Xác định đặc tính di truyền học trên gen 16s của chủng vi khuẩn haemophilus paragallinarum gây bệnh phù đầu gà phân lập tại Ba Vì, Hà Nội năm 2017.pdf

4 n Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN HỌC TRÊN GEN 16S CỦA CHỦNG VI KHUẨN HAEMOPHIL US PARA GALLINAR UM GÂY BỆNH PHÙ ĐÀU GÀ PHÂN LẬP TẠI BA VÌ, HÀ NỘI NĂM 2017 Sinh viên thực : Nguyễn Thị Bích Thuận Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học TP.HCM, tháng năm 2018 Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG csLQso LUẬN VĂN TĨT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN HỌC TRÊN GEN 16S CỦA CHỦNG VI KHUẨN HAEMOPHIL US PARA GALLINAR UM GÂY BỆNH PHÙ ĐẦU GÀ PHÂN LẬP TẠI BA VÌ, HÀ NỘI NĂM 2017 Sinh viên thực : Nguyễn Thị Bích Thuận Mã số sinh viên :1411533085 Lóp : 14DSH02 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giáo viên huớng dần : TS Thân Văn Thái TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Đe hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em bày tỏ lời cảm on sâu sắc đến thầy TS Thân Văn Thái tận tình hướng dần, sửa chừa sai sót, tạo điều kiện giúp đõ em có the hồn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu tồn thể thầy Khoa Cơng nghệ sinh học Môi trường - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành truyền đạt kiến thức chuyên môn năm qua Em xin gửi lời cám ơn đến anh, chị, bạn bè Trung tâm Công nghệ sinh học giúp đờ động viên trình làm thí nghiệm hồn thành khóa luận Con xin cảm ơn ba mẹ người thân gia đình hồ trợ động viên suốt trình học tập hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Bích Thuận Khoa Cơng nghệ Sinh học Môi Trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv TÓM TẮT vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC HÌNH X DANH SÁCH BẢNG xi ĐẶT VÁN ĐỀ .1 Tính cấp thiết đề tài CHƯƠNG TÒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tống quan H paragallincưum 1.1.1 Đặc điểm chung vi khuẩn H paragallỉnarum 1.1.2 Phân loại khoa học 1.1.3 Sức đề kháng 1.1.4 Yếu tố độc lực 1.1.5 Bệnh tích .6 1.1.5.1 Bệnh tích đại thể 1.1.5.2 Bệnh tích vi thể 1.2 Tổng quan bệnh phù đầu gà 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Triệu chứng bệnh 1.2.3 Con đường lây truyền 1.2.4 Dịch tề học 1.3 Các nghiên cứu nước 1.3.1 Nghiên cứu nước 1.4 Phương pháp PCR 10 1.4.1 Lịch sử hình thành 10 1.4.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 11 1.5 Thành phần phản ứng 11 iv 1.5.1 Trình tự DNA cần nhân 11 1.5.2 Đoạn mồi (Primer) 12 1.5.3 dNTP (deoxy nucleoside triphosphate) 12 1.5.4 Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt 12 1.5.5 Dung dịch đệm cho phản ứng PCR 13 1.5.6 Chu kỳ nhiệt 13 1.6 ứng dụng phương pháp PCR 14 1.7 Những hiểu biết gene 16S rRNA 15 1.8 Điện di 16 1.8.1 Nguyên lý chung .16 1.8.2 Các kỳ thuật điện di 17 1.9 Kỹ thuật giải trình tự gen 17 1.10 Xây dựng phát sinh loài 18 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19 2.1 Nơi thực 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Đối tượng nghiên cứu 19 2.4 Vật liệu nghiên cứu 19 2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 19 2.4.2 Hóa chất thuốc thử 20 2.5 Các môi trường sử dụng 20 2.5.1 Môi trường thạch BHI (Brain Heart Infusion Broth) 20 2.5.2 Môi trường BHI lỏng 21 2.5.3 Môi trường BHI - agar - máu cừu 21 2.6 Phương pháp nghiên cứu 21 2.6.1 Phương pháp nuôi cấy chủng H.paragallinarutn 21 2.6.1.1 Khử trùng, vệ sinh tủ cấy 21 2.6.1.2 Cấy ria que cấy 22 2.6.2 Nuôi tăng sinh môi trường lỏng 22 2.6.3 Phương pháp nhuộm Gram tế bào vi khuẩn .22 2.6.4 Phương pháp tách chiết DNA 23 V 2.6.5 Giám định loài vi khuấn H paragallinarum nuôi cấy theo phương pháp phát gene 16s RNA kĩ thuật PCR 24 2.6.5.1 Cặp mồi sừ dụng cho PCR 24 27F: 5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3’ 24 1492R: 5’ - TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3’ 24 2.6.5.2 Các thành phần cùa phản ứng PCR 24 2.6.5.3 Quy trình thực 24 2.6.6 Phương pháp điện di 25 2.6.6.1 Chuân bị gel agarose nông độ 1% 25 2.6.6.2 Bơm mẫu vào giếng chạy điện di .25 2.6.6.3 Soi mẫu 25 2.6.7 Phương pháp xây dựng phả hệ 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết nuôi cấy vi khuẩn H paragallinarum 27 3.1.1 Ket nuôi cấy vi khuan H paragallinarum môi trường thạch 27 3.1.2 Kết nuôi tăng sinh vi khuẩn H paragallinarum môi trường lỏng 29 3.2 Kết kiểm tra đặc điểm hình thái vi khuẩn H paragallinarum 29 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR 30 3.4 Kết giải trình tự sản phấm PCR 31 3.5 Ket kiếm tra BLAST trình tự chùng vi khuan H paragallinarum 31 3.6 Ket xây dựng phát sinh loài 31 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 