m ■ ■— Iffi VIỆN ĐẠI HỌC MÒ HÀ NỘ1 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đe tài TUYẾN CHỌN CHỦNG VI NẤM NỘI SINH SINH CÓ KHẢ NÀNG SINH TÓNG HOP HUPERZINE A TRONG CÂY THẠCH TỪNG RĂNG CƯA PHÂN BÓ.
m - ■ ■— - Iffi VIỆN ĐẠI HỌC MÒ HÀ NỘ1 KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP Đe tài: TUYẾN CHỌN CHỦNG VI NẤM NỘI SINH SINH CÓ KHẢ NÀNG SINH TÓNG HOP HUPERZINE A TRONG CÂY THẠCH TỪNG RĂNG CƯA PHÂN BÓ Ở SA PA - VIỆT NAM Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Thị Minh Thành Sinh viên thực : Lưu Thùy Linh Lớp : CNSH 13-02 Hà Nội-2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Thị Minh Thành - Phó Giám đốc Trung tâm Giống Bào tồn nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người truyền cho cm phương pháp học tập nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dần, chi báo giúp đõ em suốt trình nghiên cứu vừa qua Em xin cám ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học - Viện đại học Mở Hà Nội truyền đạt cho em kiến thức tạo điều kiện thn lợi cho em hồn thành khóa luận Em xin gứi lời cảm ơn đến Ths Mần Hồng Phước Ks Hồng Thị Hồng Anh tận tình chi bảo, hướng dẫn cho cm kiến thức em bất đầu làm quen với kỹ thuật liên quan đến khóa luận tốt nghiệp cùa Đồng thời, em gừi lời cám ơn tới cô chú, anh chị, bạn Trung tàm giống báo tồn nguồn gen vi sinh vật giúp đỡ em nhiều thời gian thực tập Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời căm ơn sâu sắc ln giúp đỡ, động viên chúng em suốt thời gian học tập Hà Nội, ngày tháng năm2017 Sinh viên Lưu Thùy Linh Lưu Thùy Linh CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI MỤC LỤC MỜ ĐẦU PHÀN 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Tống quan Thạch tùng cưa 10 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu .10 1.1.2 Phán loại khoa học .11 1.1.3 Mô tá 11 1.2 Tong quan hoạt chat Huperzin A Thạch tùng cưa 12 1.2.1 Cấu trúc 12 1.2.2 Cơ chế hoạt động 12 1.3 Tổng quan vi nấm nội sinh thực vật 14 1.3.1 Khái niệm nấm nội sinh thực vật 14 1.3.2 Quan hệ vi nấm nội sinh thực vật 14 1.3.3 1.4 ưng dụng vi nâm nội sinh 15 Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh Thạch tùng cưa sinh tống hợp hoạt chat Huperzine A nước Thế giới 19 1.4.1 Tình hình nghiên cứu Thế giới 19 1.4.2 Các nghiên cứu nước 20 1.5 Nghiên cứu định danh vi nấm 20 1.5.1 Định danh vi nấm nội sinh theo phương pháp truyền thống 20 1.5.2 Định danh phương pháp kỹ thuật sinh học phán tử 22 1.6 Phương pháp đo quang phổ uv -VIS 28 ỉ 6.1 Khái niệm 28 1.6.2 1.6.3 1.7 1.7.1 Nguyên tắc hoạt động 29 ửngdụng 29 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC 30 Khái niệm 30 1.7.2 Nguyên tắc hoạt động 31 1.7.3 ứng dụng HPLC 32 Lưu Thùy Linh CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 33 2.1 Thời gian, địa điểm đối tượng nghiên cứu 33 2.1.1 Thời gian địa điềm 33 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 33 2.2 Hóa chất 33 2.2.1 Hóa chất dung dịch 33 2.2.2 Trang thiết bị thí nghiệm 33 2.2.3 2.3 2.3.1 Môi trường dung dịch 34 Phương pháp nghiên cứu 35 Phương pháp hoạt hóa thu sinh khối vi nam 35 2.3.2 Phưovg pháp tách chiết 35 2.3.3 Phương pháp xác định khả sinh tổng hợp Huperzine A vi nam nội sinh từ Thạch tùng cưa 36 2.3.4 Định danh vi nam nội sinh hang phương pháp truyền thong 40 PHÂN 3: KÉT QUÁ VÀ THÁO