Chiết tách, phân lập một số hoạt chất từ cây bụt giấm hibiscus sabdariffa ứng dụng kiểm nghiệm trà bụt giấm hòa tan 2

22 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Mục tiêu nghiên cứu Tách chiết và phân lập, xác định cấu trúc của hai chất là polyphenol và flavonoid có trong đài hoa bụp giấm Xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm trà bụp giấm hòa tan Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa và ức chế alfa glucosidase của sản phẩm trà bụp giấm hòa tan 2 2 Đối tượng nghiên cứu Đài hoa bụp giấm tươi mua tại TP Cần Thơ, phơi khô để sử dụng Maltodextrin DE 15 17 mua tại công ty TNHH Phát Triển Khoa Học Vinasing Đường B.

CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Tách chiết phân lập, xác định cấu trúc hai chất polyphenol flavonoid có đài hoa bụp giấm Xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm trà bụp giấm hòa tan Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa ức chế alfa glucosidase sản phẩm trà bụp giấm hòa tan 2.2 Đối tượng nghiên cứu Đài hoa bụp giấm tươi mua TP Cần Thơ, phơi khô để sử dụng Maltodextrin DE 15-17 mua công ty TNHH Phát Triển Khoa Học Vinasing Đường Biên Hịa 2.3 Hóa chất, dung mơi Các dung môi methanol (MeOH), ethanol (EtOH), n-hexan (Hx), ethyl acetate (EtOAc), Folin-Ciocalteu, DPPH*, acid ascorbic, acarbose, Na2CO3 10%, H2SO4 10%, Chlorofom mua công ty đạt tiêu chuẩn phân tích Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 hãng Merck 22 2.4 Dụng cụ, trang thiết bị Bảng 2.1 Một số dụng cụ, trang thiết bị sử dụng thực nghiệm STT Dụng cụ Thiết bị Giấy lọc Quantitative Filter Cân phân tích Sartorious ED 224S, đợ xác Paper (Φ110mm, 10-4g, lượng cân tối đa 200g 0.35µm) Ống đong 100ml Tủ sấy dụng cụ Memmert UNB 200 Máy cô quay chân không hiệu EYELA N – 1200A kèm bếp cách thủy EYELA OSB – 2100 máy Ống đong 250ml làm lạnh EYELA CCA – 1111 Viện Hàn lâm Khoa học Vật liệu Ứng dụng, quận 12, TP Hồ Chí Minh Vial 1.5ml (có sẵn nắp) Đầu lọc Syringe (Φ13mm, 0.45µm) Erlen 100 ml Becher 100 ml, 500 ml, 1000 ml Ống đong 100ml, 250 ml, 1000ml Đèn UV bước sóng 254 – 365nm Viện Hàn lâm Khoa học Vật liệu Ứng dụng, quận 12, TP Hồ Chí Minh Thiết bị ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker tần số 500MHz phịng Cợng hưởng từ hạt nhân – Viện hóa học, Hà Nợi Brix kế Lị nung Máy đo quang phổ hấp thụ Nhiệt kế Máy sấy đông khô Eyela 10 Buret Máy cô quay chân không STRIKE 102 11 Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại, hiệu SCHOTT 12 Máy xay xát 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp chiết xuất Phương pháp chiết xuất dùng để nghiên cứu sơ bộ chưa biết thành phần hóa học dược liệu Nghiên cứu sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để phân đoạn hợp chất khỏi dược liệu Sau lần chiết với một loại dung môi nhiệt độ thường, làm khô dược liệu tiếp tục chiết với dung môi Mỗi phân đoạn chiết, ta cất loại dung môi để thu cao chiết tiến hành phân tích riêng Để thu hồi