Nghiên cứu quá trình nuôi cấy tế bào mô sẹo cây xáo tam phân (paramignya trimera)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Ị ■ ỆỆỀ ' I ■ SVTH KHÓÁ GYHD 2013 - 2017 ThS SỖ TIẾN VỈNH ThS NGUYỄN TRUNG HẬU Tất Thành Thu' viện 1616 TP HƠ CHÍ MINH - NĂM 2017 NGHIÊN cúu Q TRÌNH NUÔI CÁY TÉ BÀO MÔ SẸO CÂY XÁO TAM PHẤN (Paramignya trimerà) HÀ ÁNH HỒNG Khóa luận đệ trình đẻ đáp ứng yêu cầu cấp băng Kỹ sư ngành Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: ThS Đỏ TIÊN VINH ThS NGUYỀN TRƯNG HẬƯ TRƯỜNG ĐH NG-UYỀ N TẤT THÀ NH TRUNG TÂM THÔNG TIN-THƯ VIỆN I xỉn chấn thành càm ơn chi dạy tận tình Thây Đô Tiên Vinh Thầy Nguyễn Trung Hậu giúp em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn trường Đại học Nguyễn Tất Thành tạo điều kiện cho em có mơi trường học tập thật tốt để thực ước mơ cua Đặc biệt Thầy Cô Khoa Nông nghiệp Công nghệ cao Công nghệ Sinh học truyền đạt dạy dỗ cho em tảng kiến thức quý báu nãm vừa qua Em cảm ơn tập thể lóp 13DSH02 nhũng người ln chia sẻ, giúp đỡ lúc em gặp khó khăn thực khóa luận Và em cảm ơn anh chị bạn bẽ phịng thí nghiệm CNSH thực vật trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM giúp đỡ em thực khóa luận Sau cùng, xin gửi cảm ơn sâu sac đến gia đình Ba Mẹ người thân giúp đỡ, quan tâm tạo điều kiện học tập tốt cho Em xin chân thành cảm ơn! Tp.HCM tháng 8, năm 2017 Sinh viên HÀ ÁNH HỒNG ii TÓM TẢT Đe tai Nghiên cứu q trình ni cấy tế bào mơ sẹo Xáo Tam Phân (Paramlgnya trimera)” thực phông thi nghiệm CNSH thực vật trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM, địa chì số 12 Nguyễn Văn Bảo phường 4, quận Gị vấp, TP Hơ Chí Minh Đê tài thực tử tháng nám 2017 đến tháng năm 2017 với mục tiêu đê tài xác định thành phần chi: điéu hòa sinh trưởng chất bổ trợ để tạo mô sẹo nhân sinh khối mơ sẹo cày Xâo Tam Phân Thí nghiệm bổ trí hồn tồn ngẫu nhiên với lần lặp lại Nội dung thực gồm thí nghiệm: - Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hường none độ javel thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu cấy Xáo Tam Phản iParamignya trimera) - Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hường chất điều hòa sinh trường 2,4-D đến khả tạo mô sẹo Xáo Tam Phân - Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trường NAA đến khả tạo mơ sẹo Xáo Tam Phân - Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng phối hợp chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin cytokinin đến khả tăng sinh khối mơ sẹo Xáo Tam Phân - Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng chất bổ trợ đến q ưình tăng sinh mơ sẹo Xáo Tam Phân Kết đạt được: - Nồng độ javel 50%, thời gian 25 phút thời gian thích hợp để tạo mẫu cấy vô trùng Xáo Tam Phân - Nồng độ 2,4-D thích hợp tạo mơ sẹo Xáo Tam Phân mg/1 - Nồng độ 2,4-D thích hợp để tàng sinh khối mơ sẹo Xáo Tam Phân mg/1 kết hợp với BA có nồng độ 0,5 mg.'l - Nồng độ nước dừa I0°o thích hợp để tàng sinh mơ sẹo Xáo Tam Phân iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẤT vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix MỎ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung thực Ý nghĩa đề tài Chuông 1: TỎNG QUAN 1.1 Giới thiệu Xáo Tam Phân 1.1.1 Phân loại khoa học phân bố 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng canh tác 1.2 Thành phần hóa học 1.2.1 Flavonoid 1.2.2 Saponin 1.2.3 Ancaloit 