Nghiên cứu hoạt tính kháng vibrio alginolyticus của một số streptomyces nội sinh phân lập từ cây sâm đất (Talinum paniculatum).pdf

ịl II Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG O NGUYEN TAT THANH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG Vibrio aỉginoỉyticus CỦA MỘT SỐ Streptomyces NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY SÂM ĐẤT (Talinum Paniculatum) Sinh viên thực hiện: Ngô Thị Đào Diễm Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học TP.HCM, tháng năm 2018 Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG Vibrio aỉginolyticus CỦA MỘT SỐ Streptomyces NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY SÂM ĐẤT (Talinum Paniculatum) Sinh viên thực hiện: Ngô Thị Đào Diễm Mã số sinh viên: 1411535168 Lớp: 14DSH02 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyền Hoàng Chương TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Ts Nguyễn Hoàng Chương, người dìu dắt, truyền cho em cảm hứng dam mê với công việc nghiên cứu, giúp đờ em trình học tập thực đề tài Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học, đặc biệt cô chủ nhiệm lớp 14DSH02, Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành tận tình, ân cần truyền đạt kiến thức năm qua Với von kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang q báu đế em bước vào đời cách vừng tự tin Cảm ơn bạn bè bạn, Anh/Chị phịng thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Sinh học nhiệt tình giúp đờ, động viên tơi lúc khó khăn thời gian thực đề tài Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cha Mẹ, người đà nuôi dường, yêu thương, chăm sóc, động viên tạo điều kiện tốt để thực ước mơ Tơi xin chân thành cảm ơn! Ngơ Thị Đào Diễm Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nguyễn Tất Thành 11 MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Tóm tắt vii Summary viii Danh mục hình X Danh mục bảng xi ĐẶT VÁN ĐỀ .1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu CHƯƠNG TÓNG QUAN 1.1 Tông quan vê xạ khuân 1.1.1 Sơ lược vê xạ khuân 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.2.1 Khuẩn lạc 1.1.2.2 Khuẩn ty 1.1.2.3 Bào tử 1.1.3 Phân loại 1.2 Xạ khuấn nội cộng sinh thực vật dượcliệu 1.2.1 Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh 1.2.2 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội cộngsinh 1.2.3 ứng dụng xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật iii 1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuấn nội cộng sinh 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 10 1.4 Cây Sâm Đất 11 1.5 Sơ lược Vibrio alginolytỉcus 12 1.5.1 Đặc điêm phân loại hình thái 12 1.5.1.1 Hệ thống phân loại 12 1.5.1.2 Hình thái 12 1.5.2 Đặc tính phân bố nuôi cấy 13 1.6 Khả sinh chất chuyển hóa thứ cấp xạ khuấn nội cộng sinh dược liệu 13 1.7 Ket khai thác liệu 14 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 20 2.1 Thời gian địa điếm nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu 20 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.3.2 Phần mềm trang websử dụng 20 2.3.3 Dụng cụ thiết bị 20 2.3.4 Hóa chất 21 2.3.4.1 Kháng sinh 21 2.3.4.2 Hóa chất khử trùng bề mặt thực vật 21 2.3.4.3 Hóa chất cho phản ứng PCR 21 IV 2.3.4.4 Hóa chất điện di 21 2.3.5 Môi trường 22 2.3.6 Vi sinh vật kiểm định 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Tiến trình nghiên cứu 23 2.4.2 Khai thác dừ liệu 24 2.4.3 Phân lập xạ khuẩn sống nội cộng sinh 24 2.4.4 Bảo quản chủng xạ khuân 25 2.4.5 Sàng lọc xạ khuẩn sinh chất khángkhuẩn phương pháp đìa thạch răn 25 2.4.6 Định danh chủng xạ khuấn tiềm phương pháp sinh học phân tử 25 2.4.6.1 Tách chiết DNA 25 2.4.Ó.2 Thiết lập phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA 26 2.4.6.3 Hiệu chỉnh sau giải trình tự 27 2.4.6.4 Xây dựng phát sinh chủng loại 27 2.4.7 Nghiên cứu đặc điếm sinh kháng sinh 28 2.4.7.1 Khảo sát phổ kháng khuẩn 28 2.4.7.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh kháng 28 2.4.7.3 Khảo sát thời gian sinh kháng sinh 28 2.4.7.4 Khảo sát tính bền 28 2.4.7.4.1 Phương pháp khảo sát tính bền với nhiệt độ 28 2.4.7.4.2 Phương pháp khảo sát tính bền với pH 29 2.4.7.4.3 Phương pháp khảo sát tính bền với muối 29 V 2.4.7.4.4 Phương pháp khảo sát tính bền với ánh sáng 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết 31 3.1.1 Ket phân lập xạ khuấn nội cộng sinh từcây Sâm Đất 31 3.1.2 Kết khảo sát khả kháng khuẩn cùa chủngxạ khuẩn với vsv chủ đích Vỉrbio alginolytỉcus 31 3.1.3 Ket định danh xạ khuẩn 32 3.1.3.1 Nhân đoạn 16S rRNA 32 3.1.3.2 Kết hiệu chỉnh trình tự 33 3.1.3.3 Ket xây dựng phát sinh chửng loại 35 3.1.