dung môi, sử dụng máy cô quay chân không cho hiệu suất cao 2.5.2 Các phương pháp sắc kí 2.5.2.1 Sắc kí mỏng [9-10] Sắc ký bản mỏng công cụ đắc lực nghiên cứu dược liệu đơn giản, tốn thiết bị dung mơi mà lại đạt hiệu quả cao Sắc ký bản mỏng kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích Pha tĩnh chất hấp phụ lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, trải mỏng đồng cố định phiến kính kim loại Pha đợng một hệ dung môi đơn đa thành phần trộn với theo tỷ lệ định tùy theo mục đích cụ thể Trong q trình di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử hỗn hợp mẫu thử di chuyển bản mỏng theo hướng pha động, với tốc độ khác Kết quả, ta thu một sắc ký đồ bản mỏng 2.5.2.2 Sắc kí cột Sắc ký cợt (coloumn chromatography), phương pháp vơ quan trọng q trình lập chất tự nhiên Sắc ký cột dùng để tách riêng chất khỏi hỗn hợp tinh chế chất Trong đó, pha tĩnh dùng silicagel nhồi vào cợt, chất cần phân tích cho vào phía pha tĩnh silicagel, triển khai mợt cách liên tục nhiều hệ dung môi khác 24 từ phân cực yếu đến phân cực mạnh Việc chọn hệ dung môi phù hợp định đến kết quả chạy cột, dung môi chọn dựa vào kết quả sắc ký lớp mỏng Ngồi ra, lựa chọn cợt cần dựa vào lượng mẫu cần phân tách, cho tỉ lệ chất hấp phụ/chất cần tách từ 25 – 50 độ cao cột chất hấp phụ/độ cao cột chất cần tách lớn Với chất khó tách lượng chất hấp phụ phải lớn Đối với phân đoạn chất có màu, theo dõi q trình sắc ký dựa màu sắc, hứng phân đoạn dựa theo màu sắc riêng Đối với mẫu khơng màu tiến hành phân đoạn nhỏ có đánh số kiểm tra sắc ký bảng mỏng 2.5.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Cấu trúc hợp chất khảo sát nhờ kết hợp phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [9-10] NMR dựa nguyên tắc cộng hưởng hạt nhân nguyên tử đặt chúng một từ trường Có nhiều kỹ thuật xác định phổ cợng hưởng từ hạt nhân khác áp dụng Mỗi kỹ thuật dùng để xác định đặc tính cợng hưởng từ định hạt nhân Tuỳ vào mục đích mức đợ phức tạp cấu trúc, người ta đo hay nhiều loại phổ khác Người ta xác định phổ mợt loại hạt nhân (1H hay 13C) phổ một chiều (1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT), hay mối tương quan loại hạt nhân phổ chiều (COSY, NOESY, HSQC, HMBC, )  Phổ 1H-NMR: cho biết mơi trường hố học proton phân tử Các proton có mơi trường hố học khác có chuyển dịch hoá học khác nhau, thường nằm khoảng – 14 ppm Phổ proton proton hay nhóm proton có mơi trường hố học (như proton nhóm CH3) thể phổ đỉnh Đỉnh đỉnh đơn, đôi, ba tới đỉnh thành phần (đỉnh 7) Diện tích đỉnh tỉ lệ với số lượng proton đỉnh Dựa vào diện tích đỉnh biết số proton đỉnh Mợt thơng số quan trọng khác phổ proton số ghép (J) tính Hz, cho biết tương tác proton với proton kế cận 25  Phổ 13C-NMR: cung cấp thơng tin mơi trường hố học carbon Độ chuyển dịch carbon nằm khoảng – 240 ppm Đây ưu điểm lớn phổ 13C-NMR tín hiệu phổ bị trùng lặp đặc trưng chất Với kỹ thuật đo phổ tại, phổ NMR carbon vạch đơn, vạch ứng với carbon (hơn