Xác định đặc tính di truyền học trên gen 16s của chủng vi khuẩn clostridium perfringen phân lập trên heo nhiễm bệnh tại Ba Vì, Hà Nội năm 2017.pdf

Il Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH LUẬN VÀN TĨT NGHIỆP NI CẤY, TĂNG SINH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN HỌC TRÊN GEN 16S CỦA CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGEN PHÂN LẬP TRÊN HEO NHIẺM BỆNH TẠI BA VÌ, HÀ NỘI NĂM 2017 Sinh viên thực hiện: Võ Thanh Sang Chuyên ngành Tp HCM, tháng năm 2018 * : Công nghệ Sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG CdĩO LUẬN VĂN TĨT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN HỌC TRÊN GEN 16S CỦA CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERERĨNGEN mẢN LẬP TRÊN HEO NHIỄM BỆNH TẠI BA VÌ, HÀ NỘI NĂM 2017 Sinh viên thực : VÕ Thanh Sang Mã số sinh viên :1411531495 Lóp : 14DSH01 Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Giáo viên hướng dẫn : TS Thân Văn Thái TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận Trước hết, tơi xin chân thành gửi lời cảm on tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nguyền Tất Thành với niềm kính trọng, tự hào học tập trường mang tên Bác năm qua Sự biết on sâu sắc xin gừi đến thầy TS Thân Văn Thái tận tình hưóng dẫn động viên tơi q trình thực khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, xin ghi nhớ tình cảm, giúp đờ thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Mơi trường, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành tồn thể chú, anh chị phịng thí nghiệm Công nghệ sinh học Y dược giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiện động viên khích lệ để tơi vượt qua khó khăn q trình học tập vừa qua Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 thảng năm 2018 VÕ Thanh Sang Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành ii MỤC LỰC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TÂT vi DANH MỤC CÁC CHỪ VIẾT TẨT viii DANH MỤC HÌNH ix Tính cấp thiết đề tài: Nội dung nghiên cứu đề tài: Mục tiêu đề tài: CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan c perfringen 1.1.1 Đặc điểm chung vi khuẩn c perfringen 1.1.2 Phân loại khoa học vi khuẩn c perfringen 1.1.3 Phân loại type độc tố vi khuẩn c perfringens .4 1.1.4 Cơ chế gây bệnh vi khuẩn c perfringen 1.1.5 Đặc điểm gây bệnh vi khuẩn c perfringen 1.1.6 Triệu chứng lâm sàng bệnh viêm ruột hoại tử heo 1.1.7 Bệnh tích đại thể bệnh viêm ruột hoại tử heo 1.2 Tình hình nghiên cứu nước 1.2.1 Nghiên cứu nước .9 1.2.2 Nghiên cứu nước 10 1.3 Tổng quan PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 1.3.1 Nguyên lý hoạt động cùa phản ứng PCR 12 1.3.2 Các điều kiện phản ứng PCR 13 1.3 2.1 DNA khuôn 13 1.3 2.2 Các nucleotid tự (dNTP) 13 1.3 2.3 Mồi - Primers 14 1.3 2.4 Enzym DNA Polymerase 14 1.4 Những hiểu biết gene 16S rRNA 15 1.5 Điện di 16 1.5.1 Nguyên lý chung 16 1.5.2 Các kỳ thuật điện di chủ yếu 16 iii 1.6 Kỹ thuật giải trình tự gen 17 1.7 Xây dựng phát sinh loài 17 CHƯƠNG NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 18 2.1 Thời gian địa điểm thực 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Đối tượng nghiên cứu 18 2.4 Vật liệu nghiên cứu 18 2.4.1 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 18 2.4.2 Hóa chất thuốc thử 19 2.5 Môi trường sử dụng 19 2.5.1 Môi trường BHI lỏng 19 2.5.2 Môi trường BHI - agar 20 2.5.2 Môi trường BHI - agar - máu cừu 20 2.6 Phương pháp nghiên cứu .20 2.6.1 Phương pháp lấy mầu bệnh phẩm 21 2.6.2 Phương pháp phân lập chủng c perfringens 21 2.6.2.1 Khử trùng 21 2.6.2.2 Cấy ria que cấy .22 2.6.2.3 Cấy que trang 22 2.6.2.4 Nuôi tăng sinh môi trường lỏng 22 2.6.3 Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn c perfingen 23 2.6.4 Phương pháp nhuộm Gram tế bào vi khuẩn 23 2.6.5 Phương pháp giữ giống vi khuẩn 24 2.6.6 Phương pháp tách chiết DNA phương pháp shock nhiệt 24 2.6.7 Giám định loài vi khuẩn c perfringen đà phân lập theo phương pháp phát gene 16S kỳ thuật PCR 25 2.6.7.1 Trình tự cặp mồi (primer pair) sử dụng cho PCR 25 2.6.7.2 Thành phần phản ứng PCR 25 2.6.7.3 Quy trình thực 25 2.6.10 Phương pháp diện di 26 2.6.10.1 Chuẩn bị gel agarose 1% 26 2.6.10.2 Bom mẫu vào giếng gel chạy điện di 26 iv 2.6.10.3 Soi gel 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết phân lập vi khuẩn c perfringens 27 3.1.1 Kết phân lập vi khuẩn c perfringens môi trường thạch 27 3.1.2 Kết nuôi tăng sinh vi khuẩn c perfringen môi trường lỏng 29 3.2 Kết kiểm tra đặc tính hình thái c perfringen 30 3.3 Kết diện di sản phẩm PCR 30 3.4 Kết giải trình tự sản phẩm PCR 31 3.5 Kết kiểm tra BLAST chủng vi khuẩn phân lập 32 3.6 Kết xây dựng phát sinh loài 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 Kết luận: 35 Đề nghị: 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 38 V TÓM TẮT