LUẬN 41 3.1 Ket hoạt hóa nhân ni chủng vi nấm nghiên cứu 41 3.2 Kết đánh giá sinh tổng hợp Hupcrzine A từ nấm nội sinh Thạch tùng cưa phân bố Sa Pa 47 3.2.1 Kết tách chiết nấm nội sinh từ Thạch tùng cưa phân bố SaPa 47 3.4 Ket định danh chùng vi nấm sinh tổng hợp Huperzine A 55 3.4.1 Ket định danh theo phương pháp truyền thống 55 3.4.2 Kết định danh phân tích trình tự vùng rADN - ITS 57 PHÀN 4: KÉT LUẬN VÀ KIẺN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHÁO 61 Lưu Thày Linh CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ AND Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic B1AST Basic Local Alignment Search Tool AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Dcoxycytidinc triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dTTP Dcoxythymidinc triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ETS External transcribed spacer HTKL Hình thái khuấn lạc ITS Internal transcribed spacer NCBI National Center for Biotechnology Informatic PDA Potato Dextrose Agar PCR Polymerase chain reaction rADN ribosomal acid deoxyribonucleic rARN ribosomal acid ribonucleic SDS Sodium Dodecyl Sulfate Taq Thermus aquaticus Tm Melting temperature Lưu Thùy Linh CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây thạch tùng cưa [43] 11 Hình 1.2: cấu trúc hóa học chất Huperzine A [ 13] 13 Hình 1.3: Sơ đồ vùng rADN - ITS cùa nấm 26 Hình 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩnlạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL 1.41 Hình 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩnlạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTK.L 2.41 Hình 3.3: Đặc điếm hình thái khuấnlạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL 3.42 Hình 3.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL4 42 Hình 3.5: Hình ảnh dịch chiết nấm số chủng vi nấm phân lập từ Thạch tùng cưa phân bố Sa Pa .47 Hình 3.6: Hình ánh sinh khối nấm (bôn trái) dịch chiết nấm (bên phải) 52 cúa chúng T44c 52 Hình 3.7: Hình ảnh khối chat Huperzine A (bên trái) dịch chiết nấm chùng T44C (1: Ầ = 210nm 2:Ầ = 230nm 3:Ầ=310nm) 52 Hình 3.8: Hình ảnh so sánh khối phố chủng nấm T44c mầu chất chuẩn Hupcrzinc A (1: Ầ = 210nm 2: Ầ = 230 nm Ầ = 310 nm) 53 Hình 3.9: sắc ký đồ HPLV (uv 310 nm ) 54 cùa chất chi thị Huperzine A (A) T44C (B) 54 Hình 3.10: Hình thái khuẩn lạc chúng nấm nội sinh T44C 56 Hình 3.11: Vi hình thái cúa chúng nấm T44C 56 Hình 3.12: Kết điện di sản phấm PCR chủng vi nấm T44C gcl agarose 1% (1: Chúng T44C, 2: Marker) 57 Hình 3.13: Kết giá trình tự gen chùng nấm T44C 58 Lưu Thùy Linh CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI DANH MỤC BẢNG Báng 3.1: Ket q phân nhóm hình thái khuân lạc nấm nội sinh hoạt hóa 42 từ Thạch tùng cưa Sa Pa 42 Bàng 3.2: Kct quà hoạt hóa chủng vi nấm nội sinh từ Thạch tùng cúa phân bố Sa Pa 44 Báng 3.3: Kết đo quang phồ ƯV - VIS mẫu chiết nấm nghiên cứu48 Báng 3.4: Bảng thời gian lưu phân tách peak sắc ký đồ chất chuẩn Huperzine A (A)và chủng vi nấm T44C (B) 54 Báng 3.5: Mức độ tương đồng gen ITS1 cùa chủng nấm T44C so sánh GenBank 58 Lưu Thùy Linh CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI MỊ ĐẦU Tính cấp thiết: Bệnh Alzeimer chứng rối loạn thần kinh thối hóa, gây ảnh hưởng tới 20 triệu người Thế Giới có khoảng 4-5 triệu người Mỹ Hiện bệnh