Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật của niêm khuẩn.pdf

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2021 Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật niêm khuẩn Số hợp đồng: 2021.01.49 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngọc Yến Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: 01-09/2021 TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 11 năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc - Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2021 Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật niêm khuẩn Số hợp đồng: 2021.01.49 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngọc Yến Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: 01-09/2021 Các thành viên phối hợp cộng tác: STT Họ tên Võ Thị Nhàn Chuyên ngành Dược Cơ quan công tác Khoa Dược – ĐH Nguyễn Tất Thành Ký tên MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ NIÊM KHUẨN 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại niêm khuẩn 1.1.3 Môi trường sống niêm khuẩn 1.1.4 Đặc điểm đặc trưng 1.1.5 Khả sản xuất chất chuyển hóa có hoạt tính 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP đánh giá HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT 10 1.2.1 Phương pháp khuếch tán 10 1.2.2 Phương pháp pha loãng 10 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 12 1.3.1 Trên giới 12 1.3.2 Nghiên cứu Việt Nam 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.1.1 Chủng niêm khuẩn thử nghiệm 16 2.1.2 Dụng cụ - thiết bị 16 2.1.3 Môi trường nuôi cấy – thử nghiệm hoạt tính 17 2.1.4 Chủng vi sinh vật thử nghiệm 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Lên men thu cao chiết tổng 19 i 2.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu phương pháp vi pha loãng 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 LÊN MEN THU CAO CHIẾT TỔNG 23 3.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI PHA LOÃNG 24 3.2.1 Đánh giá hoạt tính chủng vi sinh vật thử nghiệm 24 3.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật theo chi niêm khuẩn 27 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 4.1 KẾT LUẬN 32 4.2 KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 1: MINH CHỨNG ĐI KÈM 37 PHỤ LỤC 2: (thuyết minh đề cương) 47 ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt An Tiếng Anh/ Tên khoa học/ Danh pháp Aspergillus niger Tiếng Việt ATCC American Type Culture Collection Bộ sưu tập giống chuẩn Mỹ Ca Candida albicans Candida albicans CFU Colony-forming unit Khuẩn lạc DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid Ec E coli GC Growth control Chứng dương MHB Muller-Hinton broth Môi trường lỏng Muller-Hinton MHB+2% Muller-Hinton broth + 2% Môi trường lỏng Muller-Hinton bổ glucose glucose sung 2% glucose MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MR, Methicillin resistant Staphylococcus aureus kháng MRSA Staphylococcus aureus methicillin MS, MSSA Methicillin susceptible Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus nhạy methicillin Mu Mucor sp Mucor sp Pa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PDA Potato dextrose agar Thạch khoai tây Pe Penicillium sp Penicillium sp Rh Rhizopus sp Rhizopus sp SC Sterility control Chứng âm Sf Streptococcus faecalis Streptococcus faecalis TSA Tryptic soy agar Môi trường TSA iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng niêm khuẩn phân lập định danh 16 Bảng 2.2 Hóa chất, mơi trường sử dụng đề tài 17 Bảng 2.3 Chủng vi sinh vật thử nghiệm 17 Bảng 2.4 Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật thử nghiệm phương pháp vi pha loãng 20 Bảng 3.1 Hiệu suất cao chiết chủng niêm khuẩn 23 Bảng 3.2 Kết xác định giá trị MIC dịch chiết 24 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật cao chiết niêm khuẩn 26 Bảng 3.4 Dữ liệu định danh chủng niêm khuẩn [2] 27 Bảng 3.5 Các chủng niêm khuẩn có giá trị MIC thấp 29 Bảng 3.6 Kết thử nghiệm MIC 30 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sự phát triển niêm khuẩn Hình 1.2 Tỷ lệ phân bố họ niêm khuẩn khác Hình 1.3 Phân loại học niêm khuẩn Hình 1.4 Thể Myxobacteria [3] Hình 1.5 Hành vi săn mồi Myxococcus xanthus [22] Hình 1.6 Hợp chất kháng nấm từ niêm khuẩn Hình 1.7 Epothilone B từ Sorangium cellulosum [34] Hình 1.8 Các hợp chất kháng khuẩn từ niêm khuẩn Hình 1.9 Thử nghiệm MIC đĩa 96 giếng với kháng sinh khác 12 Hình 1.10 Các tế bào sống khử resazurin (màu tím) thành resorufin (màu hồng) 12 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 18 Hình 2.2 Tấm microtiter 96 giếng 21 Hình 3.1 So sánh tỉ lệ (%) chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật chi Myxococcus Corallococcus 28 v TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU STT Công việc thực Kết đạt Nội dung 1: Lên men thu cao chiết Từ 43 chủng niêm khuẩn phân phân cực chủng niêm khuẩn lập định danh từ kết nghiên cứu trước nhóm tác giả, sau thực q trình ni cấy, chiết thu cao chiết tổng đánh giá hiệu suất chiết Nội dung 2: Xác định nồng độ ức Kết giá trị MIC chủng chế tối thiểu 10 chủng vi sinh khảo sát, có phân tích, so vật thử nghiệm sánh đánh giá hoạt tính theo liệu định danh cơng bố trước Xác định nồng độ ức chế tối thiểu 38/43 chủng niêm khuẩn phân lập định danh 10 chủng vi sinh vật thử nghiệm bao gồm vi khuẩn (MRSA, MSSA, S faecalis, E coli P aeruginosa), vi nấm (nấm men C albicans, nấm mốc Mucor sp., Rhizopus sp., Penicillium sp A niger) Có 34/38 (89,47%) cao chiết tồn phần mơi trường VY/3 thể hoạt tính kháng vi sinh vật thử nghiệm Khả ức chế chủng vi sinh vật thử nghiệm phù hợp với cơng bố quốc tế trước đây, cao chiết niêm khuẩn có hoạt tính kháng nấm tốt kháng khuẩn kháng vi khuẩn Gram dương tốt Gram âm Xác định chủng có hoạt tính cao chủng BĐ2.2 CT2.1 có hoạt tính vi ức chế đáng kể chủng vi khuẩn Gram dương vi nấm thử nghiệm, chủng định danh sơ thuộc chi Myxococcus sp Đối chiếu liệu định danh kết xác định MIC cho thấy loài thuộc chi Myxococcus sp Corallococcus sp phân bố rộng rãi tự nhiên, cịn sở hữu đặc tính kháng vi sinh vật ấn tượng, đó, hoạt tính từ cao chiết chủng Myxococcus sp nhìn chung tốt Corallococcus sp Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh Kết giá trị MIC chủng khảo Kết giá trị MIC chủng sát có đối chiếu, bàn luận dựa khảo sát kết phân lập định danh chủng công bố trước nhóm tác giả 01 báo nộp Tạp chí Khoa học cơng 01 báo đáp ứng u cầu cơng trình khoa học nghệ Đại học Nguyễn Tất Thành vii Tổng quan ĐẶT VẤN ĐỀ Niêm khuẩn trực khuẩn Gram âm thuộc Myxococcales, phân bố phổ biến chất tự nhiên đất, nước, gỗ, vỏ mục nát, phân động vật ăn cỏ hoang dã Niêm khuẩn có khả sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp có nhiều hoạt tính sinh học kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sốt rét, ức chế miễn dịch kháng virus với chế tác động độc nhất, riêng biệt cho Myxococcales Các chất chuyển hóa từ niêm khuẩn thể nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, chủ yếu kháng nấm, kháng khuẩn, phản ánh tính cạnh tranh chúng môi trường sống tự nhiên Hầu hết hợp chất kháng nấm phân lập leupyrrin A, ambruticin, jerangolid, soraphen A hay stigmatellin A Ngoài ra, corallopyronin A, sorangiacin A, myxovirescin, thuggacin A biết đến với khả kháng khuẩn theo nhiều chế khác Các chất chuyển hóa thứ cấp từ niêm khuẩn có cấu trúc đa dạng như: macrolid, polyen, α-pyron, isoquinolein, đó, khoảng 40% hoạt chất sở hữu cấu trúc mới, có tiềm nghiên cứu phát triển thuốc Các nghiên cứu niêm khuẩn Việt Nam chưa khai thác nhiều, hướng nghiên cứu phân lập sàng lọc chủng niêm khuẩn định hướng phân tích chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học lại chưa tiến hành Với đặc điểm đa dạng địa hình (núi, biển, đồng bằng…) điều kiện khí hậu nóng ẩm quanh năm, Việt Nam sở hữu nguồn niêm khuẩn tự nhiên vô đa dạng đầy tiềm Do đó, năm 2020-2021, nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành phân lập định danh sơ 43 chủng niêm khuẩn có nguồn gốc từ đất thu thập nước Trong nghiên cứu này, tiếp tục sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật cao chiết từ niêm khuẩn, làm để tuyển chọn chủng tiềm Tiếp theo, phương pháp vi pha loãng đĩa 96 giếng sử dụng để xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết chủng Dữ liệu thu mở hướng nghiên cứu sâu chất chuyển hóa thứ cấp từ cao chiết có hoạt tính mạnh từ dịch ni cấy tế bào Do đó, đề tài thực nhằm đạt mục tiêu sau: - Thực lên men chủng myxobacteria thu cao chiết - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết chủng vi khuẩn ATCC chủng vi nấm phương pháp vi pha loãng đĩa 96 giếng ... thể hoạt tính kháng vi sinh vật thử nghiệm Khả ức chế chủng vi sinh vật thử nghiệm phù hợp với công bố quốc tế trước đây, cao chiết niêm khuẩn có hoạt tính kháng nấm tốt kháng khuẩn kháng vi khuẩn... PHÁP VI PHA LOÃNG 24 3.2.1 Đánh giá hoạt tính chủng vi sinh vật thử nghiệm 24 3.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật theo chi niêm khuẩn 27 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... nhóm nghiên cứu tiến hành phân lập định danh sơ 43 chủng niêm khuẩn có nguồn gốc từ đất thu thập nước Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiếp tục sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật cao chiết từ niêm