VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC oOo KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đề tài TUYÉN CHỌN CHỦNG VI NÁM NỘI SINH PHÂN LẬP TÙ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CU A PHÂN BÓ TẠI ĐÀ LẠT VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG SINH TỐNG H.
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC oOo KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đề tài: TUYÉN CHỌN CHỦNG VI NÁM NỘI SINH PHÂN LẬP TÙ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CU A PHÂN BÓ TẠI ĐÀ LẠT VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG SINH TỐNG HỢP HUPERZIN A Giáo viên hướng dẫn : TS LÊ THỊ MINH THÀNH Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ LAN ANH Lớp : KSCNSH 1301 HÀ NỘI -2017 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHŨ VIÉT TẲT .4 DANH MỤC HÌNH ẢNH LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Mục tiêu đề tài: .9 Nội dung đề tài: CHƯƠNG I : TÓNG QUAN 11 3.1 Tổng quan Thạch tùng cưa (Huperzia serratà) 11 ỉ 1.1 Lịch sử nghiên cứu 11 3.1.2 3.1.3 3.2 Mô tả 12 Phân bổ .12 Tổng quan hoạt chất Huperzinc A .13 3.2.2 Giới thiệu Huperzine A 13 ỉ 2.2 Cơ chế hoạt động Huperzine A .14 3.3 Tổng quan vi nấm nội sinh thực vật 14 1.3 ỉKhái niệm vi nấm nội sinh thực vật 14 1.3.2 Quan hệ vi nấm nội sinh thực vật 15 1.3.3 ủng dụng cùa vi nấm nội sinh 16 1.4 Tình hình nghiên cứu Thạch cưa sinh tong họp Huperzine A nước giói 18 1.4.2 Các nghiên cứu giới 18 1.4.3 Các nghiên cứu nước 20 1.5 Nghiên cứu định danh vi nấm 20 1.5.2 Định danh vi nấm nội sinh theo phương pháp truyền thống 21 1.5.3 Định danh bang phương pháp sinh 1.6 học phân tử 23 Phuong pháp xác định hoạt chất 28 1.6.2 Phương pháp đo quang phố UV- VIS 28 ỉ 6.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) 32 PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 35 2.1 2.2 Thời gian, địa điểm đối tượng nghiên cứu .35 2.1.1 Thời gian địa điêm 35 2.1.2 Đoi tượng nghiên cứu .35 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm 35 2.2.1 Hóa chất: 35 2.2.2 Môi trường nuôi cấy dung dịch 35 2.2.3 ỉ Môi trường phân lập nuôi cay vi nấm nội sinh .35 2.2.2.2 Dung dịch 36 2.2.3 Trang thiết bị thi nghiệm 36 2.3 Phuong pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Phương pháp hoạt hóa thu sinh khối vi nấm 37 2.3.2 Phương pháp tách chiết 37 2.3.3 Phương pháp xác định sinh tông hợp Huperzine A vi nam nội sinh từ Thạch tùng cưa 38 2.3.4 Định danh vi nâm nội sinh hang phương pháp sinh học phân từ 39 2.3.5 Thực phân ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS .40 2.3.6 Định danh nam nội sinh phương pháp truyền thống 42 PHẦN 3: KÉT QUẢ .43 3.1 Kết hoạt hóa nhân ni chủng vi nấm nghiên cứu 43 3.2 Kết xác định khả sinh tổng họp Huperzine A chúng nam nghiên cứu 46 3.2.1 Ket xác định hang phương pháp UV- VIs .46 3.2.2 Kêt xác định hoạt chât Huperzine A dịch chiết nấm hang phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC 52 3.3 Kết định danh chủng vi nấm sinh tổng họp Huperzine A 54 3.3.1 Kết quà định danh theo phương pháp truyền thong 54 3.3.2 Kết định danh chủng nấm nội sinh hang phân tích trình tự vùng rADN - ITS 55 PHẦN 4: KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .59 4.1 Kết luận .59 4.2 Kiến nghị .