coi nguyên nhân thứ gây chết nước phát triển chì sau bệnh tim ung thư Tuy nhiên chưa có phương thức điều trị cho Alzeimer Việc sử dụng chất ức chế enzyme cholinesterase (AChEI) chiến lược chấp nhận đế điều trị bệnh Alzeimer Trong chương trinh nghiên cứu báo tồn phát triến nguồn gen quý thực vật Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) biết nhiều Trung Quốc tên Qian Ceng Ta Mỹ Châu Au, Huperzia serrata sử dụng bô sung chế độ ăn uống đế tăng cường trí nhớ tăng cường nhận thức cho hệ thần kinh trung ương Hoạt chất có Thạch tùng cưa Huperzine Hầu hết Huperzine A sủ dụng loại thuốc tháo dược chiết xuất từ H.serrata số loài khác họ Thạch sam [13] Tuy nhiên, H serrata khác họ Thạch Sam yêu cầu điều kiện canh tác ngặt nghèo sinh trưởng phát triển chậm, phải mat nhiều năm (có lên đến 15 năm) phát triển tự nhiên có thề để sử dụng làm thuốc Chính vậy, nguồn cung cấp hoạt chat Huperzine A từ Thạch tùng cưa làm nguyên liệu cho sàn xuất thuốc không cao (khoảng 0,1%) Bởi vậy, có nhiều nỗ lực để thực việc sàn xuất Hupcrzine A nuôi cấy in vitro H serrata tống hợp hóa học[27] Nấm nội sinh thực vật thường sinh trướng, phát triến nội sinh hồn tồn phần mơ cùa tế bào chú, thường không gây triệu chứng rõ ràng bệnh[25] Một số nấm nội sinh kích thích tăng trưởng thực vật sản xuất chất có hoạt tính sinh học với chức hoạt Lưu Thùy Linh CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI động chuyển hóa Một số nấm nội sinh tìm thấy nguồn tiềm thuốc trị điều trị bệnh [26],Gần đây, nấm nội sinh phân lập từ loại trồng chấp nhận nguồn nguyên liệu quan trọng cúa ngành công nghiệp dược Một lượng lớn họp chất có cấu trúc hoạt tính sinh học khác chiết xuất từ nấm nội sinh [16], Việc nghiên cứu vi nấm nội sinh Thạch tùng cưa sân sinh Hupcrzinc A sc mang đến hiệu to lớn việc thu nhận hoạt chất Hupcrzinc A , tiết kiệm thời gian chi phí hon phương pháp chiết xuất từ Hiện giới, nhà khoa học Trung Quốc - nơi sản xuất nhiều Huperzine A làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược điều chế thuốc hỗ trợ chừa trị bệnh Alzheimer - tiến hành nghiên cứu phân lập số chúng nấm nội sinh có khả sản sinh hoạt chất Huperzine A , chúng nghiên cứu điều kiện lên men đê có thê tách chiêt lượng lớn Huperzine A phục vụ cho ngành công nghiệp dược hồ trợ điều trị bệnh Alzheimer Ớ Việt Nam, Thạch tùng cưa phát Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1.000 m Đây loài dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách "đị" Chương trình Nghiên cứu bào tồn phát triển nguồn gen băn địa quý thuốc, chưa quan tâm nghiên cứu khai thác úng dụng điều trị bệnh Việt Nam Mặt khác, nghiên cứu nấm nội sinh Thạch tùng cưa Việt Nam chưa có cơng bố Vì vậy, đề tài “ Tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả sinh tổng họp Huperzine A từ Thạch tùng cưa phân bố Sa Pa - Việt Nam” thực với hy vọng mở hướng việc nghiên cứu chúng nấm nội sinh có khả sân sinh hoạt chất Huperzine A nhằm hướng tới nguồn nguyên liệu lớn có hiệu kinh tế cho ngành công nghiệp dược nước điều trị bệnh rối loạn trí nhớ Việt Nam Lưu Thùy Linh CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Mục tiêu đề tài: Tuyền chọn chủng vi nấm nội sinh có khả sinh tổng hợp Huperzine A phân lập từ Thạch tùng cưa phân bố Sa Pa, Việt Nam Nội dung nghiên cứu: - Hoạt hóa chúng