Đề tài “Xác định đặc tính di truyền học gen 16S chủng vi khuẩn Clostridium perfringen phân lập heo nhiễm bệnh Ba Vì, Hà Nội năm 2017” thực từ tháng - 8/2018 phịng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyền Tất Thành, số 2374 quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Ọuận 12, TP Hồ Chí Minh Nội dung đề tài: Xác định đặc tính di truyền học gen 16S chủng vi khuẩn Clostridium perfringen phân lập heo nhiễm bệnh Ba Vì, Hà Nội năm 2017 phương pháp xác định phát sinh loài Kết đạt được: Phân lập chủng vi khuẩn c perfringen khiết hai loại môi trường (BHI - agar BHI - agar - máu cừu) với đặc điểm khuẩn lạc đều, tốc độ phát triển khuẩn lạc môi trường BHI - agar - máu cừu tốt hon môi trường BHI - agar điều kiện kị khí ủ 37 °C Kết nhuộm gram cho thấy chủng vi khuẩn c perfringen bắt màu tím đặc trưng vi khuẩn Gram dương, có hình que, đứng riêng rẽ song song, số vi khuẩn nối tạo dạng chuồi ngắn Đặc điểm di truyền dựa trình tự gen 16S cho thấy chủng vi khuẩn c perfringen nghiên cứu phân bố nhóm với chủng vi khuẩn c perfringens phân lập từ nhiều nước giới Nhật Bản, Án Độ, Thụy Điển, Mỹ, Pháp, Hàn Quốc Trong đó, chủng nghiên cứu chia sẻ mức độ tương đồng cao với chủng phân lập Nhật Bản (accession number: AB264618) Án Độ (accession number: AM889033), gợi ý chủng vi khuẩn có chung nguồn gốc vi SUMMARY The project title “Genetic characterization based on the 16S gene of a Clostridium perfringen strain isolated in swine in Bavi, Hanoi in 2017” was performed in - 8/2018 in Microbiology laboratory, Department of Biotechnology and Enviroment, Nguyen Tat Thanh University Khoa Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, 2374, National road 1A, Trung My Tay Ward, Diet 12, Ho Chi Minh City Project content: Genetic characterization based on the 16S gene of a c perfringen strain isolated in swine in Bavi, Hanoi in 2017 by using phylogenetic tree analysis Results: The c perfringen strain was isolated in two kind of media (the BHI-agar and BHI-agar-sheep blood media) Observation of the clones indicated that the clones grown better in the BHI - agar - sheep blood than the BHI - agar media at the incubation of 37 °C The gram staining result indicated that the strain was violet stained as the other Gram positive bacteria, with rod-shape, and isolate /or stick together Genetic characterization of the 16S gen showed that the study strain was closely related to the strains isolated from many countries around the world, including Japan, India, Sweden, USA, France, Denmark, and Korea In addition, the study strain shared most closely to the AB264618 and AM889033 strains isolated from Japan and India, respectively, implying that these strains may shared common ancestor vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT ASEAN: Association of South East Asian Nations BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Bp: Base pair BHI: Brain Heart Infusion Broth c perfringens: Clostridium perfringens DNA: Deoxyribonucleic Acid E.coli: Escherichia coll PCR: Polymerase Chain Reaction UV: Ultraviolet NCBI: The National Centre for Biotechnology Information DNAse: Deoxyribonuclease dNTP: Deoxyribounucleotide triphosphate Tm: Nhiệt độ nóng chảy trình tự DNA TBE: Tris - Borate - EDTA Taq: Thermus aquaticus RNA: Ribonucleic Acid F: Forward R: Reverse PCR: Polymerase Chain Reactin viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Clostridium perfringen Hình 1.2 Bệnh tích đại thể viêm ruột hoại tử heo Hình 1.3 Các giai đoạn phản ứng PCR Hình 1.4 Cẩu trúc bậc 16S RNA Hình 2.1 Phân lập khuẩn lạc que cấy ria Hình 2.2 Phân lập vi khuẩn que cấy trải Hình 2.3 Các bước nhuộm Gram Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn c perfringen mơi trường BHI-agar BHI-agar-máu cừu Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc c perfringen mơi trường thạch máu cừu Hình 3.3 Tăng sinh vi khuẩn c perfringen mơi trường BHI Hình 3.4 Kết nhuộm Gram vi khuẩn c perfringen Hình 3.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR Hình 3.6 Kết đọc trình file từ phần mềm Bioedit Hình 3.7 Kết BLAST trình tự chủng vi khuẩn phân lập Hình 3.8 Cây phát sinh lồi chủng vi khuẩn c perfringen ix ... vi khuẩn c perfringen phương pháp xác định phát sinh loài Mục tiêu đề tài: Xác định đặc tính di truyền học gen 16S chủng vi khuẩn Clostridium perfringen phân lập heo nhiễm bệnh Ba VI, Hà Nội năm. .. nhân gây bệnh Xuất phát từ thực tiền định thực đề tài: ? ?Xác định đặc tính di truyền học gen 16S chủng vi khuẩn Clostridium perfringen phân lập heo nhiễm bệnh Ba Vì, Hà Nội năm 2017” Nội dung... TẮT Đề tài ? ?Xác định đặc tính di truyền học gen 16S chủng vi khuẩn Clostridium perfringen phân lập heo nhiễm bệnh Ba Vì, Hà Nội năm 2017” thực từ tháng - 8/2018 phịng thí nghiệm Vi sinh, Khoa