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Từ viết tắt DANH MỤC CÁC CHỬ VIÉT TẢT Chữ viết đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic B1AST Basic Local Alignment Search Tool AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism dATP Dcoxyadenosinc triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ETS External transcribed spacer HTKL Hình thái khuân lạc ITS Internal transcribed spacer LSU Large subunit NCBI National Center for Biotechnology Informatic PDA Potato Dextrose Agar PCR Polymerase chain reaction rADN Ribosomal acid deoxyribonucleic rARN Ribosomal acid ribonucleic RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism SDS Sodium Dodecyl Sulfate ssu Small subunit DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây Thạch tùng Círa[6] 12 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học cùa Huperzine A 13 Hình 1.3 Một phần thuộc nhóm nấm VAM( Glomus sp), với sợi nấm túi khí rễ [12] 15 Hình 1.4: sơ đồ câu trúc vùng ITS - rADN 26 Hình 3.1: Đặcđiếm hình thái khuấn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL1.45 Hình 3.2: Đặcđiểm hình thái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTK.L2.46 Hình 3.3: Đặcđiểm hình thái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL3.46 Hình 3.4: Hỉnh ảnh số dịch chiết nấm cúa số chúng vi nấm nội sinh từ Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt .47 Hình 3.5: Hình ánh sinh khối (bên trái) dịch chiết (bên phái) thu từ Ml.10 50 Hình 3.6: Hình ảnh phổ khối phố chủng nấm Ml 10(a) chất chuẩn Huperzine A dung môt methanol (b) 51 Hình 3.7: Hình ảnh so sánh khối phổ chủng vi nấm nội sinh Ml 10 mẫu chất chuấn HupA dung môi methanol 51 Hình 3.8: sắc ký đồ HPLV ( uv 210, 230, 310 nm ) chất thị Huperzine A (A) M1.10 (B) 52 Hình 3.9: Khuẩn lạc chúng vi nấm M1.10 54 Hình 3.10.’ Anh vi hình thải chủng nấm nội sinh Ml 10 .54 Hình 3.11: Ket chạy điện di sản pham PCR chúng vi nấm Ml 10 gel agarose (1: Marker, 2: Chủng M1.10) 56 Hình 3.12: Ket giải trình tự gen chúng nam Ml.10 56 DANH MỤC BẢNG Bàng 3.1: Ket hoạt hóa chủng vi nấm nội sinh từ Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt, Việt Nam 43 Báng 3.2: Kết quà đo quang phổ uV - VIS 109 chúng vi nấm nghiên cứu 48 Bàng 3.3: Báng thời gian lưu phân tách peak sắc ký đồ cùa chất chuân Huperzine A (A) chúng vi nâm M1.10 (B) 53 Báng 3.4: Mức độ tưomg đồng gen ITS1 chùng nấm so sánh với trình tự chủng GenBank .57 LỜI CẢM ƠN Kớí lịng biết ơn sâu sắc, xin gùi lời cám ơn tới TS Lê Thị Minh Thành - Phó giám đốc Trung tâm giong bão tồn nguồn gen vi sinh vật Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, người tận tình hướng dẫn, bão, giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn Ths Mần Hồng Phước, KS Hoàng Thị Hồng Anh tập thê cán Trung Tám Giong Bào Tồn Nguồn Gen Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lãm Khoa học Còng nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tơi suốt thời gian thực khóa luận Qua đây, xin gửi lời cảm ơn tới thầy có giáo khoa Cơng nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội dạy do, hướng dan truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, tòi xin gửi lời cảm on đến gia đình, bạn bè nhũng