vi nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng cưa Sa Pa, Việt Nam - Sàng lọc chúng vi nấm nội sinh có khả tồng hợp Huperzine A từ chúng vi nấm nội sinh - Định danh chúng vi nấm nội sinh phương pháp truyền thống sinh học phân tứ Lưu Thùy Linh CNSLỈ 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 14 Lsp 21 PDA 62 15 Rsp PDA 16 Rsp PDA 17 Rsp 5.3 PDA 18 Tsp PDA Tsp33 PDA 63 Tsp36 PDA 64 Tsp37 PDA 5 65 Tsp 39 PDA 66 Tsp 43 PDA 19 Tsp PDA 67 Tsp 46 PDA 20 Tsp7 PDA 68 Tsp 49 PDA 21 Tsp 10 PDA 69 Tsp51 PDA 22 Tsp 12 PDA 70 Tsp 54 PDA 23 Tsp 13 PDA 71 Tsp 57 PDA 24 Tsp 17 PDA 10 72 Tsp61 PDA 25 Tsp 19 PDA 73 Tsp 63 PDA 26 Tsp 20 PDA 74 Tsp 66 PDA 27 Tsp 22 PDA 75 Tsp58 PDA 28 Tsp 23 PDA 76 Lsp PDA 29 Tsp 25 PDA 77 Lsp PDA 30 Tsp 26 PDA 78 Lsp PDA 31 Tsp 30 PDA 79 Lsp PDA Lưu Thùy Linh 45 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 32 Tsp31 PDA 80 Lsp PDA 33 Tsp 35 PDA 81 Lsp PDA 34 Tsp38 PDA 82 Lsp PDA 35 Tsp 42 PDA 83 Lsp 11 PDA 36 Tsp 44 PDA 84 Rsp PDA 37 Tsp 48 PDA 85 Rsp 5.1 PDA 38 Tsp 50 PDA 86 Rsp PDA 39 Tsp 52 PDA 87 Rsp PDA 40 Tsp 53 PDA 10 88 Tsp 14 PDA 10 41 Tsp 56 PDA 10 89 Tsp 32 PDA 10 42 Tsp59 PDA 90 Tsp 62 PDA 43 Tsp 64 PDA 91 Tsp 65 PDA 44 Tsp 67 PDA 92 Lsp PDA 45 Lsp PDA 93 Lsp 10 PDA 46 Lsp 12 PDA 94 Lsp 15 PDA 47 Lsp 16 PDA 95 Lsp 18 PDA 48 Lsp 19 PDA 96 Lsp 20 PDA Lưu Thùy Linh 46 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 3.2.2 Kết đo quant’ phố uv - V1S kiểm tra hoạt tính sinh tổng hợp Huperzine A chủng nấm phân lập từ Thạch tùng cưa phân bố Sa Pa Dựa vào khối phổ cúa chất chuẩn Huperzine A đo quang phổ uv VIS để đánh giá khả sinh tồng hợp Hupcrzinc A mẫu dịch chiết nấm nghiên cứu Chat chuan Huperzine A có độ hấp thụ quang lớn bước sóng 210, 230 310 nm 96 mẫu dịch chiết nấm từ 96 chủng nấm nội kiêm tra khả sinh tống hợp Huperzine A phương pháp đo quang phổ uv - VIS vùng khối phổ có bước sóng 190 350 ntn Từ hình ành khối phố đo cúa mẫu chiết nấm so sánh với khối phố chất chuẩn Huperzine A để kiếm tra hoạt tính sinh tổng hợp Huperzine A Ket thu được biểu bàng 3.3 Bảng 3.3: Kết đo quang phổ uv - VIS mẫu chiết nấm nghiên cứu STT Bước sóng hấp thụ Chủng 210nm 230nm 310nm Tsp2 + - - Tsp 5v + - - Tsp 15 - + - Tsp 18 - + - Tsp 34 + + - T44C + + + Tsp 11 - + - Tsp 45 + - - Tsp 47 + - - 10 Tsp 55 + + - 11 Tsp 60 - + - 12 Lsp 17 + - - 13 Lsp 17.1 + + - 14 Lsp 21 - + - Lưu Thày Linh 48 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 15 Rsp + - - 16 Rsp - + 17 Rsp 5.3 - + - 18 Tsp + - - 19 Tsp + - - 20 Tsp7 + - - 21 Tsp 10 - + - 22 Tsp 12 - + - 23 Tsp 13 + + - 24 Tsp 17 - + - 25 Tsp 19 - + - 26 Tsp 20 + - - 27 Tsp 22 - + - 28 Tsp 23 + - - - - 29 Tsp25 - + 30 Tsp 26 - + 31 Tsp 30 - + - 32 Tsp31 - + - 33 Tsp35 + - - 34 Tsp 38 + - - 35 Tsp 42 - + - 36 Tsp 44 + - - 37 Tsp 48 - + - 38 Tsp 50 - + - 39 Tsp 52 - + - 40 Tsp 53 - + - 41 Tsp 56 - + - 42 Tsp 59 - + - 43 Tsp 64 + - - 44 Tsp 67 + - - Lun Thùy Linh 49 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 45 Lsp + - - 46 Lsp 12 - + 47 Lsp 16 - + - 48 Lsp 19 - + 49 Lsp + + - 50 Rsp + + - 51 Rsp 5.2 - + - 52 Tsp - + - 53 Tsp 4h - + - 54 Tsp8 - + - 55 Tsp9 + + - 56 Tsp 16 + - - 57 Tsp21 - + - 58 Tsp 24 - + - + - + - 59 Tsp 27 60 Tsp28 + 61 Tsp 29 + - - 62 Tsp 33 + - - 63 Tsp36 - + - 64 Tsp 37 - + - 65 Tsp39 - + - 66 Tsp 