KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) nghiên cứu thành phần hóa học cây lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) thu hái

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) THU HÁI TẠI THANH HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN Qua năm học tập rèn luyện Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, với bảo giảng dạy nhiệt tình Thầy Cơ giúp cho em tiếp thu kiến thức lý thuyết thực hành vơ hữu ích Khóa luận kết việc tiếp thu, vận dụng kiến thức học cố gắng nỗ lực thân em Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Cơng nghệ sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Lê Quang Huấn – phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Hà Thị Thanh Hương – Nghiên cứu viên Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để em nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền anh chị nghiên cứu viên phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người theo sát động viên, q of Trong q trình nghiên cứu đề tài khó tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp q báu Thầy Cơ để luận văn em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2019 Sinh viên i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN Vài nét chi Anoectochilus 1.1 Đặc điểm hình thái 1.2.Phân bố 1.3 Công dụng tác dụng 2 Tổng quan Lan kim tuyến 2.1.Vị trí phân loại 2.2.Đặc điểm hình thái 2.3 Sinh học sinh thái 2.4 Phân bố tình trạng 2.5 Thành phần hóa học 2.6 Công dụng 10 2.7 Tác dụng sinh học số hợp chất Lan kim tuyến 10 2.7.1 Quercetin 10 2.7.2 Isorhamnetin 11 2.7.3 .Acid ferulic 12 2.7.4 Các thuốc sản phẩm biết đến 13 ii 2.8.Vấn đề cần giải 13 CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1.Nguyên liệu, hóa chất 14 ii 2.2.Phương tiện nghiên cứu 14 2.3.Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1.Phương pháp chiết xuất cao Lan kim tuyến 14 2.3.2.Phương pháp định tính 17 3.3.Phương pháp định lượng 17 CHƯƠNG III KẾT QUẢ 20 3.1.Kết định tính Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic .20 3.2.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic 21 3.2.1.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin dịch chiết HPLC 21 3.2.1.1.Điều kiện sắc ký 21 3.2.1.2.Kiểm tra độ thích hợp hệ thống 21 3.2.1.3.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin 22 3.2.1.4.Kết định lượng Quercetin, Isorhamnetin 25 3.2.2.Định lượng Acid ferulic dịch chiết HPLC 26 3.2.2.1.Điều kiện sắc ký 26 3.2.2.2.Kiểm tra độ thích hợp hệ thống 27 3.2.2.3.Định lượng Acid ferulic 28 3.2.2.4.Kết định lượng Acid ferulic 30 BÀN LUẬN 31 KẾT LUẬN 33 KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT HPLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) dd Dung dịch ACN Acetonitril MeOH Methanol PBS Muối đệm phosphate IC50 Nồng độ ức chế 50% RLAR Enzyme Lens Aldose Reductase (NH4)2SO4 Amoni sunfat KH2PO4 Kali đihiđrophotphat MgSO4.7H2O Magie sulfat CaCl2.2H2O Calcium Chloride NaCl Natri clorua C Nồng độ CV Giá trị nồng độ UV Tử ngoại Vis Khả kiến STT Số thứ tự TB Trung bình Area Diện tích píc RT Thời gian lưu Tailling factor Hệ số kéo đuôi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Lan kim tuyến Bảng 3.1 Kết sắc ký dung dịch chuẩn 21 Bảng 3.2 Số liệu pha đường chuẩn 22 Bảng 3.3 Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích píc Quercetin 23 Bảng 3.4 Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích píc Isorhamnetin 24 Bảng 3.5 Kết định lượng Quercetin 25 Bảng 3.6 Kết định lượng Isorhamnetin 26 Bảng 3.7 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống 27 Bảng 3.8 Kết khảo sát mối tương quan nồng độ dung dịch 28 Bảng 3.9 Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích píc Acid ferulic .29 Bảng 3.10 Kết xác định nồng độ Acid ferulic mẫu thử 