Phân lập một số hợp chất từ phân đoạn Chlorofrom của lá cây lá đắng (Vernonia amygdalina Del., Asteraceae)

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH -0O0 BÁO CÁO TỎNG KỂT ĐÈ TÀI CHƯƠNG TRÌNH SINH VIÊN NCKH NĂM 20 TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP MỘT SÓ HỢP CHẤT TÙ PHÂN ĐOẠN CHLOROFORM CỦA LÁ CAY {Vernonia amydalina Del., Asteraceae) Mã số đề tài: Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Mơ Giảng viên hướng dẫn: Ths Ds Bùi Hoàng Minh Khoa: Dược Các thành viên tham gia: STT Họ• tên MSSV Lớp Nguyền Thị Mơ 1511542130 15DDS6C TP Hồ Chỉ Minh, thảng 10 năm 2020 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BIẾU ĐỒ - sơ ĐỒ - HÌNH ẢNH CHƯƠNG 1.1 TÓNG QUAN TÀI LIỆU Tông quan vê thực vật học 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.1.6 1.1.7 Họ Asteraceae Chi Vernonia Loài Vernonia amydalinaĐei Vị trí bảng phân loại thực vật 10 Mô tả thực vật 10 Sinh thái phân bố 11 Bộ phận dùng 11 1.2 Tổng quan thành phần hóa học 11 1.3 Một số nghiên cứu Vernonia amydalina Del 14 1.3.1 1.3.2 1.4 Tác dụng dược lý 17 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5 1.4.6 1.4.7 1.4.8 1.4.9 1.5 Nguyên liệu 25 Dụng cụ trang thiết bị 25 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 CHƯƠNG 3.1 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 25 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.1 2.1.2 2.2 Điều trị viêm gan 18 Chống ung thư 19 Khả chơng oxy hóa 20 Hạ đường huyết 20 Khả kháng khuân 21 Khả kháng nâm 22 Điều trị sốt rét 22 Bảo vệ thần kinh 22 Bảo vệ dày, ngừa nhiềm độc thận 23 Công dụng y học cô truyên 24 CHƯƠNG 2.1 Một số nghiên cứu nước 14 Một số nghiên cứu nước 15 Độ ẩm 26 Chiết xuất dược liệu thu phân đoạn cao 26 Phận lập tinh chế 27 Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc chất phân lập 28 KẾT QƯẢ VÀ SẢN PHÁM ĐẠT Được .29 Kết 29 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.2 Độ am 29 Chiết xuất dược liệu 29 Phân lập tinh chế 30 Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc 33 Bàn luận 43 3.2.1 3.2.2 3.2.3 CHƯƠNG đối tượng nghiên cứu 43 kết trình chiết xuất 43 kết phân lập 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHŨ VIẾT TẤT ALP Alkalin Phosphatase ALT Alanin amino transferace AST Aspartate amino transferace BHA Butylated hydroxyanisol BHT Butyled hydroxytoluen CCL4 Tetraclomethan CDCỈ3 Deuterochloroform CHCỈ3 Chloroform COSY Collerated Spectroscopy - (phô) tương quan 1H-1H CTPT Công thức phân tử d doublet DMSO Dimethyl sufoxit EtOAc Ethyl Acetat EtOH Ethanol HCOOH Acid Formic HMBC Hetemonuclear Multiple Bond Correlation HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Hetemonuclear Single Bond Correlation HTCO Hoạt tính chống oxy hóa SKLM Sac ký lóp mỏng MeOH Methanol MS Mass spectrometry - khôi phô NMR Nuclear Magnetic Resonance- Cộng hưởng từ hạt nhân PE Ether dầu hỏa PTK Phân tử khối singlet TMS Tetra Methyl Silan ưv vs Ưltraiolet - tử ngoại Vanilin Sulfuric DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột chân không 31 Bảng 3.2 Bảng so sánh số liệu NMR Ml