35 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu 2 1 1 Đối tượng nghiên cứu Xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase, cellulase, protease ngoại bào cũng như có hoạt tính kháng khuẩn và kháng mốc được phân lập từ các mẫu đất thuộc xã Nhuận Phú Tân, huyện Mỏ Cày, tỉnh Bến Tre và xã Long Hiệp, huyện Bến Lức, tỉnh Long An 2 1 2 Hóa chất STT Môi trường Thành phần (gl) 1 Gause I agar 20g Starch; 0,5g MgSO4 7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g KNO3; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; 20g Agar, nước cất 1 lít; pH 7,0 7,2 2 Gau.
CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase, cellulase, protease ngoại bào có hoạt tính kháng khuẩn kháng mốc phân lập từ mẫu đất thuộc xã Nhuận Phú Tân, huyện Mỏ Cày, tỉnh Bến Tre xã Long Hiệp, huyện Bến Lức, tỉnh Long An 2.1.2 Hóa chất STT Mơi trường Thành phần (g/l) 20g Starch; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g Gause I agar KNO3; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; 20g Agar, nước cất lít; pH 7,0-7,2 Gause I Broth 20g Starch; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g KNO3; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; nước cất vừa đủ lít; pH 7,2-7,4 10g CMC; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g KNO3; Gause-CMC 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; nước cất vừa đủ lít; pH 7,27,4 GauseCasein 10g Casein; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g KNO3; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; nước cất vừa đủ lít; pH 7,2-7,4 PGA LB 200g khoai tây; 20g Agar; 20g Glucose; lít nước cất 10g Peptone, 10g Nacl, 5g Yeast extract, lít nước cất, pH 7,0 35 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị Dụng cụ: Que cấy (trịn, móc), que trang, đèn cồn, micropipet 1000 µl, đĩa petri, đầu típ, ống đong, erlen, bercher, ống nghiệm, giá ống nghiệm, không thấm Thiết bị: Autoclave, Microwave, máy Vortex, Micropipette, Tủ sấy, Tủ ủ, Máy lắc, Tủ an toàn sinh học cấp II, Máy li tâm, Máy đo pH, Cân kĩ thuật, Bếp điện từ, Kính hiển vi quang học 2.1.4 Nguyên liệu Các mẫu đất lấy độ sâu từ 10-15 cm khu vực lấy mẫu Các chủng vi khuẩn nấm mốc thị cung cấp từ phòng Công nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học Thực Phẩm, Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu Chọn điểm thu mẫu đất: mẫu đất lấy khu vực khác (đất gị cao, khu vực có nhiều gỗ bị hoai mục, đất khu vực ẩm ướt, bờ ruộng, khu vực xung quanh chuồng gà, chuồng lợn,…) thuộc tỉnh Bến Tre Long An Cách lấy mẫu: dùng dao lấy khoảng 10-15g đất độ sâu 10-15 cm vị trí trên, cho vào túi nilon khử trùng, buộc kín, ghi ngày vị trí lấy mẫu Mẫu đất bảo quản 4°C, sau ngày tiến hành phân lập xạ khuẩn [7], [8] 2.2.2 Phân lập xạ khuẩn từ đất Các mẫu đất pha loãng thập phân đến nồng độ thích hợp (10-2, 10-3 10-6) nước cất nước muối sinh lí vơ trùng Từ nồng độ pha lỗng, 100µl dịch mẫu pha lỗng chuyển sang đĩa Petri chứa môi trường Gause I Dùng que trang trải ủ nhiệt độ phòng ngày Tiến hành nhận diện khuẩn lạc đặc trưng xạ khuẩn Từ khuẩn lạc nhận diện, tiến hành làm chúng cách cấy ria môi trường Gause I đến nhận khuẩn lạc khiết Bảo quản giống °C giữ giống glycerol 40% -60°C để thực thí nghiệm [9], [10] 36 2.2.3 Quan sát đặc điểm hình thái xạ khuẩn Quan sát đại thể: Xạ khuẩn cấy ria môi trường Gause I nhiệt độ phòng, quan sát