Kết luận 35 Đe nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHAO 36 PHỤ LỤC 37 vi TÓM TẮT Đe tài “Xác định đặc tính di truyền học gen 16S chung vi khuẩn Haemophilus paragallinarum gây bệnh phù đầu gà phân lập Ba Vì, Hà Nội năm 2017” thực từ tháng 2/2018 đến tháng 8/2018 phịng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Cơng nghệ sinh học Môi trường, Đại học Nguyễn Tất Thành, tọa lạc số 2374 Ọuốc lộ 1A, phường Trung Mỳ Tây, quận 12, Tp.Hồ Chí Minh Nội dung đề tài: Xác định đặc tính di truyền học gen 16S chủng vi khuẩn H paragaỉlinarum gây bệnh phù đầu gà phân lập Ba Vì, Hà Nội năm 2017 phưong pháp xác định phát sinh loài Kết đạt được: Xác định đặc tính ni cấy chủng vi khuẩn H paragallinarum hai loại môi trường (BHI-agar BHI-agar-máu cừu) với đặc điểm khuấn lạc đều, tốc độ phát triển khuấn lạc hai loại môi trường tương đối nhanh Ket nhuộm gram cho thấy chủng vi khuẩn H paragallinarum bắt màu hồng đặc trưng vi khuẩn Gram âm, có hỉnh que, đứng riêng lẻ song song Đặc điếm di truyền dựa trình tự gen 16S cho thấy chủng vi khuẩn H paragallinarum nghiên cứu phân bố nhóm với chủng vi khuan H paragallinarum từ nhiều nước giới Đan Mạch, Tây Ban Nha, Mỳ, Đức, Mexico úc Trong đó, chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng cao với chủng Đan Mạch (accession numbers: AF487726) Tây Ban Nha (accession numbers: DQ22907) từ dự đốn chủng vi khuẩn H paragallỉnarum có chung nguồn gốc vii SUMMARY The project title "Genetic characterization based on the 16S gene of a Haemophilus paragallinarum strain isolated in chicken in Ba Vi, Hanoi in 2017" was performed in 2- 8/2018 in Microbiology laboratory, Department of Biotechnology and Enviroment, Nguyen Tat Thanh University, 2374, National road 1A, Trung My Tay Ward, Diet 12, Ho Chi Minh City Project content: Genetic characterization of 16S gene of a H paragallin arum strain isolated in chicken in Bavi, Hanoi in 2017 by using phylogenetic analysis Results: The H paragallinarum strain was isolated in two difference media (the BHI-agar and BHI-agar-sheep blood media) Observation of the clones indicated that the clones grown well in these two media The gram staining result indicated that the H paragallinarum strain was pink stained as the other gram-negative bacteria, with rod-shape, and isolate /or stick together Genetic characterization of the 16S gen showed that the study strain was closely related to the strains isolated from many countries around the world, including Denmark, Spain, USA, Germany, Mexico and Australia In particular, the study strain shared most closely to the strains isolated in Denmark (accession numbers: AF487726) and Spain (accession numbers: DQ22907), suggesting that these strains may share common ancestor viii DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT A.paragallinarum A vibacterium paragallinarum H.paragallinarum Haem oph ilus paragallina rum NAD Nicotinamide adenine dinucleotide BHI Brain Heart Infusion Broth PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid DNA Deoxyribonucleic Acid TBE Tris - Borate - EDTA Taq Thermus aquaticus NCBI National Centre for Biotechnology Information Bp Base pair dNTP Deoxyribounucleotide triphosphate ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng mơ vi khuấn H paragallỉnarum Hình 1.2 Vi khuẩn H paragallinarum soi kính hiến vi theoWikipedia Hình 1.3 Gà bị nhiễm bệnh vi khuẩn H.paragallỉnarum gây Hình 1.4 Cấu trúc 16S rRNA từ vi khuẩn Woese năm 1987 Hình 2.1 Ria cấy vi khuẩn H paragallinarum Hình 3.1 Hình thái vi khuẩn H.paragallỉnarutn ni cấy mơi trường thạch BHI - agar BHI - agar - máu cừu Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc H paragallinarum mơi trường thạch máu cừu Hình 3.3 Ni tăng sinh vi khn H.paragallinarutn mơi trường lỏng Hình 3.4 Hình thái vi khuẩn H.paragallinarum kính hiển vi (100X) Hình 3.5 Ket điện di sản phẩm PCR Hình 3.6 Ket BLAST trình tự chủng vi khuẩn H paragallinarum Hình 3.7 Cây phát sinh lồi chủng vi khuẩn H paragallinarum X ... học gen 16S chủng vi khuẩn H paragaỉlinarum gây bệnh phù đầu gà phân lập Ba Vì, Hà Nội năm 2017 phưong pháp xác định phát sinh loài Kết đạt được: Xác định đặc tính ni cấy chủng vi khuẩn H paragallinarum. .. PHỤ LỤC 37 vi TÓM TẮT Đe tài ? ?Xác định đặc tính di truyền học gen 16S chung vi khuẩn Haemophilus paragallinarum gây bệnh phù đầu gà phân lập Ba Vì, Hà Nội năm 2017” thực từ tháng... tài: ? ?Xác định đặc tính di truyền học gen 16S cùa chùng vi khuẩn H paragaỉlinarum gây bệnh phù đầu gà phân lập Ba Vì, Hà Nội năm 2017” CHƯƠNG TĨNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan H paragaỉlinarum Đặc