KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n hexan của lá cây khôi đốm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN N – HEXAN CỦA LÁ CÂY KHÔI ĐỐM (Sanchezia nobilis Hook.f) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN Em Phạm Thị Hà - sinh viên khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Vũ Đức Lợi - Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội định hướng, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận Khơng vậy, Thầy cịn truyền cho em kiến thức, kĩ bổ ích hành trang giúp em thêm tự tin bước sang ngưỡng cửa sống Em xin cảm ơn ThS Bùi Thị Xuân, giảng viên khoa Y Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, truyền đạt kinh nghiệm thiết thực, giúp đỡ em nhiều trình học tập hồn thành khóa luận Để hồn thành khóa luận này, em xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội mã số: QG.18.20 hỗ trợ kinh phí tạo điều kiện tốt cho em bạn nhóm Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban chủ nhiệm khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, cán bộ, giảng viên khoa Y Dược thầy cô giáo sở khoa Y Dược liên kết đạo tạo tạo điều kiện cho em suốt thời gian năm học tập nghiên cứu chuyên ngành Dược học Trong thời gian làm khóa luận học tập Bộ mơn Dược liệu - Dược học cổ truyền, hướng dẫn, bảo thầy cô, em cố gắng nỗ lực học tập nghiên cứu, nhiên kiến thức hạn hẹp, thời gian nghiên cứu khơng nhiều nên khóa luận em khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận lời nhận xét, góp ý quý báu thầy để khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ em hồn thiện Cuối cùng, em xin kính chúc thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc thành cơng sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2019 Sinh viên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT STT Ký hiệu, viết Tên đầy đủ tắt ORAC Khả hấp thụ gốc tự (Oxygen radical absorbance capacity) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory concentration) CC Sắc ký cột TLC Sắc ký lớp mỏng pTLC Sắc ký lớp mỏng điều chế S Dd EtOH ESI-MS 10 DEPT 11 m/z 12 NMR Singlet Doublet of doublet Ethanol Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Detortionless Enhancement by Polarization Transfer Khối lượng/điện tích Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình vẽ Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Hình ảnh Khơi đốm Hình 1.2 Hình ảnh quan sinh sản Khơi đốm Hình 1.3 Hình vẽ mơ tả vi phẫu thân Hình 1.4 Đặc điểm vi phẫu thân Hình 1.5 Hình vẽ mơ tả vi phẫu Hình 1.6 Đặc điểm vi phẫu Hình 1.7 Hình vẽ mơ tả bột 10 Hình 1.8 Đặc điểm vi phẫu bột 11 Hình 1.9 Hình vẽ mơ tả bột thân 12 Hình 1.10 Đặc điểm vi phẫu bột thân 12 Hình 1.11 Các hợp chất phân lập từ Khơi đốm 14 Hình 1.12 Các hợp chất phân lập từ Khơi đốm 15 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất Khôi đốm phân đoạn n-hexan 25 Hình 3.2 Cấu trúc hợp chất NS1 29 Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất NS2 32 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Sanchezia 1.1.1 Vị trí phân loại chi Sanchezia 1.1.2 Số lượng loài phân bố loài thuộc chi Sanchezia 1.1.2.1 Trên giới 1.1.2.2 Ở Việt Nam .4 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Sanchezia 1.2 Tổng quan Khôi đốm 1.2.1 Phân bố 1.2.2 Đặc điểm thực vật Khôi đốm 1.2.3 Đặc điểm vi phẫu Khôi đốm .7 1.2.4 Đặc điểm vi học bột dược liệu 1.2.5 Thành phần hóa học Khơi đốm 13 1.2.6 Một số tác dụng dược lý nghiên cứu Khôi đốm 15 1.2.7 Công dụng theo Y học cổ truyền Khôi đốm .18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1.Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu .20 2.2.1 Phương pháp chiết xuất phân lập hợp chất 20 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Kết chiết xuất phân lập hợp chất 24 3.2 Bàn luận 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Với điều kiện thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam có hệ sinh thái phong phú đa dạng, tiềm lớn tài nguyên dược liệu nói riêng tài nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khống vật) nói chung Theo Danh lục thuốc Việt Nam số 12.000 lồi thực vật Việt Nam có gần 5.000 lồi có cơng dụng làm thuốc, điều thể đa dạng chủng loại dược liệu với phân bố rộng khắp nước Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, cha ông ta phát hiện, tích lũy kho tri thức khổng lồ dược liệu y học cổ truyền với nhiều thuốc dân gian Ngày nay, nhà khoa học dược, tập đoàn dược phẩm lớn trọng vào sàng lọc từ thiên nhiên để tìm hoạt chất sinh học có dược tính mạnh hơn, độc với chi phí nghiên cứu phát triển thấp so với tổng hợp hóa học Đẩy mạnh khai thác tài nguyên thiên nhiên dựa thuốc dân gian để phát triển thành sản phẩm thuốc có tác dụng chăm sóc sức khỏe Nhiều tài liệu nghiên cứu nước cho thấy Khơi đốm có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, diệt trùng, ngồi cịn có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm hiệu [20, 21] Từ lâu người dân vùng dân tộc thiểu số dùng Khôi đốm chữa bệnh viêm dày phổ biến Cây Khôi đốm thuốc chi Sanchezia Nguyễn Tiến Bân liệt kê “Danh mục loài thực vật Việt Nam”, phân bố chủ yếu miền núi Tây Giang - Quảng Nam, Hòa Vang - Đà Nẵng, miền núi Chiêm Hóa, Na Hang - Tuyên Quang, tỉnh Nam Định [1] Chi chủ yếu phân bố phía Tây Nam Mỹ, số lồi phân bố vùng phía Bắc Đơng Bắc Bắc Mỹ, Trung Mỹ, vùng biển Caribbean số đảo Thái Bình Dương [9] Ở Việt Nam có số nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Khơi đốm năm 2016, TS Vũ Đức Lợi nhóm nghiên cứu cơng bố nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống viêm dịch chiết từ Xăng sê hay cịn gọi Khơi đốm, ngồi cịn có số đề tài nghiên cứu báo cáo khóa luận tốt nghiệp dược sĩ dược sĩ Nguyễn Thị Mai vào năm 2017 Vũ Thị Mây vào năm 2018 Tuy nhiên, đề tài nghiên cứu cịn chưa nhiều, để góp phần cung cấp sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu Khơi đốm chăm sóc sức khỏe, chúng tơi lựa chọn tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất phân lập số hợp chất từ phân đoạn n – hexan Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)” với mục tiêu sau: Chiết xuất phân lập số hợp chất từ phân đoạn n – hexan Khôi đốm Xác định cấu trúc hợp chất phân lập CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Sanchezia 1.1.1 Vị trí phân loại chi Sanchezia Theo “Hệ thống phân loại ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” [1, 26] tác giả A.Takhtajan”, vị trí phân loại chi Sanchezia là: Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnolipphyta Lớp Cỏ tháp bút: Equisetopsida C Agardh Phân lớp Mộc lan: Magnoliidae Novák ex Takht Bộ Hoa môi: Lamiales Họ Ơ rơ: Acanthaceae Chi: Sanchezia 1.1.2 Số lượng lồi phân bố loài thuộc chi Sanchezia 1.1.2.1 Trên giới Chi Sanchezia đặt theo tên giáo sư thực vật học Cadiz Jose Sanchez vào kỷ XIX Cadiz, Tây Ban Nha [15, 19] Lần vào năm 1794, chi Ruiz Pavon mơ tả có lồi Đến năm 1964, Leonard Smith cơng bố có 59 lồi, có 26 lồi mơ tả lần đầu tiên, đồng thời cơng bố khóa phân loại cho 59 lồi Tuy nhiên, vào năm 2015, Tripp Koenemann thống kê lại lịch sử phát triển lập danh mục 55 loài thuộc chi Sanchezia [28] Các nhà khoa học thực dự án The Plant list xác định có 75 tên lồi thuộc chi, có 54 tên khoa học chấp nhận (72,0%), 12 tên Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất Khơi đốm phân đoạn n-hexan ❖ Giai đoạn phân lập 1: Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột silicagel với sắc ký cột cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck) Chuẩn bị cột: - Cột sắc ký có đường kính cm, lắp thẳng đứng giá, tráng cồn - Chất