carbon chúng có chung mơi trường hố học) phân tử  DEPT: Một kỹ thuật khác sử dụng để phân tích phổ 13 C-NMR phổ DEPT Trong kỹ thuật này, phổ kế biến đổi tín hiệu gửi tới mẫu đo Khi nhận phổ đồ bổ sung Phổ DEPT-135 không cho pic cacbon bậc 4, cho tín hiệu CH CH3 mợt phía, cịn CH2 phía bên Phổ DEPT-90 cho tín hiệu CH Kết hợp phổ 13C-NMR phổ DEPT, người nghiên cứu có thơng tin bản khung carbon hợp chất  Phổ HMQC thể tương tác trực tiếp proton cacbon liên kết với Một trục phổ phổ 1H-NMR, trục phổ 13C-NMR  Phổ HMBC thể tương tác xa proton cacbon liên kết cách xa liên kết (phổ biến tương tác qua liên kết) Phổ công hưởng từ hạt nhân 1H-NMR đo máy Bruker 500 MHz, phổ 13CNMR, DEPT, HMBC, HSQC đo máy Bruker 125 MHz (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) 2.5.4 Phương pháp tinh chế [9-10]  Kết tinh dung mơi: hịa tan bão hịa tinh thể sau phân lập vào mợt lượng nhỏ dung mơi nhiệt đợ nóng, làm lạnh bay dung dịch có tượng bão hịa hợp chất kết tinh tạp chất chưa đạt nồng đợ bão hịa nằm trong dung dịch, lọc lấy tinh thể Kết tinh lại nhiều lần thu hợp chất có đợ tinh khiết theo yêu cầu  Lặp lại trình sắc kí cợt giống giai đoạn phân lập, lựa chọn phân đoạn tinh khiết thay đổi dung môi rửa giải hay tỉ lệ thành phần dung mơi rửa giải 26  Tiến hành sắc kí cợt giai đoạn phân lập, thay đổi kiểu sắc kí, ví dụ giai đoạn phân lập sử dụng sắc kí hấp phụ pha thuận silica gel, giai đoạn tinh chế sử dụng sắc kí phân bố pha đảo sắc kí thấm qua gel  Sử dụng sắc ký lỏng điều chế để tinh hợp chất phân lập để đạt độ tinh khiết theo yêu cầu sử dụng làm chất chuẩn phân tích 2.5.5 Đánh giá độ tinh khiết phân tích tạp chất Sắc kí lớp mỏng: TLC sử dụng để đánh giá đợ tinh khiết dựa vào có mặt vết vết vết đối tượng phân tích Chất tinh khiết khơng có vết phụ vết phụ nhỏ [11], [12] 2.5.6 Xây dựng liệu nhận dạng chất [12] Các hợp chất đối tượng nghiên cứu đề tài chất biết cấu trúc Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn Việc nhận dạng chất dựa vào: So sánh thông tin phổ, liệu hóa lí, số vật lí chất với tài liệu khoa học thông tin công bố Tập hợp liệu chuẩn khẳng định hợp chất đối tượng nghiên cứu Các phương pháp sử dụng để xây dựng bộ liệu gồm có: Đo phổ tử ngoại khả kiến; đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC) 2.5.7 Phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH [13] Nguyên tắc: chất kháng oxy hóa trung hịa gốc DPPH cách cho hydrogen, làm giảm đợ hấp thụ bước sóng cực đại màu dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt Tính kết quả: % Ức chế gốc tự = 100 x (ODc – ODm)/ ODc Trong đó: ODc: đợ hấp thụ quang học chứng âm 27 ODm: độ hấp thụ quang học mẫu thử Vẽ đồ thị tương quan nồng độ mẫu thử % ức chế gốc tự DPPH Tính IC50 mẫu thử chứng dương vitamin C So sánh giá trị IC50 mẫu thử chứng dương để đưa kết luận Giá trị IC50 thấp chứng tỏ hoạt tính kháng oxy hóa mạnh 2.5.8 Phương pháp sấy thăng hoa [14] Khái niệm: q trình làm khơ vật liệu nhiệt độ thấp (T