Nghiên cứu quá trình ly tinh dầu húng quế (OCIMUM BASILICUML ), phân tích thành phần hóa học, khảo sát hoạt tình kháng vi sinh vật và ứng dụng trong mỹ phẩm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU HÚNG QUẾ (OCIMUM BASILICUM L ), PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM Ngành Công nghệ sinh học GVHD TS Trịnh Thị Lan Anh SVTH Phan Thị Khánh My MSSV 1611100372 Lớp 16DSHA1 TP Hồ Chí Minh, 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn bộ Quý Thầy Cô Ban Lãnh Đạo, các phòng ban đã tạo cũ.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU Q TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU HÚNG QUẾ (OCIMUM BASILICUM L.), PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM Ngành: Công nghệ sinh học GVHD: TS Trịnh Thị Lan Anh SVTH: Phan Thị Khánh My MSSV: 1611100372 Lớp: 16DSHA1 TP Hồ Chí Minh, 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tồn Q Thầy Cơ Ban Lãnh Đạo, phịng ban tạo Q Thầy Cơ Viện Khoa học Ứng dụng, Trường Đại học Công nghệ Tp HCM truyền đạt cho em kiến thức quý báu, giúp em có sở lý thuyết vững vàng tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập tạo điều kiện cho em có hội học tập làm việc trang bị cho em kỹ giúp em áp dụng kiến thức mà Thầy Cô giảng dạy suốt khoảng thời gian vừa qua Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên hướng dẫn TS Trịnh Thị Lan Anh, người tận tình hướng dẫn, truyền đạt thêm kiến thức chuyên môn tạo điều kiện giúp đỡ, hỗ trợ em tìm hiểu thực tiễn suốt q trình thực đồ án phịng thí nghiệm để hồn thành đồ án tốt nghiệp cách tốt Trong trình thực đồ án tốt nghiệp, trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn em mặt hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót sai sót q trình nghiên cứu Em mong nhận ý kiến đóng góp từ phía Thầy Cô để em học thêm nhiều kinh nghiệm mong Thầy Cô bỏ qua giúp em hoàn thiện tốt Qua đề tài tốt nghiệp em nhận nhiều điều mẻ bổ ích để giúp ích cho công việc sau thân Cuối cùng, em xin kính chúc Ban Giám hiệu với Quý Thầy Cô khỏe mạnh, vui vẻ thành công nghiệp trồng người cao TP Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng năm 2020 Sinh viên thực Phan Thị Khánh My MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ TINH DẦU 1.1.1 Khái niệm tinh dầu 1.1.2 Vai trò sinh học tinh dầu 1.1.3 Phân bố tinh dầu tự nhiên 1.1.4 Quá trình tích lũy tinh dầu 1.1.5 Tính chất vật lý tinh dầu Húng quế 1.1.6 Tính chất hóa học tinh dầu Húng Quế 1.1.7 Ảnh hưởng nhân tố khác đến thành phần tính chất tinh dầu Húng quế 11 1.1.8 Ứng dụng tinh dầu Húng Quế ngành công nghiệp 12 1.1.9 Nguyên tắc sản xuất tinh dầu 13 1.1.10 Nguyên tắc trính ly tinh dầu 14 1.1.11 Các phương pháp trích ly tinh dầu 14 1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY HÚNG QUẾ 19 1.2.1 Vị trí phân loại 19 1.2.2 Khái quát họ Hoa môi (Lamiaceae) 20 1.2.3 Sơ lược chi Húng quế hay chi É (Ocimum) 20 1.2.4 Nguồn gốc phân bố 21 1.2.5 Đặc điểm 21 1.2.6 Thành phần hóa học 22 1.2.7 Tác dụng dược lý 23 1.3 GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC 24 1.3.1 Nguyên lý hoạt động phương pháp chưng cất lôi nước 24 1.3.2 Chưng cất lôi nước trực tiếp 25 iv 1.3.3 Chưng cất lôi nước gián tiếp 25 1.4 GIỚI THIỆU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC HỢP CHẤT CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT 25 1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 25 1.4.2 Các chế kháng khuẩn 26 1.4.3 Một số nhóm hợp chất thực vật 27 1.4.3.1 Nhóm hợp chất alkaloid 27 1.4.3.2 Nhóm hợp chất glycoside 28 1.4.3.3 Nhóm tinh dầu 30 1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ CÁC TÁC DỤNG KHÁC NHAU CỦA HÚNG QUẾ NGOÀI KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN 31 1.5.1 