43 - + - 67 Tsp 46 - 68 Tsp 49 + + - - 69 Tsp51 - + - 70 Tsp 54 + - - 71 Tsp 57 - + - 72 Tsp61 + Tsp 63 - + - 73 74 Tsp 66 - + - Lun Thùy Linh 50 - CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Tsp 58 + - - 76 Lsp + - - 77 Lsp - + - 75 78 Lsp - + 79 Lsp + - - 80 Lsp - + - 81 Lsp + - - 82 Lsp - + - 83 Lsp 11 - + - 84 Rsp - + - 85 Rsp5.1 + - - 86 Rsp + - - 87 Rsp - + - 88 Tsp 14 - + - 89 Tsp32 + Tsp 62 - + - 90 91 Tsp 65 + + - 92 Lsp + - - - 93 Lsp 10 - + 94 Lsp 15 - + - 95 Lsp 18 + - - 96 Lsp 20 - + - Ghi chú: ( + ): Có hấp thụ (-): Không hấp thụ Từ kết báng 3.3 cho thấy, hấp thụ ánh sáng cùa dịch chiết nấm từ 96 chủng nấm khác Trong đó: -33 mẫu dịch chiết nấm từ 33 chủng vi nấm có dài khối phổ hấp thụ bước sóng cực đại 210nm Ví dụ số chủng nấm nội sinh đại diện: Lsp 3, Tsp 32, Rsp 6, Rsp 5.1, Lsp 8, Lsp 5, Lun Thùy Linh 51 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Peak 2.025 2.148 1741 3.40 374 Peak 2.342 18861 36.80 5970 Peak 2.500 6736 13.15 718 Peak 3.055 14038 27.39 1390 5.381 Các phổ mẫu chuẩn xác định thời gian lưu mẫu chuẩn peak sau: peak 1.696, peak 2: 2.025, peak 3: 2.385, peak 4: 2.616, peak 5: 3.055 Phổ mẫu dịch chiết nấm T44C theo peak 1, 2,3,4,5 là: 1.696; 2.025; 2.342; 2.500; 3.055 Như vậy, thời gian lưu mẫu chuẩn HupA mẫu thử dịch chiết T44C tương đương nên khẳng định có mật cũa HupA dịch chiết chủng vi nấm T44C 3.4 Kết định danh chủng vi nấm sinh tổng hợp Huperzine A 3.4.1 Ket định danh theo phương pháp truyền thống Sau tuyến chọn chùng vi nấm nội sinh Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt T44C có khă sinh hoạt tính Huperzine A Cần tiến hành định danh bàng phương pháp truyền thống đế định danh chúng T44C Chùng T44C nuôi cấy môi trường thạch PDA đê quan sát hình thái khuấn lạc Đồng thời, quan sát hệ sợi T44C kính hiến vi đe nhận dạng vi hình thái cúa chúng T44C Từ đó, đưa kết nhận dạng sơ chúng T44C Ket hình 3.10 3.11 Lun Thùy Linh 55 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI stollii CBS 408.93 Talaromyces vữidulus NR 103663 100 98 NR_ 103669 100 97 NR_ 103665 100 99 CBS 252.87 Taỉaromyces diversus CBS 320.48 Talaromyces caìidicanius CBS 112002 Từ số liệu bảng 3.5 cho kết quả: Chùng nấm T44C xác định Talarotnyces calidicanius (có độ tương đồng 99% so với chúng Talaromyces calidicanìus) Theo phưcmg pháp định danh truyền thống T44C thuộc chi Penicillium Chi Talaromyces thuộc ngành Ascomycota, lớp Eurotiomycetes, họ Eurotiales Chi Talaromyces biết đến lần năm 1955, nhà khoa học người Mỹ Chester Ray Benjamin phát phân chi cùa chi Penicillium (dựa vào sinh sán hữu tính trình tự ITS) Talaromyces calidicanius định danh Yilmaz cộng năm 2011 trước Chen cộng (2002) định danh Penicillium calidìcanius Chủng xác định có khả sinh tống hợp duclauxin số hoạt chất liên quan hồ trợ phòng chống ung thư Các nhà khoa học Trung Quốc (2010) phân lập chúng Peniciỉlium chrysogenum Thom (Patent CN101914452A) có khả sinh tống họp HupA với hàm lượng l,566jig/ml Lun Thùy Linh 59 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI PHẦN 4: KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã hoạt hóa 96 chúng vi nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng cưa phân bố Sa Pa, Việt Nam Đã tách chiết 96 dịch chiết nấm từ 96 chúng vi nấm nội sinh hoạt hóa Bằng kỹ thuật