người hên cạnh, động viên, giúp đõ' tơi suốt q trình học tập đê tơi có kết ngày hôm Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Bệnh Alzheimer chứng trí phổ biến Đây loại bệnh gây thối hóa tồn não không the phục hồi Hiện nay, thuốc điều trị bệnh Alzheimer chủ yếu dựa vào ức chế hoạt động cúa enzyme cholinesterase góp phần bồ sung lượng acetylcholine thiếu hụt cho bệnh nhân Tuy nhiên, thuốc gây tác dụng phụ đường tiêu hóa buồn nơn, tiêu chảy, chóng mặt, rối loạn giấc ngú gây ánh hường tới sinh hoạt cùa họ Hupcrzinc A alkaloid thuộc nhóm scrquitcrpcn có thành phần Thạch tùng cưa có khả xuyên qua hàng rào mạch máu não tác động trực tiếp lên não với liều lượng thấp tính bàng microgram Huperzine A có tác dụng ức chế việc sinh acetylcholinesterase - enzyme phá hùy chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholine Khi cnzym bị bất hoạt, nồng độ acetylcholicn não tăng lên, giúp trí nhớ tốt chức nhận thức cải thiện Vì vậy, việc đưa hoạt chat Huperzine A có thạch tùng cưa xem liệu pháp cứu cánh người mắc Alzheimer bệnh sa sút trí tuệ khác Hoạt chất Huperzine A tìm thấy yếu từ thảo dược truyền thống Trung Quốc - Huperzia serrata (Thunb ex Murray) Trev (Thạch tùng cưa) Các nghiên cứu hoạt chất Huperzine A H serrata cách chiết xuất hợp chất làm nguyên liệu sàn xuất thuốc chừa trị bệnh rối loạn trí nhớ thu thành tựu đáng quan tâm Tuy nhiên, với đường hướng chiết xuất hoạt chất Huperzine A từ H serra địi hói phái nhiều thời gian, chi phí nhiều cho trồng trọt để thu sản lượng đủ cho chiết xuất hoạt chất Hupcrzinc A làm nguyên liệu cho ngành cơng nghiệp sàn xuất thuốc, từ dẫn đến hiệu kinh tế không cao Mặc dù nghiên cứu gần chứng minh nhân giống in vitro sản xuất HupA cao trồng tự nhiên chưa đáp ứng nhu cầu ngành công nghiệp dược phàm, thời gian nhân giống đế thu làm nguyên liệu sán xuất thuốc kéo dài hàng năm Gần đây, nấm nội sinh phân lập từ loại trồng chấp nhận nguồn nguyên liệu quan trọng ngành công nghiệp dược Một lượng lớn hợp chất có cấu trúc hoạt tính sinh học khác chiết xuất từ nấm nội sinh Do đó, việc nghiên cứu phân lập chùng nam nội sinh H serrata có khả sàn sinh hoạt chất HupA nhà khoa học quan tâm nhằm thay thế, tăng cường lượng HupA cho ngành công nghiệp dược Ó Việt Nam, Thạch tìing cưa phát Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1.000 m Đây loài dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách "đỏ" Chương trình Nghiên cứu bảo tồn phát triền nguồn gen bán địa quý thuốc, chưa quan tâm nghiên cứu khai thác ứng dụng điều trị bệnh Việt Nam Mặt khác, nghiên cứu nấm nội sinh Thạch tùng cưa Việt Hình 3.8: sắc ký đồ HPLV ( uv 210, 230, 310 nm ) cùa chất chi thị Hupcrzinc A (A) Ml.10(B) Bảng 3.3: Bàng thời gian lưu phân tách peak sắc ký đồ chất chuấn Huperzine A (A) chủng vi nam M1.10 (B) A Peak Name Peak RT 1.696 Area % Area Height 8150 0.04 661 1178 Peak 2.025 14975 0.08 Peak 2.385 5112718 27.03 106801 Peak 2.616 4721355 24.96 Peak 3.055 9057896 47.89 Peak Name RT Area % Area Height 25.31 1511 B Peak 311587 279486 1.696 1.797 18382 Peak2 3.031 12350 17.00 Peak 2.349 27904 38.42 1018 Peak 2.486 10025 13.80 7561 Peak 3.055 5.597 1254 1018 3964 5.46 744 Hình 3.10 cho thấy, sau tiến hành quét phố uv cùa chất chuân