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa 31 1.5.2 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm 32 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA HÚNG QUẾ Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 32 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 32 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 33 1.7 GIỚI THIỆU VỀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN GÂY BỆNH 34 1.7.1 Escherichia coli 34 1.7.2 Staphylococcus aureus 35 1.7.3 Aspergillus Flavus 36 1.8 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT 37 1.8.1 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán 37 1.8.2 Phương pháp đục lỗ 38 1.8.3 Phương pháp pha loãng 38 1.9 SẮC KÝ GHÉP KHỐI PHỔ VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG (GC–MS/ GAS CHROMATOGRAPHY MASS SPECTOMETRY) 39 1.9.1 Sắc ký khí (GC – Gas chromatography) 39 1.9.2 Sắc ký khối phổ (MS – Mass Spectometry) 41 1.9.3 Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 42 v 1.9.4 Một số ứng dụng sắc ký khí ghép khối phổ 43 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 44 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 44 2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài 44 2.1.2 Thời gian thực 44 2.2 VẬT LIỆU 44 2.2.1 Nguyên liệu 44 2.2.2 Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất 45 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.3.1 Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm vời nội dung 47 2.3.2 Tiến hành trích ly tinh dầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng 48 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng cúa yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Húng Quế thu phương pháp chưng cất lôi nước 52 2.3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 52 2.3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng phận nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 53 2.3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thể tích nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 54 2.3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl bổ sung vào nguyên liệu ngâm ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 55 2.3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu NaCl trước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 56 2.3.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ngâm mẫu muối NaCl trước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 56 2.3.3.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 57 2.3.3.8 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng thời gian để héo đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 58 2.3.4 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Húng quế 59 2.3.4.1 Xác định số vật lý 60 vi 2.3.4.2 Xác định số hóa học 61 2.3.4.3 Xác định thành phần hóa học tinh dầu 63 2.3.5 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng vi sinh vật 64 2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 66 2.3.7 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 67 2.3.8 Phương pháp tính tốn 67 2.4 THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 67 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH DẦU TRONG QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÔI CUỐN HƠI NƯỚC 68 3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 68 3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng phận nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 70 3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thể tích nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 71 3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu ngâm đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 73 3.1.