đo quang ƯV - VIS xác định chúng T44c có khả sinh hoạt tính Huperzine A Bằng phương pháp định danh truyền thống định danh phương pháp sinh học phân tử nhận dạng chúng T44c thuộc loài Talaromyces calidicanius 4.2 Kiến nghị Tiến hành thêm phương pháp sắc ký lòng hiệu cao - HPLC để xác định hàm lượng Huperzine A mà chúng T44c sán sinh, đồng thời nghiên cứu nâng cao hoạt tính sản sinh Huperzine A chủng T44C Tiếp tục tìm kiếm, thu thập phân lập thêm chủng nấm nội sinh từ mẫu Thạch tùng cưa phân bố vùng khác Việt Nam (Đà Lạt, Khánh Hòa ) đế phân lập tuyển chọn chủng nấm nội sinh Thạch tùng cưa có khả sản sinh Huperzine A vùng phân bố khác Lun Thùy Linh 60 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nưóc Bùi Xuân Đồng (1984) Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam, tập Nhà xuất bán Khoa học Kỹ thuật Khuất Hữu Thanh (2006) Kỹ thuật gcn - Nguyên lý ứng dụng Nhà xuất bán Khoa học Kỳ thuật Lại Hà Tố Hoa (2006) Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS - rDNA vùng Tẹf Khóa luận kỹ sư cơng nghệ sinh học Lê Thị Minh Thành (2001) Sơn thục nấm nội sinh, triển vọng ứng dụng nông nghiệp Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982) Vi nấm Nhà Xuất bán Khoa học Kỹ thuật Trần Hợp, Phíing Mỹ Hưng “Cây thạch tùng cưa Huperzia serrata loài dược liệu quý Việt Nam” Web Sinh vật rừng Việt Nam Tài liệu nước A A L Gunatilaka (2006) Natural products from plant-associated microorganisms: distribution, structural diversity, bioactivity, and implications of their occurrence Journal of Natural Products (vol 69, no 3),509-526 Arnold A.E, Mejia L.c, Kyllo D., Rojas E.I, Maynard z., Robbins N., Herre E.A (2003) Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree PNAS USA (100), 15649-15654 Brundrett, M c and Kendrick, B (1988) The mycorrhizal status, root anatomy, and phenology of plants in a sugar mapplc forest Canadian “Journal of Botamy” (66), 1153-1173 10 Collado J., Platas G., Gonzalez L, Pelaez F (1999) Geographical and seasonal influences on the distribution of fungal endophytes in Quercus ilex New Phytol (144), 525-532 Lun Thùy Linh 61 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 11 Chen XY„ Qi YD., Wei JH„ Zhang z„ Wang DL„ Feng JD„ Gan BC (2011) Molecular identification of endophytic fungi from medicinal plant Huperzia serrata based on rDNA ITS analysis World J Microbiol Biotechnol (vol 27, no 3), 495-503 12 Dobranic JK , Johnson JA Alikhan QR (1995) Isolation of endophytic fungi from eastern larch (Larix laricina) leaves from New Brunswick, Canada Can J Microbiol (141), 194-198 13 D Zhu, J Wang, Q Zeng, z Zhang, R Yan (2010) A novel endophytic Huperzine A - producing fungus, Shiraia sp Slfl 4, isolated from Hupcrzia serrata Journal of Applied Microbiology (109), 1469 - 1478 14 Gallery R.A, Dalling J.w, Arnold A.c (2007) Diversity, host affinity and distribution of seed-infecting fungi: a case study with Cecropia Ecol (88), 582-588 15 Gary Strobel and Bryn Daisy (2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products, department of plant sciences Microbiology and molecular biology reviews 16 Gustavo Molina, Ana Paula Dionisio, Mário Roberto Maróstica Junior and Gláucia Maria Pastore (2010) Review article: The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process