HupA bang máy đo quang phồ uv - VIS ta thu kết HupA có độ hấp thụ lớn bước sóng 210, 230, 310nm Đây bước sóng thích họp đe phát HupA mẫu dịch chiết M1.10 Từ phổ cùa mẫu dịch chiết nấm mẫu chưấn ta xác định thời gian lưu cùa mầu chuấn peak sau: Peak 1, 2,3,4,5 là: 1.696, 2.025, 2.385, 2.616, 3.055 Và cùa mẫu thử Peak 1,2,3,4,5 là: 1.696, 2.031, 2.349, 2.486, 3.055 (bàng 3.3) Do vậy, thời gian lưu mẫu chuẩn HupA mầu thứ dịch chiết M1.10 xấp xi nhau, có thê khẳng định có mặt cùa HupA dịch chiết chủng vi nấm nội sinh Ml 10 Như vậy, với 109 mẫu dịch chiết nấm nghiên cứu xác định chủng vi nấm Ml 10 có khả sản sinh hoạt chat Huperzine A Chủng tiến hành định danh đến chi, loài 3.3 Kết định danh chủng vi nấm sinh tổng họp Huperzine A 3.3.1 Ket định danh theo phương pháp truyền thống Quan sát đặc điểm hình thái, màu sắc khuân lạc chúng vi nấm M1.10 cho thấy: Khuẩn lạc chủng không cân đối, viền khuấn lạc liền, sợi nấm có màu xanh viền trắng có thời gian ni cấy 10 ngày (hình 3.9) Hình 3.9: Khuấn lạc cùa chủng vi nấm M1.10 Tiến hành nhận dạng sơ đến chi cúa chúng vi nấm MI 10 sau quan sát vi hình thái kính hiển vi quanng học , nhận dạng chủng nấm thuộc không sinh bào tử tạm phân vào nhóm nhóm nấm bất thụ có vách ( hình 3.10) Hình 3.10: Anh vi hình thái chủng nâm nội sinh Ml 10 Nấm bất thụ có vách ( Deuteromycotina) gồm hệ thống nhóm nấm bị thiếu khơng phát đặc điểm nam hoàn chỉnh (tiếp hợp, nang đám); nấm không mang bào tứ tiếp hợp (zygospore), báo tử nang (ascospore), bào tử đảm ( bào tử đính thứ sinh -Basidiospore) Nấm thiếu giai đoạn sinh sán hữu tính vịng đời, cá thể chí sinh sãn hình thức vơ tính, chu yếu bào tứ đính (conidia) phát triển cuống bào tử đính (conidiophotcs) Hau hết tất cá Deuteromycotina đe có hệ khuan ty (mycelium) thật, gồm có phát triền sợi, phân nhánh vách ngăn sợi nấm (hypha) Hệ sợi nấm thường có gian bào nội bào mồi te bào chứa nhiều nhân Vách ngăn tất loài kháo sát giống với Ascomycotina, có lỗ thơng vách Khuẩn lạc sợi nấm thường có màu (xanh rêu, nâu đậm, hồng tím, ), viền khuân lạc liền, chủ yếu khn ty chất có kích thước to, khuẩn ty khí sinh dạng sợi nhở Thường bão tử dạng nang có hình cầu bầu dục Đe định danh xác chủng vi nam nội sinh, tiến hành định danh phương pháp PCR phân tích trình tự vùng rADN - ITS 3.3.2 Ket định danh chủng nấm nội sinh bang phân tích trình tự vùng rADN - ITS ADN chùng nấm Ml 10 tách chiết mô tà phần phương pháp Ket kiểm tra máy đo quang phổ cho thấy ADN tồng số tách chiết có độ tinh cao (A 260/280 = 1,87) sử dụng làm khuôn để thực phán ứng PCR Cặp mồi ITS ITS2 khuếch đại đoạn gen ITS chủng nấm có kích thước tính tốn theo lý thuyết 180-280 bp Ket cúa phán ứng PCR kiểm tra gel agarose 1% (hình 3.11) Theo hình 3.11, kết điện di cho thấy giếng xuất băng có kích thước phân tử khống 280 bp tương đương với tính tốn lý thuyết Như vậy, khuếch đại thành công đoạn gen ITS chủng nấm cần định danh Các sàn pham PCR tinh theo Kit tinh sán phẩm PCR cúa hãng Affymetrix xác định trình tự nucleotid bàng máy giải trình tự gen tự động 200bp Hình 3.11: Kết chạy điện di sàn phẩm PCR chúng vi nấm M1.10 gel agarose (I: Marker, 2: Chúng M1.10) Sản phấtn khuếch đại vùng ITS - rADN cùa chúng nấm M1.10 đọc bàng máy giải trình tự