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo Quercetin, C15H10O7 11 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo Isorhamnetin, C16H12O7 12 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo Acid ferulic, C10H10O4 .12 Hình 2.1 Phổ hấp thụ Quercetin 17 Hình 2.2 Phổ hấp thụ Isorhamnetin 18 Hình 2.3 Phổ hấp thụ Acid ferulic 18 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-Vis mẫu cao lên men Lan kim tuyến 20 Hình 3.2 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích píc nồng độ Quercetin 23 Hình 3.3 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích píc nồng độ Isorhamnetin 24 Hình 3.4 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích píc nồng độ Acid ferulic 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê Viện Dược liệu, đến Việt Nam ghi nhận 5000 loài thực vật nấm, 408 lồi động vật 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc Với hệ sinh thái phong phú, Việt Nam đánh giá quốc gia có tiềm lớn việc nuôi dưỡng phát triển thuốc q Do xu hướng nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh ngày phát triển mạnh với ưu điểm bật dược liệu độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển hóa thể Họ Lan (Orchidaceae) họ thực vật đa dạng Việt Nam, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi Thơng thường Lan sử dụng làm cảnh Ngồi ra, có nhiều lồi Lan cịn sử dụng làm thuốc Chi Lan kim tuyến Anoectochilus Việt Nam thống kê 12 lồi, có lồi Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume biết đến nhiều giá trị làm cảnh mà giá trị làm thuốc [1] Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ lâu nên loài Lan kim tuyến bị đe doạ nghiêm trọng, bị tuyệt chủng tự nhiên khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, Lan kim tuyến xếp nhóm IA Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác mục đích thương mại nhóm thực vật nguy cấp EN A1a,c,d sách đỏ Việt Nam năm 2007, phần thực vật [2,3] Nhằm bảo tồn phát triển nguồn tài nguyên quý này, nhiều đơn vị nghiên cứu nước tập trung vào việc nhân giống nuôi trồng Lan kim tuyến Khóa luận thực nhằm mục đích tìm hiểu thành phần hóa học Lan kim tuyến Từ đó, định hướng ứng dụng loại dược liệu góp phần vào công bảo tồn nâng cao giá trị sử dụng Khóa luận thực với đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thu hái Thanh Hóa” với mục tiêu: Chiết xuất cao Lan kim tuyến Định tính số hợp chất mẫu Xác định hàm lượng số hợp chất mẫu cao phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao CHƯƠNG I TỔNG QUAN Vài nét chi Anoectochilus 1.1 Đặc điểm hình thái Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) chi thực vật có hoa thuộc họ Lan (Orchidaceae) phân họ tên (Orchidoideae) Cái tên "Lan kim tuyến" hay "Lan kim hoàn” bắt nguồn từ đường gân đẹp phiến loài lan Phần lớn chúng thực vật sinh sống đất có kích thước nhỏ, nhiên vài loài sinh sống bờ đá, với màu xanh lục mang màu sắc khác (tùy theo lồi), có bề mặt mịn nhung mang mạng lưới gân phức tạp Cụm hoa trung tâm mang vài hoa mọc chúc xuống đất bao phủ lông với cánh môi lớn bật Tràng hoa với đài hoa mặt lưng tạo thành cấu trúc giống mũ trùm đầu Mỗi hoa có hai nhụy hai nhị [25] 1.2 Phân bố Chi Anoectochilus (Orchidaceae), bao gồm 40 loài, phổ biến khắp vùng nhiệt đới, từ Ấn Độ, Himalayas, Đông Nam Á đến Hawaii Trong số loài thực vật này, A formosanus A koshunensis phân bố Đài Loan (Trung Quốc) Okinawa (Nhật Bản) Anoectochilus roxburghii, phân bố miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Sri Lanka, Ấn Độ Nepal [17] 1.3 Công dụng tác dụng Một số loài thuộc chi sử dụng loại thuốc dân gian Trung Quốc, chẳng hạn A formosanus Hayata, A koshunensis Hayata, A roxburghii (Wall.) Lindl Theo y học cổ truyền Đài Loan, A formosanus Hayata tươi khô nấu nước uống trị chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lách chứng đau nhói ngực Người Trung Quốc cho uống trà làm từ A formosanus Hayata chữa chứng bệnh gan phổi [23,30] Đại học ông nghệ Y dược ao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan sử dụng A formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược thể kháng virus c m A Nhiều nghiên cứu phát A formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức tim mạch Dịch chiết A formosanus Hayata có khả kháng virus, kháng sưng viêm bảo vệ gan Chiết xuất A formosanus khơ có chứa 4-hydroxycinnamic acid, β-sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy butanoid glucosides acid [28] Gần đây, hợp chất 3(R)- 3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên thương mại kinsenoside chiết xuất từ A formosanus A koshunensis chống tăng huyết áp hiệu [29] Anoectochilus roxburghii, gọi "Vua thảo dược" để điều trị sốt, bệnh phổi, viêm màng phổi, bệnh gan, tăng huyết áp trẻ em suy dinh dưỡng Trung Quốc (Viện Y học cổ truyền Trung Quốc Phúc Kiến 1982) Tuy nhiên, thơng tin khoa học hoạt tính sinh học, chức sinh lý hiệu lâm sàng cụ thể lan thảo dược hạn chế Khơng có báo cáo nghiên cứu thành phần hóa học A roxburghii có hồ sơ dược lý (Li et al 1995) nguồn tự nhiên A roxburghii phần lớn cạn kiệt Tổng quan Lan kim tuyến 2.1 Vị trí phân loại • Lan Kim Tuyến có tên khoa học Anoectochilus setaceus Blume • Tên đồng nghĩa + Chrysobaphus roxburghii Wall 1826 + Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall ex Lindl 1840 + Anoectochilus regalis Blume 1858 • Bộ: Asparagales • Họ: Phong lan Orchidaceae • Phân họ: Orchidoidea • Chi: kim tuyến (Anoectochilus) • Loài: A setaceus • Tên gọi khác: kim cương, kim tuyến, kim tuyến tơ, lan gấm, mộc sơn, thạch tùng 3.2.1.4 Kết định lượng Quercetin, Isorhamnetin Lọc mẫu thử qua màng lọc 0,45 µm, tiêm sắc ký Tiến hành mẫu độc lập Cơng thức tính kết Quercetin Nồng độ Quercetin dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu) C1 (µg/mL) = St: Diện tích píc Quercetin dung dịch tiêm sắc ký C(g/mL) = % Quercetin dịch mẫu thử = Khối lượng Quercetin (g) có 100 mL dung dịch mẫu thử % Quercetin = C x 100 Bảng 3.5 Kết định lượng Quercetin Quercetin Mẫu Area Nồng độ mẫu tiêm SK (µg/mL) Nồng độ ban đầu (g/mL) % Quercetin T1 641976 5.003 0.00000500 0.000500 T2 699912 5.440 0.00000544 0.000544 T3 698433 5.428 0.00000543 0.000543 TB 680107 5.290 0.00000529 0.000529 CV(%) 4.9 4.7 4.7 4.7 Isorhamnetin Nồng độ Isorhamnetin dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu) C1 (µg/mL) = St: Diện tích píc Isorhamnetin dung dịch tiêm sắc ký C(g/mL) = % Isorhamnetin dịch mẫu thử = Khối lượng Isorhamnetin (g) có 100 mL dung dịch mẫu thử % Isorhamnetin = C x 100 Bảng 3.6 Kết định lượng Isorhamnetin Isorhamnetin Mẫu Area Nồng độ mẫu tiêm SK (µg/mL) độ ban đầu Nồng (g/mL) T1 130282 1.255 0.00000125 0.000125 T2 134040 1.289 0.00000129 0.000129 T3 134871 1.296 0.00000130 0.000130 TB 133064 1.280 0.00000128 0.000128 CV(%) 1.8 1.7 1.7 1.7 3.2.2 Định lượng Acid ferulic dịch chiết HPLC 3.2.2.1 Điều kiện sắc ký + Thiết bị: HPLC Shimadzu + Cột Rp18; 250 x 4,6 mm; 5µm Seri cột: H16-248657 + Bảo vệ cột: Rp18; x mm + Nhiệt độ cột: 40 C % Isorh amnetin + Detector: PDA, λ = 313 nm + Tốc độ dòng: 1,5mL/phút + Autosampler: C + Thể tích tiêm: 20 µL + Pha động: A N : Đệm CH3COONa 0,05M pH 4,0 = 12:88 (%) 3.2.2.2 Kiểm tra độ thích hợp hệ thống Tiến hành sắc ký lần dung dịch chuẩn có nồng độ Acid ferulic µg/mL theo điều kiện Kết trình bày bảng 4.7 Bảng 3.7 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống STT RT Area 22.989 212878 1.023 23.025 212035 1.106 23.289 214355 1.071 23.289 217426 1.125 23.505 214443 1.086 23.561 216413 1.069 TB 23.276 214592 1.080 CV% 1.0 1.0 3.3 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu < Độ lệch chuẩn tương đối đáp ứng < => chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao Tailing factor 3.2.2.3 Định lượng Acid ferulic Pha dãy dung dịch chuẩn Acid ferulic có nồng độ 1,0 – 5,0 µg/mL Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc nồng độ Dựng phương trình hồi quy tuyến tính Cách pha đường chuẩn Acid ferulic Hồ tan xác 20 mg chất chuẩn Acid erulic vào bình định mức 20mL, hịa tan thêm vừa đủ thể tích MeOH để thu dung dịch có nồng độ Acid ferulic khoảng 1000 µg/mL => thu dd (1) Hút 1,0mL dd (1)/ hịa tan 10mL MeOH (~ 100 µg/mL) (WS1) Hút 1,0mL dd (WS1) vào bình 10mL, bổ sung MeOH vừa đủ (~ 10 µg/mL) (WS2) Pha dãy dung dịch chuẩn Acid ferulic có nồng độ 1,0 – 5,0 µg/mL Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc nồng độ Dựng phương trình hồi quy tuyến tính Bảng 3.8: Kết khảo sát mối tương quan nồng độ dung dịch Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ Acid ferulic (µg/mL) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Thể tích WS2 (µL) 100 200 300 400 500 Thể tích MeOH (µL) 900 800 700 600 500 Bảng 3.9: Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích píc Acid ferulic Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (µg/mL) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 67544 139350 210907 279505 366017 Area Phương trình hồi quy Y = 72272X – 5278 (R = 0.999) 400000 and y = 72272x - 5278.8 R² = 0.9996 320000 A 240000 re a 160000 80000 0 Medici ne of Nồng độ (µg/mL) Hình 3.4 Đường biểu diễn mối tương quan diện tích píc nồng độ Acid ferulic 3.2.2.4 Kết định lượng Acid ferulic Lọc mẫu thử qua màng lọc 0.45 µm, tiêm sắc ký Tiến hành mẫu độc lập Cơng thức tính kết Nồng độ Acid ferulic dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu) C1 (µg/mL) = St: Diện tích píc Acid ferulic dung dịch tiêm sắc ký C (g/mL) = % Quercetin dịch mẫu thử = Khối lượng Acid ferulic (g) có 100 mL dung dịch mẫu thử % Acid ferulic = C x 100 Bảng 3.10: Kết xác định nồng độ Acid ferulic mẫu thử Acid ferulic Mẫu Area Nồng độ mẫu tiêm SK (µg/mL) Nồng độ ban đầu (g/mL) % Acid ferulic T1 180197 51.3 0.0010265 0.1027 T2 189895 54.0 0.0010802 0.1080 T3 177179 50.5 0.0010098 0.1010 TB 182424 51.9 0.0010389 0.1039 CV(%) 3.6 3.5 3.5 3.5 BÀN LUẬN Chiết xuất cao Lan kim tuyến Công nghệ sử dụng nghiên cứu để thu nhận cao có hoạt chất quý, có tác dụng chữa bệnh từ Lan kim tuyến công nghệ lên men Trong công nghệ lên men ứng dụng đề tài nghiên cứu sử dụng chủng nấm để thu nhận chất thay cho công nghệ tách chiết truyền thống nước cồn nhằm tăng hiệu tách chiết tăng tính đa dạng chất có hoạt tính sinh học sản phẩm chiết xuất Theo cơng nghệ truyền thống việc chiết xuất hoạt chất từ thảo dược thực công nghệ chiết sử dụng nước sử dụng cồn Khi sử dụng nước: dịch chiết thu chứa chủ yếu chất ưa nước (các chất hòa tan nước), sử dụng cồn lại chủ yếu thu chất khơng hịa tan nước Vì vậy, việc sử dụng công nghệ lên men xem công nghệ khắc phục hạn chế nêu Công nghệ lên men nhiều nhà khoa học nước ứng dụng để tạo sản phẩm có giá trị kinh tế chữa bệnh đồng thời tiết kiệm nguồn nguyên liệu khả chiết xuất gần tối đa hợp chất quý nguyên liệu ban đầu Để đạt hiệu tách chiết tạo cao chứa hợp chất có tác dụng chữa bệnh từ Lan kim tuyến, cần khảo sát để lựa chọn điều kiện lên men tối ưu (như nhiệt độ, nồng độ chủng giống, cách xử lý nguyên liệu ban đầu trước lên men, thời gian lên men, thu nhận sản phẩm sau lên men,…) để thu nhận cao từ Lan kim tuyến đạt yêu cầu chất lượng Quy trình thu nhận cao ổn định áp dụng vào sản xuất Định tính định lượng hợp chất có hoạt tính sinh học dịch lên men Lan kim tuyến + Có thể sử dụng phổ hấp thụ UV-Vis để sơ xác định hợp chất quan trọng mẫu cao Lan kim tuyến + Phổ hấp thụ mẫu cao Lan kim tuyến cho thấy đỉnh hấp thụ rõ ràng, tập trung bước sóng