Biotechnology Research International 17 Hawksworth D (2001) The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited Mycoi Res (105), 1422-1432 18 Huang LH., Feng JQ., Zhou SL., Hong YK (2009) Isolation and identification of endophytic fungi of Huperzia Serrata Academicjoumals (9), 2641-2644 19 I Zabalgogcazcoa (2008) Review Fungal endophytes and their interaction with plant pathogens Spanish Journal of Agricultural Research (6), 138-146 Lun Thùy Linh 62 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 20 Ju, z., Wang, J and Pan, s (2009) Isolation and preliminary identification of the endophytic fungi which produce Huperzine A from four species in Hupziaceae and deter - mination of Huperzine A by HPLC Fudan Univ J Med Sci (36), 445-449 21 Kenneth w Cullings, Detlev R Vogler (1998) A 5.8S nuclear ribosomal RNA gene sequence database: applications to ecology and evolution Molecular Ecology (7), 919-923 22 L G Korkina (2007) Phenylpropanoids as naturally occurring antioxidants: from plant defense to human health Cellular and Molecular Biology (vol 53, no.l), 15-25 23 Liu, J.S., Yu, C.M., Zhou, Y.Z., Han, Y.Y., Wu, F.W., Qi, B.F., Zhu, Y.L (1986a) Study on the chemistry of hupcrzine-A and hupcrzinc-B Acta Chimica Sinica (44), 1035-1040 24 Liu, J.S., Zhu, Y.L., Yu, C.M., Zhou, Y.Z., Han, Y.Y., Wu, F.W., Qi, B.F (1986b) The structures of huperzine A and B, two new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity Canadian Journal of Chemistry (64), 837- 839 25 Li w., Zhou J., Lin z., and Hu z (2007) Study on fermentation for production of Huperzine A from endophytic fungus 2F09P03B of Huperzia serrat Chin Med Biotechnol (2), 254-259 26 Mariana Recco Pimentel, Gustavo Molina, Ana Paula Dionisio, Mário Roberto Maróstica Junior and Gláucia Maria Pastore (2010) Review article: The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process Biotechnology Research International 27 Ma X and Gang DR (2008) In vitro production of Huperzine A, a promising drug candidate for Alzheimer’s disease Phytochemistry (69), 2022 -2028 28 Ma and X.Q (1997) Chemical studies on natural resources of Huperzia and its related genera in China Chinese Academy of Sciences (D), Shanghai Lun Thùy Linh 63 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 29 R X Tan, w X Zou (2001) Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites Nat Prod Rep (18), 448 - 459 30 Sahar Masumi, Sohcila Mirzaci, Doustmorad Zafari and Ramczan Kalvandi (2015) Isolation, identification and biodiversity of endophytic fungi from Thymus Process in Biological sciences (vol.5), 43-50 31 Sanchez Marquez s., Bills G.F, Zabalgogeazcoa I (2007) The endophytic mycobiota of the grass Dactylis glomerata Fung Divers (27), 171-195 32 Shen p., Fan XR and Li GW (2000) The Experiment of Microbiology , 3rd version Beijing, China: Publishing House of High Education 33 Shi w., Luo JP., Ting ZH., Wu J (2005) Isolation and identification of endophytic fungi of Huperziaserrata Herbal Drugs (36), 281-283 34 s K Deshmukh, p D Mishra, A Kulkarni-Almeida et al (2009) Anti inflammatory and anticancer activity of ergoflavin isolated from an endophytic fungus Chemistry and Biodiversity (vol 6, no 5), 784-789 35 Stone J.K., Polishook J.D, White J.F (2004) Endophytic fungi In: Biodiversity