BÀI PHÚC TRÌNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÂN TÍCH VÙNG GEN 16s DNA của VI KHUẨN BẰNG ENZYME cắt GIỚI hạn

ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM  - - BÀI PHÚC TRÌNH CƠNG NGHỆ DI TRUYỀN Mã HP: CS320 Cán hướng dẫn Ts Nguyễn Thị Pha Cần Thơ, 11/2022 BÀI PHÚC TRÌNH PHÂN TÍCH VÙNG GEN 16S DNA CỦA VI KHUẨN BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN I LY TRÍCH DNA CỦA VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỐC NHIỆT Mục đích - Khảo sát đa dạng dịng vi khuẩn đặc tính riêng dòng vi khuẩn cách phân lập vùng 16S rDNA vi khuẩn Kỹ thuật ly trích DNA phải đảm bảo thao tác thu nhận DNA tổng số có độ tinh cao, hàm lượng đủ lớn, bị đứt gãy,cũng khảo sát số lượng chất lượng mẫu DNA ly trích nhằm tuyển chọn mẫu DNA đủ yêu cầu để thực phân tích gene phương pháp sinh học phân tử PCR, SSR, RAPD, PCR-RFLP,… Cung cấp cho sinh viên kiếm thức thực tế gene đa dạng Giúp sinh viên có kinh nghiệm thao tác kỹ thuật việc phân lập vùng gene vi khuẩn Vật liệu hóa chất Dụng cụ thiết bị thí nghiệm: - Máy ly tâm - Máy ủ nhiệt - Bộ micropipette - Đầu cole - Ống tuýp eppendoft 2,2 mL 1.5Ml Hóa chất: 1) Dung dịch TE 1X dòng vi khuẩn , hỗn hợp đối chứng Quy trình 2) Hút 2mL dung dịch vi khuẩn cho vào ống tuýp eppendoft 2,2 mL Ống 1: L4 Ống 2: L7 Ống 3: L7 + L8 Ống 4: L8 Ống 5: Đối chứng Ly tâm 13000 vòng/phút, phút 3) Thu cặn tế bào + 200 µL TE votex - 4) Ly tâm 13000 vòng/phút, phút 5) Thu cặn tế bào + 200 µL TE votex 6) Ly tâm 13000 vòng/phút, phút 7) Thu cặn + 50 µL TE votex, trộn 8) Ủ 95oC 10 phút 9) Ly tâm 13000 vòng/phút, phút 10) II Hút phần dung dịch 30 µL cho vào tube 1,5mL KHUẾCH ĐẠI VÙNG 16S rRNA BẰNG MỒI TỔNG 1) Vật liệu hóa chất Vật liệu thí nghiệm: - Máy PCR - Máy chụp gel đọc hình BioRad UV 2000 - Bộ điện di chiều - Ống tuýp eppendoft 0.5ml 1.5ml - Micropipette - Giấy parafin Hóa chất: - BiH2O - Buffer 5X - Mồi xuôi 27F - Mồi ngược 1492R - Taq polymerase - Mẫu DNA ly trích từ (phần I) - Loading buffer - Gel agarose 1,5% Trình tự đoạn mồi: Trình tự primer Primer 27F 5’- GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ 2) Nguyên lí: - Kỹ thuật PCR – RFLP: PCR – RFLP kỹ thuật kết hợp phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) truyền thống đa dạng hệ thống RE ( enzyme cắt giới hạn) Trong phương pháp vùng DNA quan tâm khuếch đại mồi chuyên biệt nhờ phản ứng PCR Vùng DNA sau khuếch đại cắt enzyme cắt giới hạn Phương pháp khắc phục tính phức tạp RFLP, tốn an toàn thời gian thực nhanh, khơng sử dụng phóng xạ Tuy nhiên, sử dụng PCR nên sai lệch kết nguồn DNA bị nhiễm - Kỹ thuật điện di: Điện di (electrophoresis) kỹ thuật quan trọng lĩnh vực hóa học, hóa sinh sinh học phân tử Điện di thường dùng việc tinh phân tích phân tử sinh học nucleic acid, protein số phức hợp carbohydrat, lipid Điện di tượng dịch chuyển vật thể mang điện tích tác động điện trường Sự dịch chuyển thành phần lực điện lực Lorentz điện trường tích điện âm phân tử DNA di chuyển từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) Các phân tử DNA di chuyển điện trường với tốc độ khác chúng khác kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) Điện di gel (gel electrophoresis) áp dụng sinh học phân tử kĩ thuật để phân tích phân tử DNA, RNA hay protein dựa đặc điểm vật lý chúng kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) Kĩ thuật sử dụng dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện tạo điện trường đều, gel (thường agarose hay polyacrylamide) đóng vai trị thể để phân tách phân tử, chất nhuộm khác (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát vị trí phân tử gel sau điện di Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo điện trường tác động vào phân tử tích điện kích thước lỗ thể (gel) Gel cấu tạo chuỗi cao phân tử (polymer) liên kết chéo với tạo thành hệ thống mạng lưới với kích thước mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) phản ứng tạo liên kết chéo Các phân tử phân tách di chuyển gel với vận tốc khác nhờ vào khác lực điện trường tác động lên chúng (nếu phân tử tích điện khác nhau) kích thước phân tử so với kích thước lỗ gel hình dạng, độ cồng kềnh phân tử Trong trường điện di phân tử có kích thước nhỏ di chuyển nhanh, phân tử kích thước di chuyển tốc độ Khi trình điện di kết thúc phân tử DNA quan sát thấy nhờ sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang Hiện nay,thuốc nhuộm sử dụng phố biến safe view, chất khuyến cáo không độc, không gây hại cho môi trường sinh vật, hiệu tương đương thuốc nhuộm ethidium bromide (rất độc) dùng trước Mỗi vệt sáng (băng-band) xuất gel thể tập hợp phân tử DNA có kích thước Để ước lượng kích thước phân tử DNA, phân tích thang chuẩn thường sử dụng Thang chuẩn hay gọi “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (MoclecµLar weigth maker-MWM), tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết trước, dựa vào kích thước biết trước người nghiên cứu biết kích thước đoạn DNA cần nghiên cứu - Kỹ thuật PCR PCR (Polymerase Chain Reaction),là kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng để khuếch đại một vài đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo hàng ngàn đến hàng triệu trình tự DNA Có diện Taq polymerase, mồi, dNTPs, DNA khuôn ( trích từ sinh vật có đoạn DNA cần khuếch đại) Phương pháp PCR dựa chu kỳ nhiệt, bao gồm chu kỳ tăng giảm nhiệt độ phản ứng biến tính ADN tái ADN Đoạn mồi (là đoạn ADN ngắn) mang trình tự bổ sung với trình tự ADN đích ADN polymerase thành phần quan trọng cho phép khuếch đại cách chọn lọc lặp lại Khi trình PCR diễn ra, ADN tạo từ ADN khuôn ban đầu tiếp tục sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử ADN tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền mẫu DNA khuếch đại theo cấp số nhân  Một phản ứng PCR bao gồm giai đoạn: Giai đoạn khởi đầu: (Chỉ cần enzyme ADN polymerase bắt buộc phải kích hoạt nhiệt độ) Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 9496°C (hay 98°C sử dụng polymerases bền nhiệt) tiến hành 1-9 phút Giai đoạn biến tính: bước chu kỳ trình tăng nhiệt độ lên 94-98°C 20-30 giây ADN biến tính cách phá vỡ liên kết hydro bazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn Giai đoạn gắn mồi: hạ nhiệt độ xuống khoảng từ 45-600C để gắn kết chuỗi mồi, cho phép chuỗi mồi đặc hiệu gắn lại đoạn DNA vị trí có mã tương đồng Giai đoạn kéo dài: tác dụng enzyme taq polymerase thực 720C (nhiệt độ tối ưu cho hoạt động taq) Tiến hành sinh tổng hợp DNA vị trí có đoạn mồi theo chiều5’-3’ Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn thực nhiệt độ 4-15°C thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm phản ứng 3) Quy trình + Pha mix a) Pha mix PCR thực nhân vùng 16S DNA với thành phần cho phản ứng bảng bên Thành phần BiH2O Buffer 5X Mồi xuôi 27F (10pmol) Mồi ngược 1492R (10pmol) (5unit/1 µL) DNA khn Pha mix cho nhóm sinh viên: - Hút 78,75 µL BiH20 vào tuýp 1.5ml - Tiếp tục hút 25 µL buffer 5X - Hút µL mồi 27F - Hút µL mồi 1492R - Hút 1.25µL Taq polymerase - Trộn hỗn hợp mix sau hút 23µL vào ống tuýp 0.2ml - Hút 2µL DNA mẫu vào tuýp 0.2mL - Tiến hành PCR với máy PCR với chu kì nhiệt sau: Hình Chu kỳ nhiệt PCR b) Điện di sản phẩm PCR 16S DNA Bước Dùng micropipette (2-20µL) hút 10 μL phần dung dịch tuýp PCR cần điện di trộn với 2µL loading buffer giấy parafim Bước Tiếp tục dùng micropipette hút hết phần dung dịch vừa trộn, bơm vào giếng bảng gel agarose (1,5%) bơm thang chuẩn Bước Đặt vào khay điện di Chạy điện di với hiệu điện 100 V Theo dõi gel điện di, không để phần mẫu chạy khỏi bảng gel  Bước Sau hoàn tất q trình điện di, chụp hình gel phân tích kết Kết hình gel Hình Kết điện di  Nhận xét - Mẫu nhóm có tổng cộng 10 giếng, qua kết ta thấy giếng 3,4,7,8,10 có xuất band nhiên độ rõ rệt band không đồng chứng tỏ độ tinh DNA nhóm có khác biệt, band giếng số 4,10 mờ có độ tinh thấp so với band giếng số 3,4,7,8,10 Ở giếng cịn lại khơng xuất band chứng tỏ mẫu khơng cịn DNA lượng DNA q ít, ngun nhân thao tác ly trích DNA chưa DNA khơng giải phóng, q trình hút dịch DNA sau ly tâm khơng xác - Quan sát giếng ta thấy mẫu DNA tinh khơng cịn lẫn tạp chất III KHẢO SÁT VÙNG 16S - rDNA BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN Mục đích nguyên lí  Mục đích: Khảo sát đa dạng tiến hóa mẫu vi khuẩn việc sử dụng enzyme cắt giới hạn chuyên biệt  Nguyên lí: RFLP hay cịn gọi kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn, kỹ thuật sử dụng endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen trình tự nhận biết đặc trưng tạo hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác định, số lượng đoạn phụ thuộc vào số điểm nhận biết hệ gen Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định tính trạng trạng thái đồng hợp dị hợp thể Vì vậy, RFLP thị tin cậy phân tích liên kết chọn giống Tuy nhiên, kỹ thuật có nhược điểm tốn thời gian, sử dụng phóng xạ, địi hỏi phải có lượng DNA lớn (50 – 200 ng từ cá thể) Enzyme cắt giới hạn (RE) nhân tố kỹ thuật RFLP RE enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu RE diện tế bào vi khuẩn hệ thống bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại xâm nhập virus Hiện RE chia thành nhóm tùy theo tính chất cắt sợi DNA chúng Trong nhóm I nhóm III khơng cắt vị trí nhận biết Nhóm II nhóm RE cắt vị trí nhận biết, thường vị trí nhận biết nhóm từ – 12 cặp nucleotide Đây nhóm RE ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử Hiện có khoảng hon 3400 RE phân lập có 540 RE thương mại hóa Vật liệu hóa chất Dụng cụ thiết bị - Bộ điện di chiều - Máy chụp gel đọc hình BioRad UV 2000 - Máy ủ nhiệt - Gel agarose 1.5% - Micropipette - Hộp nước đá - Tuýp eppendoft Hóa chất - BiH2O - Buffer vàng 10X - Enzyme cắt giới hạn SmaI - Sản phẩm PCR - Loading buffer Enzyme RE SmaI Quy trình 1) Chuẩn bị tuýp 1,5 mL 2) Pha mix phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn theo bảng đây: ∑=15µL 3) Chia hỗn hợp mix cho tuýp (mỗi tuýp µL) 4) Hút µL sản phẩm PCR vào tube 5) Ủ 37oC 6) Trộn mẫu với dung dịch thuốc nhuộm µL Loading buffer 7) Load mẫu vào gel tiến hành điện di 8) Chụp hình gel ghi nhận kết Kết hình gel Hình Kết điện di 10 M Với: M : Mẫu đối chứng Nhóm 1: 1,2,3 Nhóm 2: 4,5,6 Nhận xét: - Nhóm có mẫu mẫu có band, cịn band cịn lại bị lỗi nguyên nhân buffer pha lỗi, cho nhiều thuốc nhuộm màu lúc chạy gel, bơm DNA trôi ngồi  - Hình 3, band 1,3 có band có kích thước Các enzyme cắt giới hạn cắt vị trí đặt hiệu Hai mẫu có chứa đoạn gene 16S rDNA vi khuẩn - Các band 4,5,6 trình thao tác bị sai nên khơng có DNA mẫu, khiến enzyme khơng thể cắt, dẫn đến không xuất band 11 12 ...BÀI PHÚC TRÌNH PHÂN TÍCH VÙNG GEN 16S DNA CỦA VI KHUẨN BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN I LY TRÍCH DNA CỦA VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỐC NHIỆT Mục đích - Khảo sát đa dạng dịng vi khuẩn đặc... hóa mẫu vi khuẩn vi? ??c sử dụng enzyme cắt giới hạn chuyên biệt  Nguyên lí: RFLP hay cịn gọi kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn, kỹ thuật sử dụng endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen trình. .. Reaction) truyền thống đa dạng hệ thống RE ( enzyme cắt giới hạn) Trong phương pháp vùng DNA quan tâm khuếch đại mồi chuyên biệt nhờ phản ứng PCR Vùng DNA sau khuếch đại cắt enzyme cắt giới hạn Phương