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu nước muối NaCl trước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 75 3.1.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng nhiệt độ ngâm mẫu muối NaCl trước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 76 3.1.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 78 3.1.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng thời gian để héo đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 80 3.2 XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ HÓA LÝ CỦA TINH DẦU HÚNG QUẾ 82 3.2.1 Đánh giá cảm quan 82 3.2.2 Xác định định lượng tinh dầu Húng quế 83 3.2.3 Xác định tỷ trọng tinh dầu Húng quế 83 vii 3.2.4 Xác định số hóa học tinh dầu Húng quế 84 3.2.5 Xác định độ hòa tan tinh dầu Húng quế ethanol 85 3.2.6 Xác định thành phần hóa học tinh dầu Húng quế 86 3.3 KẾT QUẢ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA TINH DẦU HÚNG QUẾ 88 3.3.1 Kết hoạt tính kháng E coli tinh dầu Húng quế 88 3.3.2 Kết hoạt tính kháng S aureus tinh dầu Húng quế 90 3.3.3 Kết hoạt tính kháng A flavus tinh dầu Húng quế 92 3.4 THỬ NGHIỆM BỔ SUNG TINH DẦU HÚNG QUẾ VÀO TRONG GEL TRỊ MỤN 93 3.4.1 Khảo sát tỷ lệ tinh dầu Húng quế bổ sung vào gel trị mụn 94 3.4.2 Kết kiểm nghiệm an toàn mỹ phẩm 95 3.5 THẢO LUẬN 96 3.5.1 Hiệu suất trích ly tinh dầu Húng quế 96 3.5.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Húng quế 96 3.5.3 Ứng dụng tinh dầu Húng quế mỹ phẩm 97 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 98 4.1 KẾT LUẬN 98 4.2 KIẾN NGHỊ 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 PHỤ LỤC 102 Phụ lục 1: Thành phần môi trường cách pha số dung dịch thử 102 Phụ lục 2: Xử lý thống kê ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Húng quế thu phương pháp chưng cất lôi nước 102 Phụ lục 3: Xử lý thống kê khả kháng vi sinh vật tinh dầu Húng quế thu phương pháp chưng cất lôi nước 113 Phụ lục 4: Kết xác định thành phần hóa học hàm lượng tương đối hợp chất mẫu tinh dầu Húng quế phương pháp GC/MS 118 Phụ lục 5: Kết kiểm nghiệm yêu cầu an toàn mỹ phẩm gel trị mụn bổ sung tinh dầu Húng quế 120 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A flavus : Aspergillus falvus A niger : Aspergillus niger A parasiticus : Aspergillus parasiticus B cereus : Bacillus cereus DĐVN : Dược điển Việt Nam DMSO : Dimethyl sulfoxyde DNA : Deoxyribonucleic acid DPPH : 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl ĐC : Đối chứng E coli : Escherichia coli FTC : Ferric thiocyanate GC : Gas chromatography MS : Mass spectrometry P aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa S aureus : Staphylococcus aureus S.cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae S enteritidi : Salmonella enteritidi S faecalis : Streptococcus faecalis S typhymumrium : Salmonella typhymumrium SAS : Statistical Analysis Systems TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TCVS : Tiêu chuẩn vi sinh ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc 3D phân tử linalool 10 Hình 1.2 Cấu trúc 3D phân tử estragole 10 Hình 1.3 Cấu trúc 3D phân tử eucalyptol 11 Hình 1.4 Hệ thống chưng cất lơi nước 14 Hình 1.5 Hệ thống chưng cất nước hỗ trợ vi sóng 17 Hình 1.6 Máy ép tinh dầu 18 Hình 1.7 Cây Húng Quế (Ocimum Basilicum L.) 19 Hình 1.8 Một số thuộc chi Húng quế 21 Hình 1.9 Cấu trúc hóa học 23 Hình 1.10 Hệ thống chưng cất lôi nước nguyên lý hoạt động 24 Hình 1.11 Những vị trí vi khuẩn bị tác động hợp chất thực vật 26 Hình 1.12 Cấu trúc morphine 27 Hình 1.13 Cấu trúc quinine 28 Hình 1.14 Sơ đồ phân loại Saponin 29 Hình 1.15 Vi khuẩn Escherichia Coli 34 Hình 1.16 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 35 Hình 1.17 Nấm mốc Aspergillus flavus 36 Hình 1.18 Sắc ký đồ sắc ký khí 40 Hình 1.19 Mơ hình khối phổ 42 Hình 1.20 Mass – Spectrum 42 Hình 2.1 Cây Húng quế (Ocimum basilicum L.) để thu nhận tinh dầu 44 Hình 2.2 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Húng quế phương pháp chưng cất lôi nước 47 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chưng cất thu nhận tinh dầu Húng quế 48 Hình 2.4 Nguyên liệu Húng quế để thu nhận tinh dầu 49 Hình 2.5 Cây Húng quế sau chuẩn bị chuyển vào bình cầu 50 Hình 2.6 Tinh dầu Húng quế nước tách thành pha 50 Hình 2.7 Bộ dụng cụ chưng cất tinh dầu nhẹ nước Clevenger 51 Hình 2.8 Kích thước nguyên liệu Húng quế 53 Hình 2.9 Bộ phận nguyên liệu Húng quế 54 x Hình 2.10 Nguyên liệu Húng quế để héo 59 Hình 2.11 Sơ đồ quy trình đánh giá hoạt lực kháng vi sinh vật tinh dầu Húng quế thu phương pháp chưng cất lôi nước 64 Hình 2.12 Mơ tả kết vịng kháng vi sinh vật (Hudzicki,2009) 67 Hình 3.1 Đồ thị thể ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 69 Hình 3.2 Đồ thị biểu ảnh hưởng phận nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 70 Hình 3.3 Đồ thị thể ảnh hưởng thể tích nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 72 Hình 3.4 Đồ thị thể ảnh hưởng nồng NaCl bổ sung vào nguyên liệu ngâm đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 74 Hình 3.5 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu nước muối NaCl trước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 76 Hình 3.6 Đồ thị biểu ảnh hưởng nhiệt độ ngâm mẫu muối NaCl trước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 77 Hình 3.7 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 79 Hình 3.8 Đồ thị biểu ảnh hưởng thời gian héo đến hàm lượng tinh dầu Húng quế 81 Hình 3.9 Tinh dầu Húng quế thu 82 Hình 3.10 Sắc ký đồ tinh dầu Húng quế 87 Hình 3.11 Vịng kháng khuẩn E Coli 89 Hình 3.12 Vịng kháng khuẩn S Aureus 90 Hình 3.13 Vòng kháng nấm A Flavus 92 Hình 3.14 Kết sử dụng gel trị mụn bổ sung tinh dầu Húng quế 95 xi Class Level Information Class T Levels Values D1 D2 D3 D4 Number of Observations Read Number of Observations Used NONG DO NaCl 12 12 11:00 Monday, February 10, 2014 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Sum of Squares Model 0.32269167 0.10756389 Error 0.02020000 0.00252500 Corrected Total 11 0.34289167 R-Square 0.941089 Coeff Var 7.800680 Source DF T Mean Square F Value Pr > F Root MSE 0.050249 Anova SS 42.60 F 0.32269167 0.10756389 NONG DO NaCl 42.60 F Root MSE 0.054160 Anova SS 25.28 0.0002 N Mean 0.594167 Mean Square F Value Pr > F 0.22242500 0.07414167 108 25.28 0.0002 THOI GIAN NGAM MAU 11:00 Monday, February 10, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.05 0.002933 2.30600 0.102 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 0.82333 E2 B B B B B 0.55333 E3 0.53333 E4 0.46667 E1 Xử lý ảnh hưởng nhiệt độ ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu Húng quế thu phương pháp chưng cất lôi nước NHIET DO NGAM MAU 11:00 Monday, February 10, 2014 The ANOVA Procedure Class Level Information Class T Levels Values F1 F2 F3 F4 F5 Number of Observations Read Number of Observations Used 15 15 NHIET DO NGAM MAU 11:00 Monday, February 10, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N 109 Source DF Sum of Squares Model 0.33197333 0.08299333 Error 10 0.02720000 0.00272000 Corrected Total 14 0.35917333 30.51 F DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 0.33197333 0.08299333 30.51 F 43.58 F 0.52649333 0.13162333 THOI GIAN CHUNG CAT 43.58 F Model 1.49209167 0.49736389 Error 0.01133333 0.00141667 Corrected Total 11 1.50342500 351.08 F 1.49209167 0.49736389 THOI GIAN DE HEO 351.08 F Root MSE N Mean 1.000000 Source DF Anova SS T 217.7333333 54.43 F 54.4333333 E COLI 54.43 F 58.6666667 S AUREUS 62.86 F 83.5666667 0.7333333 116 113.95 F 334.2666667 83.5666667 A FLAVUS 113.95