of fungi Inventory and monitoring methods (Mueller G.M., Bills G.F., Foster M.S., eds) Elsevier Academic Press, San Diego, USA, 241-270 36 Sardul Singh Sandhu Ct al (2014) Isolation and identification of endophytic fungi from Ricinus communis linn and their antibacterial activity International journal of research in pharmacy and chemistry (vol.4 - no.3), 611-618 37 Szypula w., Pictrosiuk A., Suchocki p., Olszowska o., Furmanowa M and Kazimieska o (2005) Somatic embrogenesis and in vitro culture of Huperzine selago shoots as a potential source of Huperzine A Plant Sci (168), 1443- 1452 38 Tang, X.C., Han, Y.F., Chen, X.P., Zhu, X.D (1986) Huperzine A Effects of on learning and the retrieval process of discrimination performance in rats Zhongguo Yao Li Xue Bao (7), 507-511 Luu Thùy Linh 64 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 39 T p Fill, B F da Silva and E Rodrigues-Fo (2010) Biosynthesis of phenylpropanoid amides by an endophyticpenicillium brasilianum found in root bark of Melia azedarach Journal of Microbiology and Biotechnology (vol 20, no 3), 622-629 40 Xiaoquiang Ma, ChangHcn Tan, Dayuan Zhu, David G.Rang and Peigen Xiao (2007) Huperzine A from Huperzia species - An ethnopharmacolgical review Journal of EthnopharmacolgicaL 41 Yin Lu, Chuan Chen, Hong Chen, Jianfen Zhang and Weiqin Chen (2012) Isolation and identification of endophytic fungi from Actinidia macrosperma and investigation of their bioactivitics Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (vol.2012), pages 42 Zhu, X.D., Tang, x.c (1987) Facilitatory effects of hupcrzinc A and B on learn- ing amd memory of spatial discrimination in mice Yao Xue Xue Bao (22), 812-817 Lun Thùy Linh 65 CNSH 1302 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI Trang web 43 http://healthplus.vn/thach-tung-rang-cua-duoc-lieu-quy-chua-benh- alzheimer- d26775.html/ 44 rvn-vallet.org/wp-content/uploads/rvn2015/tom tat de tai nghiên CUU- ngocmy.doc/ 45 http://trungtamduoclieu.vn/thach-tung-rang-cua-id31 html 46 http://xcmtailicu.com/tai-licu/nghicn-cuu-cac-hop-chat-co-hoat-tinh- sinh-hoc-cua-vi-nam-noi-sinh-duoc-phan-lap-tu-cay-ho-rutaceae-va- zingiberaceae-1095036.html 47 http://thuvienluanvan.info/luan-van/dc-tai-xac-dinh-trinh-tu-vung-its- rdna-cua-nam-beauveria-bassiana-vuille-ky-sinh-tren-con-trung-gay-hai22763/ 48 http://hocday.com/lt-vn—3-tng-quan-v-vi-nm-ni-sinh-4.html 49 http://www.hup.edu vn/cpbdv/psdh/noidung/Lists/NghienCuuSinh/Attach ments/79/NoidungLATS-Dung.pdf 50 https://nootriment.com/huperzine-a-benefits/ 51 http://baigiang.violct.vn/prcscnt/show/entry id/705036 Lun Thùy Linh 66 CNSH 1302 ... sinh có khả sinh tổng hợp Huperzine A phân lập từ Thạch tùng c? ?a phân bố Sa Pa, Vi? ??t Nam Nội dung nghiên cứu: - Hoạt h? ?a chúng vi nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng c? ?a Sa Pa, Vi? ??t Nam - Sàng... vi nấm nội sinh có khả sinh tổng họp Huperzine A từ Thạch tùng c? ?a phân bố Sa Pa - Vi? ??t Nam? ?? thực với hy vọng mở hướng vi? ??c nghiên cứu chúng nấm nội sinh có khả sân sinh hoạt chất Huperzine A. .. chủng nấm nội sinh từ mẫu Thạch tùng c? ?a phân bố vùng khác Vi? ??t Nam (Đà Lạt, Khánh H? ?a ) đế phân lập tuyển chọn chủng nấm nội sinh Thạch tùng c? ?a có khả sản sinh Huperzine A vùng phân bố khác Lun