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh kháng sinh 36 3.1.4.1 Khảo sát phổ kháng khuẩn 36 3.1.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh kháng sinh40 3.1.4.3 Khảo sát thời gian sinh kháng sinh 41 3.1.4.4 Khảo sát tính bền 43 3.1.4.4.1 Khảo sát tính bền với nhiệt độ 43 3.1.4.4.2 Khảo sát tính bền với pH 44 3.1.4.4.3 Khảo sát bền muối 45 3.1.4.4.4 Khảo sát bền ánh sáng 46 3.2 Thảo luận 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 VI TĨM TẤT Với hy vọng tìm hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ chủng xạ khuấn phân lập từ Sâm Đất, hợp chất chuyến hóa thứ cấp có khả kháng lại Vibrio aỉginolyticus, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính kháng Vibrio alginolytỉcus ciia số Streptomyces nội sinh phân lập từ Sâm Đất (Talinunt paniculatum)” thực Trung Tâm Nghiên Cứu ứng Dụng Sinh Học từ 1/2018 đến 7/2018 Nội dung đề tài: Phân lập xạ khuẩn sống nội cộng sinh Sâm Đất Sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật cao Định danh chủng xạ khuấn tiềm phương pháp sinh học phân tử Khảo sát phổ kháng khuấn với 18 vi sinh vật kiểm định Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh chất chuyển hóa thứ cấp Khảo sát thời gian bắt đầu sinh hợp chất chuyển hóa thứ cấp Khảo sát tính bền chất chuyển hóa thứ cấp từ xạ khuẩn với nhiệt độ, pH, muối, ánh sáng Ket đạt được: Phân lập chủng xạ khuẩn kí hiệu SS70 Định danh phân từ chùng xạ khuan SS70: SS70 gần giong với chủng xạ khuấn Streptomyces ghanaensis Với vi khuẩn chủ đích v.alginolytỉciis mơi trường giúp tạo vịng kháng khuẩn lớn môi trường sinh kháng sinh M2, M3 M7 Xác định xạ khuẩn bắt đầu sinh chất chuyển hóa thứ cấp mơi trường rắn sau 30 nuôi cấy Xác đinh SS70 hầu hết bền với nhiệt độ, pH, ánh sáng, muối vii SUMMARY With hopes of finding new secondary metabolites from Streptomyces insolated from plants, and this secondary metabolites can against Vibrio alginolyticus we carried out the thesis with the title “Researching on the activity of Streptomyces isolated from Talinum paniculatum againsts Vibrio alginolyticus ” The thesis is carried out at Center for Researching and Applied Biology from 01/2018 to 07/2018 Main contents: Insolating Streptomyces from Talinum paniculatum Screening of microbial strains with high antibacterial activity Identifying of potential pathogen by molecular biology Surveying of antibacterial spectrum with 18 control microorganisms Studying the effects of culture medium on secondary metabolites Surveying the time when secondary metabolites will be created Surveying the quality of the secondary metabolites with the temperature, pH, the salt and the sunlight Results: One Streptomyces was insolated, it is called SS70 SS70 had highest similarities with Streptomyces ghanaensis On culture medium M2, M3, M7, SS70 created the largest antibacterial circle After 30 hours of culture, SS70 started to create secondary metabolites SS70 still remained the quality of the secondary metabolites when was processed with the temperature, pH, the salt and the sunlight viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid rDNA 16S Gen 16S DNA ribosome vsv Vi sinh vật ISP Chương trình Streptomyces Quốc tế TAE Tris- Acetate- EDTA TE Tris- EDTA IX ... kháng sinh từ việc phân lập Streptomyces từ đất biển, thực nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu hoạt tính kháng Vibrio alginolyticus số Streptomyces phân lập từ Sâm Đất (Talinum paniculatum}” Mục đích nghiên. .. CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG Vibrio aỉginolyticus CỦA MỘT SỐ Streptomyces NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY SÂM ĐẤT (Talinum Paniculatum) Sinh viên... Streptomyces nội sinh phân lập từ Sâm Đất (Talinunt paniculatum)” thực Trung Tâm Nghiên Cứu ứng Dụng Sinh Học từ 1/2018 đến 7/2018 Nội dung đề tài: Phân lập xạ khuẩn sống nội cộng sinh Sâm Đất Sàng