đặc điểm đại thể sau ngày cấy: kích thước, hình dạng, đặc điểm bề mặt, rìa, màu sắc khuẩn lạc mặt trên, mặt dưới, sắc tố xạ khuẩn tiết môi trường nuôi cấy Quan sát vi thể: Xạ khuẩn nuôi cấy môi trường Gause I theo phương pháp tiêu phịng ẩm Sau 5-7 ngày ni nhiệt độ phòng, tiến hành quan sát đặc điểm vi thể chúng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần [11] 2.2.4 Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào xạ khuẩn Nguyên tắc: nguồn chất cảm ứng có mơi trường ni cấy bị phân giải có enzyme thích hợp Sau đó, nhận biết khả phân hủy chất enzyme thuốc thử đặc trưng Xác định hoạt tính enzyme thơng qua kích thước vòng phân giải chất Để khảo sát khả sinh tổng hợp amylase, cellulase ngoại bào: chủng xạ khuẩn cấy chấm điểm môi trường Gause I có chứa nguồn chất cảm ứng tương ứng tinh bột CMC (carboxy methyl cellulose) Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase cách nhuộm thuốc thử Lugol đo kích thước vịng phân giải chất sau ngày ni ủ nhiệt độ phịng [12]–[14] Để khảo sát khả sinh tổng hợp protease, chủng xạ khuẩn cấy chấm điểm môi trường có bổ sung nguồn chất cảm ứng casein Kiểm tra hoạt tính protease bằng TCA 10% đo kích thước vịng phân giải chất sau ngày ni ủ nhiệt độ phịng [15] 2.2.5 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Các chủng xạ khuẩn vi khuẩn tăng sinh môi trường tương ứng Gause I broth LB broth Phương pháp khuếch tán đĩa thạch sử dụng để kiểm tra khả kháng khuẩn xạ khuẩn Cấy trải chủng vi khuẩn vào đĩa Petri chứa môi trường LB agar khoan giếng thạch Nhỏ 100µl dịch tăng sinh xạ khuẩn sau ngày nuôi cấy vào giếng thạch khoan Đem 37 đĩa cấy ni ủ kiểm tra hoạt tính đối kháng xạ khuẩn sau 24h [16] 2.2.6 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với nấm mốc gây bệnh Từ ống thạch nghiêng, giống xạ khuẩn cấy chuyền sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường Gause I broth nuôi lắc 150 rpm ngày nhiệt độ phịng Sau xác định hoạt tính đối kháng nấm dịch ni xạ khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch Trên môi trường PGA, tiến hành cắt cm2 mảnh thạch chứa tơ nấm đặt vào phía đối diện lỗ thạch khoan Hút 100µl dịch ni cấy xạ khuẩn nhỏ vào lỗ thạch khoan Để nhiệt độ phòng, sau đến ngày tiến hành kiểm tra kết dựa vào kích thước vịng đối kháng (D-d, cm) Trong D đường kính vịng đối kháng d đường kính lỗ thạch Sau chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao thơng qua đường kính vịng đối kháng [9] Mức độ đối kháng xạ khuẩn với nấm bệnh đánh giá dựa theo nghiên cứu Nguyễn Thới An (2014) mức độ kháng mạnh, kháng trung bình kháng yếu với kính thước vịng đối kháng là: ≥ 20 mm, ≥ 15 mm ≥ 10 mm [17] 2.7 Phương pháp xử lí số liệu Sử dụng phần mềm Excel để tổng hợp tính tốn số liệu từ kết thu nhận trình thực thí nghiệm 38 ... kích thước vịng phân giải chất sau ngày nuôi ủ nhiệt độ phòng [15] 2. 2.5 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Các chủng xạ khuẩn vi khuẩn tăng sinh môi trường... nuôi ủ kiểm tra hoạt tính đối kháng xạ khuẩn sau 24 h [16] 2. 2.6 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với nấm mốc gây bệnh Từ ống thạch nghiêng, giống xạ khuẩn cấy chuyền sang ống... điểm vi thể chúng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần [11] 2. 2.4 Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào xạ khuẩn Nguyên tắc: nguồn chất cảm ứng có mơi trường ni cấy bị phân