Dioctylphtalat [39] 34 Bảng 3.3 Bảng so sánh số liệu NMR M2 Stigmasterol 36 Bảng 3.4 Bảng số liệu phổ NMR M3 38 Bảng 3.5 Bảng so sánh số liệu NMR M3và Luteolin 40 DANH MỤC BIẾU ĐỒ - sơ ĐỊ - HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hoa thức hoa đồ Hình 1.2 Hình thái lồi Vernonia amydalina Del 11 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học số Sesquiterpen lacton v.amygdalina Del [21],[27] 11'11111111 1.1.111?1„11.11.11 11.111 1.1.11T 12 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học số Saponin v.amygdalìna Del [27], [29] 13 Hình 1.5 [27] Cấu trúc hóa học số Flavonoid v.atnygdalina Del [25], ' ' .14 Hình 1.6 [26] Cấu trúc hóa học số hợp chất hoa cua v.amygdalìna Del 14 Hình 2.1 Quy trình chiết xuất phân lập dự kiến 27 Hình 3.1 Sơ đồ kết quy trình chiết xuất cao Lá Đắng 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn cao Lá Đắng 30 Hình 3.3 Sắc ký cao phân đoạn CHCỈ3 30 Hình 3.4 CHCh Sắc ký đồ phân đoạn thu từ sắc kýcột chân không cao „ 32 Hình 3.5 Sắc ký đồ Ml với hệ dung môi khác 33 Hình 3.6 Cơng thức hóa học Ml qua phổ ’H-NMR 34 Hình 3.7 Sắc ký đồ Mz hệ dung môi khác 36 Hình 3.8 Cơng thức hóa học M2 37 Hình 3.9 Sắc ký đồ M3 với hệ dung môi khác 38 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học tương tác phổ HMBC M3 40 Hình 3.11 Sắc ký đồ M4 với hệ dung môi khác 41 Hình 3.12 Sắc ký đồ so sánh V4 M4 42 Hình 3.13 Cơng thức hóa học cua Apigenin 42 TÓNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 1.1 Tổng quan thực vật học 1.1.1 Họ Asteraceae Dạng sống cỏ, sống năm hay nhiều năm Thân gồ, bụi hay dây leo gặp Rễ có the phù lên thành củ, chất dự trừ tinh bột mà inullin (Thược dược) Lá có hình dạng biến thiên, khơng có kèm, thường mọc đối tụ thành hình hoa gốc, có loại có gai Thơng thường phiến ngun, xẻ sâu, kép hình lơng chim hay hình chân vịt gặp Cụm hoa đầu, có the mang nhiều hoa hay hoa Đầu có the đứng riêng lẻ hay tụ thành chùm, gié, xim, thông thường tụ thành ngừ Có thể xem hoa tự đầu gié thu ngắn, hoa đính theo đường xoắn ốc liên tục, hoa già bìa, hoa non Dạng thơng thường hoa tự đầu hình nón, có the phăng có lõm hình chén Đầu mang hai loại bắc: Lá bắc bất thụ, tạo thành tổng bao Các bắc dính thành hàng (Senecio, Tagetes) đính nhiều hàng kết lọp Hình dạng kích thước bắc ngồi biến thiên Lá bắc thật có mang hoa nách Chúng phiến mỏng hẹp, đơi có lơng Lá bắc thật có the phang hay cong xung quanh hoa; có the khơng có Hoa lưỡng tính, mẫu 5, bầu dưới, khơng có bắc Hoa thức theo kiểu: o * ộ K(5)C(5)A5G(2) Hình 1.1 Hoa thức hoa đồ Các hoa đầu giống nhau, có cách cấu tạo, chức Kiểu đầu gọi đồng giao với toàn hoa hình ống tồn hoa hình lưỡi nhỏ có năm đơi tồn hoa hình mơi Hoa tự đầu có the gồm hai loại hoa: hoa hình ong có nhiệm vụ sinh sản hoa khơng hình lười nhỏ có ba bìa, đóng vai trị tràng để thu hút côn trùng Kiểu gọi dị giao Bao hoa Lá đài thường giảm nhiệm vụ bảo vệ đảm nhiệm bắc tống bao Đài biến mất, đơi cịn gờ nhỏ, nguyên hay có thùy; gờ mang vấy hay vịng lơng tơ Sau thụ tinh, đài có thề phát trien thành mào lơng, láng hay có gai, có nhiệm vụ phát tán cùa Tràng cánh hoa dính, có the hình ống (trường hợp hoa đầu dị giao) khơng có dạng lưỡi nhỏ có hay hình mơi 2/3 hình ống dài cong Bộ nhị nhị nhau, đính ống tràng xen kè với cánh hoa Chỉ nhị rời trừ tông Cynareae Bao phấn mở dọc, hướng trong, dính thành ống bao quanh vòi Trung đới thường kéo dài bao phấn thành phụ Ngoài bao phấn cịn mang gốc nhừng phụ chỗi tạo thành tai nhỏ, che chở cho mật hoa gốc vòi khởi bị nước mưa Bộ nhụy nỗn vị trí trước-sau, tạo thành bầu ơ, đựng nỗn, đính đáy Đĩa mật bầu Ớ hoa lưỡng tính hoa cái, vịi xun qua đìa mật chia thành nhánh đầu nhụy (vịi khơng chia nhánh hoa bất thụ) Các nhánh đầu nhụy mang mặt lông đe quét hạt phấn vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bao phấn Hoa thụ phấn nhờ côn trùng Quă bế, thường mang mào lông đài biến đổi, có mào lơng mang cuống dài hay ngắn Đơi trần có móc hay có gai Hạt khơng có nội nhũ; mầm to, nhiều chứa đầy dầu (hạt Hướng dương) Việt Nam, Asteraceae có khoảng 125 chi 350 loài [8] 1.1.2 Chi Vernonia Dạng sống cỏ, bụi hay gồ dạng dây leo sống năm hay lâu năm Lá mọc cách, mọc đối, có the có cuống khơng thường khó xác định; nguyên hay có cưa, gân hình lơng chim Bao hoa tong bao phía có hình bát thu hẹp dần thành hình trụ, gồm nhiều bắc lợp lại với nhau, gom hàng, bắc ngồi ngắn, phía hay rụng sớm Đe hoa phang hay có gờ nhỏ, thường nhằn có lơng tơ ngắn Hoa cụm hoa tạo thành chùy hay ngừ nách lá, cụm hoa đơn Hoa có màu hồng, tía, màu trắng; cụm hoa có từ (l-)3- 100+ hoa đơn, hình ống nhỏ, đài thường hình chng hay hình phễu, có thùy Bao phấn có hình mác Quả be hình trụ hay hình nón ngược, thường có - 10 gờ noi rõ, 4-5, có tuyến, gờ thường có khơng có lơng ngắn Mào lơng hai lớp, lóp ngồi lơng ngắn, đơi tiêu biến, lóp có nhiều lơng tơ hình lơng chim, có gai, rụng ton tại, thường có màu [44] Chi Vernonia thuộc họ Asteraceae, chi lớn tông Vemoniae với khoảng 1000 loài Các loài chi Vernonia phân bo rộng rãi nhiều nơi với nhiều điều kiện khí hậu sinh thái khác nhau: rừng nhiệt đới, đầm lầy, khu vực ấm ướt, hoang mạc hay sa mạc chí khu vực hàn đới Bắc Mỳ [41] Song, Việt Nam có khoảng 28 lồi, có số lồi sử dụng làm thuốc [9], [6] - Bạch đầu ông, Bạch đầu tro, Dạ hương ngưu (Vernonia cinerea (L.) Less.) - Bạch đầu sát trùng, Ban cưu cúc sát trùng (Vernonia anthelminthica (L.) Willd) - Bông bạc, bạch đầu đại mộc (Vernonia arborea Buch.-Ham NZX.javanica El.) - Dây chè, Rau ráu, đỏ (Vernonia cuntingiana Benth Var andersoni C.B Clarke) - Bạch đầu bao gai, Bạch đầu cứng (Vernonia squarrosa (D.Don) Less Var teres Wall Ex DC.) - Bạch đầu liều (Vernonia saligna (Wall.) D.C) - Bạch đầu lông (Vernonia parỉshii Hook f.) - Bạch đầu nhám (Vernonia aspera Buch - Ham.) - Bạch đầu nhỏ, Cúc bạc đầu (Vernonia patula (Dryand.) Merr.) - Bạch đầu rau, Ban cưu cúc (Vernonia esculenta Hemsl.) - Bạch đầu Spire (Vernonia spirei Gandog.) - Dây dọi tên, bạch đầu bầu dục (Vernonia elỉiptica DC var Qlaeagnifolia DC.) - Cúc bung, Bạch đầu to (Vernonia macrachaenia Gag-nep.) Cúc cà, Cúc hồng leo (Vernonia solanifolia Benth.) 