AEI PRISM @ 3700 Genetic Analyzer Trình tự vùng đối chiếu ngân hàng liệu gen NCBI với phần mềm BLAST So sánh chủng đối chiếu có trình tự tương đồng cao (hình 3.12, bảng 3.3) AACTÍGCCAGGACG£CCGGC7AAG’GCCCGCCAGĨAĨACA4AAC'CAA.G _1 _X _- _—^2 í _. - ẪGAATĨCAT• 7G 7C-AAGĨCC74 ATAĨA1 CA r7 UĨ7GAĨ 7AAAACĨ7 TCAACAAteG A7CĨC7 GG r :c 7GGCATCGÃĨG.AAACGCAG Ỉ.G Hình 3.12: Kết giải trình tự gen chủng nấm Ml 10 Bảng 3.4: Mức độ tương đồng gen 1TS1 cúa chủng nam so sánh với trình tự chủng GenBank Tên chúng Chủng so sánh Tên Mã số Dộ dài Mức độ đoạn so tương sánh đồng (%) (%) Phyllosticta M 1.10 aristoỉochiicoỉa NR_111791 100 92 BRIP Phyllosticta ardisiicola NR_136592 88 88 NR_136591 87 87 NR_137083 86 86 NBRC 102261 Phyllosticta lỉgustricoỉa NBRC 102256 Phyỉlosticta hymenocaUidicola Từ số liệu báng 3.4 cho thấy: Chúng nấm nội sinh M1.10 cịn lại có độ tương đồng < 98% so với chúng đối chiếu GcnBank, kết so sánh không khắng định xác đến lồi cúa chúng, chi khẳng định chúng Ml 10 thuộc chi nấm Phyllosticta Ket quà cho thấy, chủng Phyllosticta sp Ml 10 lồi chưa phát Vì vậy, cần tiến hành xác định thêm vùng gen chuyên biệt vùng gen mã hóa actin, calmodulin, endochitinase, vùng Tcf chúng Ml 10 phương pháp giải trinh tự thông lượng cao (high - throughput sequencing ) đề định danh chủng đến loài phát loài Như vậy, với 109 mẫu dịch chiết nam phân lập từ Thạch tùng phân bố Đà Lạt, xác định chủng Ml 10 có khả sàn sinh hoạt chất Huperzine A Chúng thuộc chi Phyllosticta Trên giới chưa có cơng bố phát chủng vi nấm thuộc chi Phyllosticta có sán sinh HupA Các chúng sán sinh HupA công bố xác định thuộc chi Paecilomyces, Cỉadosporium , Acremonium , Blastomyces Bottytis pingqian Su Minhe Yang, 2014; Zhang cộng sự, 201, Zhu cộng sự, 2010) PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã hoạt hóa tách chiết dịch chiết từ 109 chúng vi nấm nội sinh Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt, Việt Nam Băng kỳ thuật đo quang phô uv - VIS HPLC xác định chúng vi nấm M1.10 có khả tổng hợp hoạt chất Huperzine A Bằng phương pháp định danh truyền thống sinh học phân tứ định danh chúng M1.10 chi Phyllosticta 4.2 Kiến nghị Cần tiến hành xác định thêm vùng gcn chuyên biệt vùng gen mã hóa actin, calmodulin, endochitinase, vùng Tef cúa chúng Ml 10 phương pháp giải trình tự thơng lượng cao (high - throughput sequencing ) de có the định danh chủng đến loài phát loài Tiến hành phương pháp xác định hàm lượng Huperzine A mà chủng Ml 10 sản sinh bàng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp xác định đạt đọ xác cao Tiếp tục tìm kiếm, thu thập phân lập thêm chùng vi nam nội sinh từ mẫu Thạch tùng cưa phân bố vùng khác khắp cá nước đế phân lập tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả sản sinh Huperzine A TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Khuất Hữu Thanh (2006) Kỹ thuật gen - Nguyên lý ứng dụng Nhà xuất bán Khoa học Kỳ thuật Lại Hà Tố Hoa (2006) Định danh nấm Trỉchoderma dựa vào trình tự vùng ITS - rADN vùng Tef Khóa luận kỹ sư công nghệ sinh học Lê Thị Minh Thành (2001) Sơn thục nấm nội sinh, triển vọng ứng dụng nông nghiệp Luận văn thạc sỳ khoa học nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982) Vi nấm Nhà Xuất bàn Khoa học Kỹ thuật Trần Hợp, Phùng Mỹ Hưng “Cây thạch tùng cưa Huperzia serrata loài dược liệu quý Việt Nam” Web Sinh vật rừng Việt Nam Sinh học phân tứ ( Hồ Huỳnh Thùy Dương - chuyên ngành Sinh học phân tử - Khoa Sinh - Đại học Khoa học Tự Nhiên thuộc Đại học Quốc gia TPHCM, 1998) Nhà xuất bán giáo dục Tài liệu nước A L Gunatilaka microorganisms: (2006) distribution, Natural products structural from diversity, plant-associated bioactivity, and implications of their occurrence JouARNl of Natural Products (vol 69, no 3),509-526 Alzhermer’s Disease International (2009) World Alzhermer Report: World Alzhermer Report 2009 Available: http://www.alz.co.uk/research/world- report Accessed 28 January 2013 Alzheimer's Association FDA-Approved Treatment for Alzheimer’s Available at: http://www.alz.org Accessed 29 January 2013 10 Arnold A.E, Mejia L.c, Kyllo D., Rojas E.I, Maynard z., Robbins N., Hcrrc E.A (2003) Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree PNAS USA (100), 15649-15654 11 Brundrett M.c and Kendrick B (1988) The mycorrhizal status, root anatomy, and phenology of plants in a sugar mappie forest Canadian “Journal of Botamy” (66), 1153-1173 12 Chen XY„ Qi YD., Wei JH., Zhang z„ Wang DL„ Feng JD., Gan BC (2011) Molecular identification of endophytic fungi from medicinal plant Huperzia serrata based on rADN ITS analysis World J Microbiol Biotechnol (vol 27, no 3), 495-503 13 Dobranic JK., Johnson JA Alikhan QR (1995) Isolation of endophytic fungi from eastern larch (Larix laricina) leaves from New Brunswick, Canada Can J Microbiol (141), 194-198 14 D Zhu, J Wang, Q Zeng, z Zhang, R Yan (2010) A novel endophytic Hupcrzinc A - producing fungus, Shiraia sp S1ÍT4, isolated from Huperzia serrata JouARNl of Applied Microbiology (109), 1469 -1478 15 Gallery R.A, Dalling J.w, Arnold A.e (2007) Diversity, host affinity and distribution of seed-infecting fungi: a case study with Cecropia Ecol (88), 582-588 16 Gary Strobel and Bryn Daisy (2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products, department of plant sciences Microbiology and molecular biology reviews 17 Gustavo Molina, Ana Paula Dionisio, Mário Roberto Marỏstica Junior and Gláucia Maria Pastore (2010) Review article: The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process Biotechnology Research InteARNtionaL 18 Huang LH., Feng JQ., Zhou SL., Hong YK (2009) Isolation and identification of endophytic fungi of Huperzia Serrata AcademicjouARNls (9), 2641-2644 19 I Zabalgogcazcoa (2008) Review Fungal endophytes and their interaction with plant pathogens Spanish JouARNl of Agricultural Research (6), 138146 20 Ju, z., Wang, J and Pan, s (2009) Isolation and preliminary identification of the endophytic fungi which produce Huperzine A from four species in Hupziaceae and deter - mination of Huperzine A by HPLC Fudan Univ J Med Sci (36), 445-449 21 Lim WH, Goodger JQD, Field AR, Hokum JA, Woodrow IE (2010) Huperzine alkaloids from Australasian and southeast Asian Huperzia Pharm Biol 48 (9) 1073-1078 22 Kenneth w Cullings, Detlev R Vogler (1998) A 5.8S nuclear ribosomal ARN gene sequence database: applications to ecology and evolution Molecular Ecology (7), 919-923 23 Klironomos, J.N., McCune, J., Hart, M & Neville, J (2000) The influence of arbuscular mycorrhizae on the relationship between plant diversity and productivity Ecol Lett., 3, 137-141 24 Liu, J.S., Yu, C.M., Zhou, Y.Z., Han, Y.Y., Wu, F.W., Qi, B.F., Zhu, Y.L (1986a) Study on the chemistry of huperzine-A and hupcrzine-B Acta Chimica Sinica (44), 1035-1040 25 Liu, J.S., Zhu, Y.L., Yu, C.M., Zhou, Y.Z., Han, Y.Y., Wu, F.W., Qi, B.F (1986b) The structures of huperzine A and B, two new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity Canadian JouARNl of Chemistry (64), 837-839 26 Li w., Zhou J., Lin z., and Hu z (2007) Study on fermentation for production of Huperzine A from endophytic fungus 2F09P03B of Huperzia serrat Chin Med Biotechnol (2), 254-259 27 Mariana Recco Pimentel, Gustavo Molina Ana Paula Dionisio, Mário Roberto Maróstica Junior and Gláucia Maria Pastore (2010) Review article: The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process Biotechnology Research InteARNtional 28 Ma, X, c., Zhu, D, and Gang, D.R, (2005) Is there a better source of Huperzine A than Huperzia serrata? Huperzine A content of Huperziaceae species in China J Agric Food Chern 53, 1393 - 1398 29 Ma X and Gang DR (2008) In vitro production of Huperzine A, a promising drug candidate for Alzheimer’s disease Phytochemistry (69), 2022 -2028 30 Ma XQ, Gang DL (2004) alkaloids Lycopodium Nat prod repz 1:752.772 31 Ma XQ, Tan CH, Zhu DY, Gang DR (2006) A survey of potential Huperzine A natural resources in China: the Huperziaceae J Ethnopharmacol 104: 54-67 32 Ma and X.Q (1997) Chemical studies on natural resources of Huperzia and its related genera in China Chinese Academy of Sciences (D), Shanghai 33 R X Tan, w X Zou (2001) Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites Nat Prod Rep (18), 448 - 459 34 Sahar Masumi, Soheila Mirzaei, Doustmorad Zafari and Ramezan Kalvandi (2015) Isolation, identification and biodiversity of endophytic fungi from Thymus Process in Biological sciences (vol.5), 43-50 35 Sanchez Marquez s., Bills G.F, Zabalgogeazcoa I (2007) The endophytic mycobiota of the grass Dactylis glomerata Fung Divers (27), 171-195 36 Shi w., Luo JP., Ting ZH., Wu J (2005) Isolation and identification of endophytic fungi of Huperzia serrata Herbal Drugs (36), 281-283 37 s K Deshmukh, p D Mishra, A Kulkarni-Almeida et al (2009) Antiinflammatory and anticancer activity of ergoflavin isolated from an endophytic fungus Chemistry and Biodiversity (vol 6, no 5), 784-789 38 Spae'kova', selection I effect & Leps”, from J other (2001) Procedure effects in for separating the diversity-productivity relationship Ecol Lett., 4, 585-594 39 Stierle A, Strobel G, Stierle D (1993) Taxol and taxol production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific yew Science 260:214-216 40 Strobel G, Daisy B (2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products Microbiol Mol Biol Rev 67: 491-502 41 Stone J.K., Polishook J.D, White J.F (2004) Endophytic fungi In: Biodiversity of fungi Inventory and monitoring methods (Mueller G.M., Bills G.F., Foster M.S., cds) Elsevier Academic Press, San Diego, USA, 241-270 42 Sardul Singh Sandhu et al (2014) Isolation and identification of