nhồi cột: Silicagel hoạt hóa 100oC/2h tủ sấy lấy để nguội bình hút ẩm - Lót lớp bơng đáy cột, đổ vào cột 40ml dichlomethan, mở khóa cho dung mơi chảy từ từ để đẩy hết bọt khí lớp bơng ngồi Khi lớp dung mơi cịn khoảng 3cm khóa cột - Nhồi cột: trộn silicagel với lượng vừa đủ dung môi dichlomethan thành hỗn dịch đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén, hết bọt khí phân bố đều, mặt, rửa thành cột dichlomethan Chiều dài cột silicagel 15cm - Ổn định cột: kiểm tra để đảm bảo cột vị trí thẳng đứng, nén cột cách dùng bóp cao su gõ nhẹ, đều, đối xứng xung quanh thân cột tới khơng cịn bọt khí cột, để cột ổn định Tiến hành sắc ký cột hấp phụ: - Mở khóa cột cho dung mơi dichlomethan chảy đến sát bề mặt silicagel, khóa cột lại - Đưa chất lên cột: 8g cắn n-hexan phân lập cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel sử dụng hệ dung môi n-hexan : dichloromethan (15:1; v/v) Điều chỉnh tốc độ rửa giải 1ml/phút - Hứng dịch rửa giải vào ống kiểm tra SKLM, gộp ống từ 2- 16, thu phân đoạn H1, gộp ống từ 17 - 20, thu phân đoạn H2, tương tự thu phân đoạn H3 ❖ Giai đoạn phân lập 2: Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột silicagel với sắc ký cột cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck) Tiến hành chuẩn bị cột tương tự giai đoạn với cột sắc ký có đường kính 3cm - Tiến hành sắc ký cột cắn phân đoạn H1 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi n-hexan : dichloromethan (10:1; v/v), kiểm tra ống hứng dịch rửa SKLM, gộp ống có thành phần bốc dung môi thu phân đoạn nhỏ gồm H1.1, H1.2, H1.3, H1.4 - Phân đoạn H1.1 tiếp tục phân tách cột sắc ký silicagel, rửa giải hệ dung môi n-hexan : ethylacetat (10:1; v/v) thu hợp chất ký hiệu NS1 (12 mg) Phân đoạn H1.2 tiếp tục phân tách cột sắc ký silicagel, rửa giải hệ dung môi n-hexan : dichlometan (5:1; v/v) thu hợp chất ký hiệu hợp chất NS2 (18mg) Hợp chất NS1: Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) Tinh thể có màu trắng đục, tnc = 285 0C, Rf = 0,45 (dichloroform : methanol, 8:1) Hợp chất NS1 phản ứng với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH cho and màu hồng tươi chuyển dần xanh tím IR (KBr, cm-1) 3430 (OH), 2938 (CH), 1635 (C = CH), 1077 (C-O-C), 1021 (C-O-C) ESI-MS:m/z 599,1 [M+Na]+ Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT chất NS1 chất tham khảo trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- 13C-NMR NS1 Vị trí C DEPT δCNS1 ppm δCOa,b ppm CH2 36,9 37,3 CH2 31,2 29,4 76,9 78,5 CH CH2 39,2 38,4 C 140,4 141,3 121,2 122,3 CH δHNS1 (ppm) δHOa,c (ppm) (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 3,54 sextet (7,0) 3,56(d; 7,0) 5,35 (d; 5,0) 5,36(d; 5,0) 5,35 (m) CH2 31,5 31,8 CH 31,2 30,6 CH 49,7 50,7 10 C 36,2 36,8 11 CH2 20,4 20,4 12 CH2 38,4 40,3 13 C 41,9 42,7 14 CH 55,5 56,9 15 CH2 25,4 23,8 16 CH2 29,1 26,7 17 CH 56,3 56,6 18 CH3 11,8 12,4 19 CH3 19,1 19,6 20 CH 35,3 34,5 21 CH3 18,6 19,4 22 CH2 33,2 32,6 23 CH2 27,6 24,9 24 CH 45,2 46,4 25 CH 28,8 28,9 0,78 (m) 26 CH3 19,7 19,8 0,79-0,87 (m) 0,94 (d; 5,4) 27 CH3 18,9 20,1 0,79-0,87 (m) 0,89 (d; 6,3) 28 CH2 22,4 21,7 0,88 (m); 29 CH3 11,8 12,5 0,79-0,87 (m) 1' CH 100,9 103,0 4,14 (d; 8,0) 2' CH 76,6 75,8 3,44 (m) 3' CH 73,5 79,0 3,25 (m) 4' CH 70,1 72,1 3,32 (m) 0,68 (s) 0,67(s) 0,94 (s) 0,92 (d; 6,5) 1,00 (d; 6,3) 0,87 (m) 5' CH 76,7 78,9 3,48 (m) 6' CH2 61,1 63,3 3,75 (d; 12,0) a) đo CDCl3, b )100 MHz, c )300 MHz, G) chất tham khảo daucosterol Hình 3.2: Cấu trúc hợp chất NS1 Hợp chất NS1 phản ứng với thuốc thử H2SO4 10 %/EtOH cho màu hồng tươi chuyển xanh tím dần chứng tỏ NS1 thuộc nhóm sterol Phổ IR xuất đỉnh hấp thụ cực đại v* max 3430 cm-1 đặc trưng cho nhóm O-H; đỉnh v* * max max 2938 cm- đặc trưng cho dao động hóa trị liên kết C-H; đỉnh 1635 đặc trưng cho liên kết >C=C