1.1.3 Loài Vernonia amydalina Del Tên khoa học: Vernonia amygdalina Delile Tên đồng nghĩa: Gymnanthemum amygdalinum (Delile) Sch Bip ex Walp [19] Tên thường gọi: Mật gấu nam, Lá đắng Tên nước ngoài: African bitter leaf [19], bitter leaf [27], [33] 1.1.4 Vị trí bảng phân loại thực vật Theo hệ thống phân bố Takhatajan vị trí lồi Vernonia amygdalina Del xếp sau: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Cúc (Asteridae) Bộ Cúc (Asterales) Họ Cúc (Asteraceae) Chi Vernonia Lồi Vernonia amygdalỉna Del [40] 1.1.5 Mơ tả thực vật Dạng sống bụi hay gồ nhỏ, cao từ 1,5-3 m, thân phân nhiều nhánh, thân non góc cạnh, có nhiều lơng bao phủ gần nhằn phía Lá mọc cách, hình dạng kích thước đa dạng, hình mũi mác hay hình trứng có kích thước khoảng 3-17 X 1,3-7 cm, đỉnh nhọn, mép có hình cưa, mặt nhằn, mặt nhạt màu có gân noi rõ; có cuống khơng có, cuống dài 1-4 cm Hoa cụm hoa dạng ngù đầu cành, cuống ngắn, có nhiều bắc dài 0,1-0,2 cm, có mùi thơm [5], [19] Mồi cụm hoa có 11-35 hoa, hình chng rộng 0,2-0,5 cm, cuống dài 0,2-0,5 cm, màu trang kem Tong bao mang 25-30 bắc, xếp thành 4-5 hàng, hình trứng hay hình chừ nhật, dài 0,4-0,6 cm, màu xanh đậm đỉnh, vòng dài vịng ngồi Tràng hoa màu trắng, thu hẹp dần phía Bộ nhị: dài 4,5-5 cm, gồm nhị, dài 11-14,5 mm; bao phấn dính thành ong dài 3-4 mm, hình trứng, kích thước 2-2,5 X 0,5-0,9 mm Bộ nhụy: Vòi nhụy dài 8-9,5 mm, mang đầu nhụy Quả: Quả bế hình trứng thn dài 3-4 X 0,5-1 mm, có 10 gân, túm lông với sợi lông cứng mọc loe đầu [5] Quả hoa vào tháng 12 tháng năm sau [19] 10 PE-EtOAc (5:5) uv 254 uv 365 vs CHCh-MeOH (9:1) uv 254 uv 365 vs Hình 3.7 uv 254 CHClj 100% uv 365 vs Sắc ký đồ M2 hệ dung môi khác M2 tinh có màu trắng, tắt quang uv 254 nm, 365 nm, vết cho màu tím nhúng thuốc thử vs Phổ NMR M2 Trên l3C-NMR, xuất carbon olefin ÔC: 139,6; 138,3; 129,5 121,8 Do M2 Stigmasterol cấu trúc M2 xác định thông qua so sánh với dừ liệu phổ ‘C-NMR Stigmasterol công bố trước [24], kết so sánh trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Bảng so sánh số liệu NMR M2 Stigmasterol M2 Stigmasterol ”c (ồppm) 13C (ĩ>ppm) 38,0 37,6 29,7 31,9 71,8 72,0 42,5 42,5 139,6 140,8 121,7 121,8 31,5 32,1 31,9 32,2 49,5 50,5 10 37,3 36,5 11 21,1 21,2 12 39,5 40,0 13 42,4 42,2 14 56,9 57,1 15 24,3 24,5 STT 36 m2 Stigmasterol ”c (ỗppm) 13c (ỉ>ppm) 16 28,5 28,9 17 55,9 56,3 18 12,2 12,2 19 19,4 19,5 20 40,3 40,4 21 21,4 21,4 22 138,2 138,3 23 129,5 129,8 24 51,3 51,5 25 31,9 32,2 26 21,2 21,2 27 19,0 19,2 28 25,4 25,4 29 12,1 12,2 STT Kết so sánh dừ liệu phổ M2 Stigmasterol gần trùng khớp Như M2 Stigmasterol Cấu trúc hóa học M2 the qua Hình 3.8 37 3.1.4.3 Kiểm tra độ tinh khiết xác định cẩu trúc Mỉ M3 (17,00 mg) thu dạng tủa màu vàng, tan phần MeOH, tan CHCI3 tan tốt PE Kiếm tra độ tinh khiết M3 hệ dung môi sắc ký lớp mỏng - CHCh-MeOH-HCOOH (9:1:0,05) - PE-EtOAc-HCOOH (1:9:0,05) - EtOAc bão hịa nước-HCOOH (10:0,05) Ket the Hình 3.9, hệ dung môi M3 điều cho vết gọn sắc ký đồ, sơ kết luận M3 tinh khiết sắc ký lớp mỏng PE-EtOAc-HCOOH CHCh-MeOH-HCOOH EtOAc bão hòa nước-HCOOH Bảng 3.4 Bảng số liệu phổ NMR Mỉ Civ 13c (