1.2.4 Triterpenoid 1.2.5 Coumarin 1.3 Công dụng Xáo Tam Phàn 1.4 Các nghiên cứu nước 1.4.1 Các nghiên cứu nước 1.4.2 Nghiên cứu nước 1.5 Các phương pháp nuôi cầy tế bào 10 1.5.1 Nuôi cấy mô sẹo 10 iv 1.5.1.1 Khái niệm mô sẹo 10 1.5.1.2 Các loại mô sẹo 10 1.5.1.3 Sự hình thành mơ sẹo 11 1.5.1.4 Phương pháp 12 1.5.1.5 Các yếu tố ảnh hường tới trinh phát sinh mó sẹo 12 1.5.1.6 Các giai đoạn phát triển mô sẹo 13 1.5.1.7 ứng dụng nuôi cấy mô sẹo 14 1.6 Các thành phần trong trinh nuôi cấy tế bào 14 1.6.1 Các chất khoáng 14 1.6.2 Vitamin 15 1.6.3 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật 16 1.6.4 Auxin 17 1.6.5 Cytokinin 18 1.6.6 Tương tác nhóm cytokinin auxin 19 1.6.7 Các chất bổ ượ 19 Chuông 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Thời gian, địa điểm vật liệu nghiên cứu 21 2.2 Điều kiện nuôi cay 21 2.2.1 Môi trường nuôi cấy 21 2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 21 2.3 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 22 2.3.1 Hóa chất 22 2.3.2 Thiết bị dụng cụ 22 2.4 Thiết ké thí nghiệm 23 2.5 Nội dung phương pháp nghiên cứu 24 2.5.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 24 2.5.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.5.2.1 Thí nghiêm 1: Khào sát nồng độ javel thời gian khử trùng ảnh hưởng đến khả tạo mẫu cấy vô trùng cùa Xáo Tam Phân 25 2.5.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ành hưởng chất điều hòa sinh trường 2,4-D đến khà tạo mô sẹo Xáo Tam Phân 25 V 2.5.23 Thí nghiệm 3: Kháơ sát ánh hường chất điều hòa sinh trưởng NAA đến khả tạo mô sẹo Xáo Tam Phấn 26 2.5.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát anh hương phối hợp chất điều hịa sinh trường thuộc nhóm auxin cytokinin đến trinh táng sinh mó sẹo Xáo Tam Phân 27 2.5.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hường cùa chắt bổ trợ đến trình tăng sinh mô 27 sẹo Xáo Tam Phân 2.6 Phương pháp thu thập số liệu xứ lý số liệu 28 2.6.1 Phương pháp thu thập số liệu 28 2.6.2 Xử lý số liệu 28 Chuông 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ iavel thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu cấy Xáo Tam Phân (Paramignỵa trimera) 29 3.2 Kết thí nghiệm 2: Khảo sát ành hường chất ĐHST 2,4-D đến khà tạo mô sẹo Xáo Tam Phân 32 3.3 Kết thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng chất ĐHST NAA đen khả tạo mô sẹo Xáo Tam Phân 34 3.4 Kết thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng phối hợp chất điều hòa sinh trường thuộc nhóm auxin cytokinin đến q trình tãng sinh mô sẹo Xáo Tam Phân 36 3.5 Kết thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng chất bồ ượ đến q trình tăng sinh mơ sẹo Xáo Tam Phân 38 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT A/C Auxin/cytokinin BA 6-Benz/oadeninopuryna BI Vitamin B1 < thiamin) CNSH Cóng nghệ sinh học Ctv Cộng tác viên DNA Deoxyhbo Nucleic Acid ĐHST Đièu hỏa sinh trường ĐC Đỏi chứng EDTA Ethyleneciaminetetraacetic Acid HPLC High Performance Liquid Chromatography IAA Indol acetic acid IBA Indol butyric acid MS Mueadhige & Skoog medium, năm 1962 NAA a-Naphthalenacetic acid Tp.HCM Thành phố Hồ Chi Minh 2,4-D Dichloro phenoxy acetic acid vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bàng Bảng 2.1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ javel thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu cấy Xáo Tam Phản 25 Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hỏa sinh trường 2,4-D đến khả tạo mô sẹo Xáo Tam Phân 26 Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hỏa sinh trưởng NAA đến khả tạo mô sẹo Xáo Tam Phân 26 Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng phối hợp chắt điểu hịa sinh trưởng nhóm auxin cytokinin đến trình tăng sinh khối mỏ sẹo Xáo Tam Phân 27 Bảng 2.5: Khảo sát ảnh hưởng chất bõ ượ đến trình tăng sinh mơ sẹo Xáo Tam Phân 28 Bảng 3.1: Ket ảnh hường nồng độ javel thời gian khừ trùng đến khả nãng tạo mẫu cấy vô trùng Xáo Tam Phân 30 Bảng 3.2: Kết quà ảnh hưởng chất điều hòa sinh trường 2.4-D đến khả tạo sẹo Xáo Tam Phân 32 Bảng 3.3: Kết ảnh hường chất điều hòa sinh trưởng NAA đến khả tạo mô sẹo Xáo Tam Phân .34 Bảng 3.4: Kết ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với BA đến q trình tăng sinh mơ sẹo Xáo Tam Phân 37 Bảng 3.5: Kết ảnh hưởng chất bổ ượ đến trình tăng sinh mô sẹo Xáo Tam Phân 39 ix MỞ ĐẤU Đặt vấn đề Việt Nam nay, tình hình bệnh ưng thư gia tăng đột biến Cứ năm, sô bệnh nhân ung thư mắc 150.000 người vã có 75.000 người từ vong Các bệnh ung thư phô biên nam giới sô ung thư phổi ung thư gan, ung thư đại tràng Còn nữ giới đứng hàng đâu ung thư vú, ung thư dày ung thư cổ tử cung (Trân Văn Thuân, 2016) Mặc dù có nhiêu biện pháp để chữa trị bệnh nan y Tuy nhiên, giới nói chung Việt Nam nói riêng, phương pháp chữa trị cịn có nhiều hạn chế Chính vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm phương thuốc mối quan tâm hàng đầu nhà khoa học khắp nơi ơên giới Được biết loại thảo dược “Xáo Tam Phân" Tình Khánh Hòa, Việt Nam đề cập đến thần dược cho chứng bệnh ung thư Theo phàn tích Bộ y tế tỉnh Khánh Hòa (2012), thành phần Xáo Tam Phàn bao gồm nhiều hoạt chất có tác dụng ức chế, tiêu diệt tế bào ung thư, đặc biệt dòng ung thư: ung thư gan (Hep-G2), ung thư đại tràng (HTC116), ung thư vú (MDA MB231) ung thư buồng trứng (OVCAR-8) ung thư cổ tử cung Hela (mạnh với ung thư gan Hep-G2 ung thư cổ tử cung) Với khả đặc biệt hợp chất đáng giá có Xáo Tam Phân mệnh danh “thần dược" Việc đáng quan tâm việc thu hoạch vỏ, lá, rễ Xáo Tam Phân để tách chiết làm chết cày làm nguồn dược liệu tự nhiên thời gian vừa qua, Xáo Tam Phân (Paramignya trimerà) bị khai thác mức đứng tnrớc nguy tuyệt chủng Vì vậy, việc nghiên cứu hợp chầt cỏ ưong giống cày quan tâm thúc đẩy mạnh mẽ để người dân hiểu tầm quan trọng để người dân biết bảo tồn nguồn dược liệu quỵ hiểm tránh việc khai thác q mức Cơng nghệ ni cấy mị thực vật đời, nhăm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ thị trường Kỳ thuật nuôi cầy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm cài thiện hợp chất có giá trị y dược mà sản xuất chúng từ tế bào vi sinh vật Báng 3.5: Kếl quà ánh hướng cua chất bổ trợ đến trình tăng sinh khối mỏ sẹo Xáo Tam Phán Nghiệm Nồng độ chất Khói lượng Khối lượng thức bổ trọ- tươi (g) khô (g) 5.1 Nước dừa 10% 629* 0,65’ 5.2 Vitamin BI 10mg/l 5.3 Glycine 10 mg/1 cv (%) 0,52b 025c 0,10c 5.02 1,86 Các ký’ tự theo sau giá trị trung bình ci -g cột thê khác biệt nghiệm thức với mức ý nghĩa p F Model 0.27548380 0.06887095 Error 10 0.00244887 0.00024489 Corrected Total 14 0.27793267 F T F Model 65.12758873 32.56379436 Error 0.24674765 0.04112461 Corrected Total 65.37433638 F T