endophytic fungi from Ricinus communis linn and their antibacterial activity InteARNtional jouARNl of research in pharmacy and chemistry (vol.4 - no.3), 611-618 43 Szypula w., Pietrosiuk A., Suchocki p., Olszowska o., Furmanowa M and Kazimieska o (2005) Somatic embrogcncsis and in vitro culture of Huperzine selago shoots as a potential source of Huperzine A Plant Sci (168), 1443-1452 44 Tang, X.C Han, Y.F., Chen, X.P., Zhu, X.D (1986) Effects of Huperzine A on learning and the retrieval process of discrimination performance in rats Zhongguo Yao Li Xue Bao (7), 507-511 45 T p Fill, B F da Silva and E Rodrigues-Fo (2010) Biosynthesis of phenylpropanoid amides by an endophyticpenicillium brasilianum found in root bark of Melia azcdarach JouARNl of Microbiology and Biotechnology (vol 20, no 3), 622-629 46 Wang Y, Yan RM, Zeng QG, Zhang ZB, Wang D, et al (2011) Producing Huperzine A by an endophytic fungus from Huperzia serrata Mycosystema 30 (2) 255-262 47 Xiaoquiang Ma, ChangHen Tan, Dayuan Zhu, David G.Rang and Peigen Xiao (2007) Huperzine A from Huperzia species cthnopharmacolgical review JouARNl of EthnopharmacolgicaL - An 48 Yang CY, Lu ZP, Zheng CG (2003) Efficacy and reliability of huperzine A in mild and moderate Alzheimer's disease Chinese Journal of Clinical Rehabilitation 7: 4258-4259 49 Yin Lu, Chuan Chen, Hong Chen, Jianfen Zhang and Weiqin Chen (2012) Isolation and identification of endophytic fungi from Actinidia macrosperma and investigation of their bioactivities Evidence-Based Complementary and AlteARNtive Medicine (vol.2012), pages 50 Zhu, X.D., Tang, x.c (1987) Facilitator/ effects ofhuperzine A and B on learn- ing amd memory of spatial discrimination in mice Yao Xue Xue Bao (22), 812-817A Trang Web 51 http://healthplus.vn/thach-tung-rang-cua-duoc-lieu-quv-chua-benhalzheimer- d26775.html/ 52 rvn-vallct.org/wp-contcnt/uploads/rvn2015/tom tat de tai nghicn Stierle, A., Strobel, cuu- ngoc my,doc/ 53 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8097061 G., and Stierle, D (1993) Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew 54 https://bmcplantbioLbiomcdccntral.eom/articles/l 0.1186/1471 -2229-10- 209 Hongmei Luo, Ying Li, Chao Sun, Qiong Wu, Jingyuan Song, Yongzhen Sun, André Steinmetz and Shilin Chen (2010): Comparison of 454-ESTs from Huperzia serrata and Phlegmariurus carinatus reveals putative genes involved in lycopodium alkaloid biosynthesis developmental regulation 55 http://utt.edu.vn/khcb/nghien-cuu-khoa-hoc/pho-hap-thu-phan-tu-uv-visva-ung-dung-trong-phan-tich-a6555.html and ... phân lập từ Thạch tùng c? ?a phân bố Đà Lạt, Vi? ??t Nam Nội dung đề tài: • Hoạt h? ?a chủng vi nam nội sinh phân lập từ Thạch tùng c? ?a Đà Lạt, Vi? ??t Nam • Sàng lọc chùng vi nấm nội sinh có khả tổng hợp. .. vi nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng c? ?a phân bố Đà Lạt - Vi? ??t Nam có khả sinh tống hợp hoạt chất Huperzine A ” thực với hy vọng xác định chủng nấm nội sinh có khả sản xuất hoạt chất HupA nhằm... cứu vi nấm nội sinh Thạch tùng c? ?a Vi? ??t Nam công bố Với ti lệ người mắc bệnh Alzheimer ngày gia tăng Vi? ??t Nam van đề trở nên cấp thiết Mặt khác, nghiên cứu nấm nội sinh Thạch tùng c? ?a ch? ?a có