với lô nuôi 36 40 Cao lô 44 (24,8 %) khác biệt so với lơ thí nghiệm khác Hình Các phơi 5-8 tế bào phơi dâu (ở vật kính 10X) Kết cho thấy với thời gian nuôi trứng từ 36 trở lên, phôi phát triển đến giai đoạn phơi dâu (Hình 3) Với thời gian ni nỗn 36 giờ, phôi truyền thông tin di truyền thành công phôi heo vượt qua giai đoạn ngừng tăng trưởng Khi đánh giá chung khả phát triển đến giai đoạn phôi 3-4 tế bào phôi 5-8 tế bào trứng nuôi 36 40 giờ, khơng có khác biệt Nhưng khả phát triển đến giai đoạn Trang 24 phôi dâu nuôi 40 tốt so với 36 Mặc dù, trứng ni 36 có tỷ lệ phơi dâu thấp (khoảng 1,2 %) So với H.T.L Duyên [12], kết đạt cao nhiều tỷ lệ phôi dâu tạo thành N.T.Thoa cs [13] báo cáo tỷ lệ phôi dâu tạo thành nuôi phôi môi trường Pig - FM thấp so với kết nghiên cứu (23,75 % so với 24,8 %) TAÏP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T2- 2016 KẾT LUẬN Những kết trình bày cho thấy thời điểm bổ sung cystein vào môi trường nuôi trứng thời gian nuôi trứng ảnh hưởng đến nồng độ GSH trứng; tỷ lệ phát triển phơi bị ảnh hưởng thời gian ni chín nồng độ GSH trứng Chúng tạo phơi heo in vitro từ nguồn nỗn heo ni chín in vitro từ 36 đến 48 sử dụng môi trường PZM3 bổ sung mg/mL BSA Thời gian ni chín trứng có ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh phát triển phôi heo Tỷ lệ thụ tinh cao (80 %) tỷ lệ phôi dâu cao (24,8 %) tương ứng với thời gian nuôi chín trứng 44 Effect of cysteine in maturation medium on embryos development by in vitro fertilization (IVF) in porcine  Nguyen Thanh Binh Thu Dau Mot University, Binh Duong ABSTRACT In this article, we studied the effect of cystein in maturation culture on glutathione concentration in oocyte and on embryos development by in vitro fertilization in porcine 0.6 mM cysteine supplementation on TCM-199 medium has increased the amount of GSH in the oocyte The GSH level began to increase at the 40th hour after cystein supple metation and attained the highest at the 44th hour (18.32 pmol/oocyte) After days of embryos culture, a total of 1000 oocyte maturation and fertilization was obtained including 583 embryos containing cells, 408 embryos containing 3-4 cells, 264 embryos containing 5-8 cells and 106 morula In particular, fertilization rate and embryo division was the best in the oocyte maturation of the 44th hour with 200 embryos containing cell (80 %), 161 embryos containing 3-4 cells (64.4 %), 114 embryos containing 5-8 cells (45.6 %) and 62 morula (24.8 %) The results showed that the time of the cysteine supplementation into medium and the time of muturation affected oocyte GSH level In addition, embryoic development rate was also affected by maturation time and oocyte GSH level Key words: cysteine,TCM, embryo, porcine, GSH TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] W.T.R Cheng, R.M Moor, C Polge, In vitro fertilization of pig and sheep oocytes matured in vivo and in vitro, Theriogenology, 25, 1, 146 (1986) [2] N.T Binh, Thụ tinh ống nghiệm heo Trong Thụ tinh ống nghiệm (H.M Tường, Đ.Q Vinh, V.T.N Lan, H.G Bảo, N.T Bình, T.T.T Bình, N.H Duy, C.A Dũng, L.T.H Khả, N.T.T Lan, N.K Linh, N.T Mai, G.Q Như, H.T Quế, N.N Quỳnh, M.C.M Tâm), Nhà xuất Giáo Dục, Thành phố Hồ Chí Minh, 623-632 (2011) Trang 25 Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 [3] T.B Nguyen, V.T Nguyen, M Masashi, Effects of liquid preservation of sperm on their ability to activate oocytes and initiate preimplantational development after intracytoplasmic sperm injection in the pig, Theriogenology, 71, 9, 1440-1450 (2009) [4] M Yoshida, K Ishigaki, T Nagai, M Chikyu, V.G Pursel, Glutathione concentration during maturation and after fertilization in pig oocytes: relevance to the ability of oocytes to form male pronucleus, Biology of Reproduction, 49, 1, 89-94 (1993) [5] A.C Boquest, L.R Abeydeera, W.H Wang, B.N Day, Effect of adding reduced glutathione during insemination on the development of porcine embryos in vitro, Theriogenology, 51, 7, 1311-1319 (1999) [6] K.A Zuelke, S.C Jeffay, R.M Zucker, S.D Perreault, Glutathione (GSH) concentrations vary with the cell cycle in maturing hamster oocytes, zygotes, and preimplantation stage embryos, Molecular Reproduction and Development, 64, 1, 106112 (2003) [7] H Funahashi, B.N Day, Effects of cumulus cells on glutathione content of porcine oocytes during in vitro maturation, Journal of Animal Science, 73, 1, 90 (1995) [8] K Sawai, H Funahashi, K Niwa, Stagespecific requirement of cysteine during in vitro maturation of porcine oocytes for glutathione synthesis associated with male Trang 26 [9] [10] [11] [12] [13] pronuclear formation, Biology of Reproduction, 57, 1, 1-6 (1997) C Alminana, M.A Gil, C Cuello, I Caballero, J Roca, J.M Vazquez, E.A Martinez, In vitro fertilization (IVF) in straws and a short gamete coincubation time improves the efficiency of porcine IVF, Reproduction in Domestic Animals, 43, 6, 747-752 (2008) K Yoshioka, C Suzuki, S Itoh, K Kikuchi, S Iwamura, H RodriguezMartinez, Production of piglets derived from in vitro-produced blastocysts fertilized and cultured in chemically defined media: effects of theophylline, adenosine, and cystein during in vitro fertilization, Biology of Reproduction, 69, 6, 2092-2099 (2003) Y Yuan, R.L Krisher, Effect of ammonium during in vitro maturation on oocyte nuclear maturation and subsequent embryonic development in pigs, Animal Reproduction Science, 117, 3, 302-307 (2010) H.T.L Duyên, Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh in vitro PCR xác định giới tính heo (Sus scrofa domestica), Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (2003) N.T Thoa, L.N Anh, V.T Hương, T.S Hà, D.V Hương, N.T Hương, Kết tạo phôi lợn ống nghiệm sử dụng môi trường NCSU37 + 10 % pFF, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn ni, 19, 34-40 (2009)  ... the effect of cystein in maturation culture on glutathione concentration in oocyte and on embryos development by in vitro fertilization in porcine 0.6 mM cysteine supplementation on TCM-199 medium. .. chín trứng 44 Effect of cysteine in maturation medium on embryos development by in vitro fertilization (IVF) in porcine  Nguyen Thanh Binh Thu Dau Mot University, Binh Duong ABSTRACT In this article,... After days of embryos culture, a total of 1000 oocyte maturation and fertilization was obtained including 583 embryos containing cells, 408 embryos containing 3-4 cells, 264 embryos containing 5-8