Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài Lan Kim Tuyến (anoectochilus setaceus blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý

Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Phí Thị Cẩm Miện

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Phí Thị Cẩm Miện

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Trung Thành

LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P - 0,5

(Leant Significant Difference)

αNAA α-naphthylacetic acid

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

MỤC LỤC 5

MỞ ĐẦU 7

1.1 Đặt vấn đề 7

CHƯƠNG I 8

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến 8

1.1.1 Đặc điểm hình thái 9

1.1.2 Đặc điểm phân bố 11

1.2 Nhân giống cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) 13

1.2.1 Nhân giống bằng hạt 13

1.2.2 Nhân giống bằng cây con 13

1.2.3 Phương pháp giâm cây 14

1.2.4 Nhân giống in vitro 14

1.2.4.1 Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro 14

1.2.4.2 Ý nghĩa của nhân giống in vitro 15

1.2.4.3 Các phương thức nhân giống vô tính 18

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 18

1.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy 18

1.3 2 Ảnh hưởng của các thành phần hóa học 19

1.3 3 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý 23

1.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện ra cây 24

1.4 Quy trình sản xuất cây cấy mô 25

1.5 Tình hình nghiên cứu trên cây Lan Kim tuyến 26

1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 26

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 27

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

2.2 Mục tiêu nghiên cứu 28

2.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 29

2.4 Nội dung nghiên cứu 29

2.5 Phương pháp nghiên cứu 29

2.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

2.5.2 Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu 35

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro 39

3.1.1 Xác định chất khử trùng thích hợp 39

3.1.2 Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro 42

3.1.2.1 Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch 42

3.1.2.2 Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro 44

3.2 Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp 45

3.2.1 Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A setaceus) 45

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân 47

3.2.2.1 Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân 47

3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Lan Kim tuyến (A setaceus) 50

3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân 53

3.3 Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 56

3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ 56

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ 58

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67

4.1 Kết luận 67

4.2 Đề nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 75

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế

kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia

chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati)

Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi Thông thường lan được

sử dụng làm cảnh Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc

Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall ex Lindl phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả

nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007 Vì vậy, nghiên cứu kỹ

thuật nhân giống loài lan Kim tuyến - Anoectochilus setaceus Blume được

triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này

Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu

đề tài:“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ

Orchidoideae Trên thế giới đã thống kê được 51 loài Ở Việt Nam hiện thống kê

được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được

biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.)

Họ: Phong lan (Orchidaceae)

Bộ: Phong lan (Orchidales)

Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xoè sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt Cuống lá dài 2 - 3 cm Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn Bầu dài 13mm, có lông thưa

Mùa hoa tháng 2, tháng 4 Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 - 1600m Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng

Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng) Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,…

Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến) Trước đó, lan

dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958) Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này

Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan

Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3,

tháng 3/2006, trang 359-363) Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn…

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất

a Thân rễ

Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng,

bò dài Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm Đường kính thân rễ

từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm Thân rễ thường

có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông

b Thân khí sinh

Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất,

ít khi mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87 Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt

c Rễ

Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một

mấu trên thân rễ Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể Số

rễ trên một cây thường từ 3 - 10, trung bình là 5,4 Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 - 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm

d Lá

Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 - 4 cm, trung bình là 3,12 cm Lá có màu nâu

đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với

5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Số lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6, thông thường có 4 lá Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt

e Hoa, quả

Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 6 - 10 mm, màu hồng Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi Mùa hoa tháng 10 - 12 Mùa quả chín tháng 12 - 3 năm sau

Hình 2.1 Cây (A) và hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume

1.1.2 Đặc điểm phân bố

1.1.2.1 Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay

lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới

- Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây

gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc

bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v Chiều cao của

tầng A2 từ 15-25 m

- Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum

Thân khí sinh

Thân ngầm

bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v Chiều cao của tầng A3 từ 8-

15m

- Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v…

- Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v…

- Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền

(Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae) Điển

hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v…

- Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình

khoảng 20 cây/ha Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu

1.1.2.2 Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh

- Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến

phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90% Đặc điểm của cây bụi

và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng

từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng

- Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát

ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng

1.1.2.3 Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao

- Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như

chân núi, sườn núi, đỉnh núi

- Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập

trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình

1.2 Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus)

1.2.1 Nhân giống bằng hạt

Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao

phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus Sự thụ phấn

của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa

Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây

Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt

1.2.2 Nhân giống bằng cây con

Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách

để trồng riêng Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất

1.2.3 Phương pháp giâm cây

Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới

Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a]

1.2.4 Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công

nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình, 1997)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:

Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống

Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo

Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ

Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen

1.2.4.1 Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974)

Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân

giống của con người Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng

ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại

1.2.4.2 Ý nghĩa của nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống

vô tính Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính

in vitro là công cụ vô cùng hữu ích Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật

nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống

vô tính in vitro là do:

Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái

và thành phần hóa học (Calson, 1964) Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng

tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến

78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)…

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 - 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc

để nhân giống rất lãng phí, tốn kém

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng

như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có

nhiều ưu điểm nổi trội như:

- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987)

- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế

- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh Trong công tác nhân giống, vấn đề

nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952) Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus

M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975)

- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt

kém trong những điều kiện sinh thái nhất định Như ở cây cọ dầu, phải mất

10-15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới

rất khó khăn Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể

cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970)

- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục

- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội

- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen

Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi

một số nhược điểm như:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật

- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại

và lao động có tay nghề

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy từ callus)

Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả

cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật

1.2.4.3 Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo

Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau:

- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách

- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo

• Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983) Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào

mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên

• Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy

1.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau

và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu

Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên

bề mặt của mô cấy

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu

dễ bị nhiễm

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây

giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh

hưởng quyết định tới nuôi cấy

1.3 2 Ảnh hưởng của các thành phần hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong

các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid

và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:

Các nguyên tố khoáng

Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm

là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng

• Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối

vô cơ Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…

• Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau Mangan, iốt, đồng, coban, bo,

mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,…

Chất hữu cơ bổ sung

• Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006) Các loại vitamin

B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro Tuy

nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy

• Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết

Nguồn cacbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định Ngoài

ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose

Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000) Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây

Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn

carbohydrate ngoại sinh cao hơn Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường

Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí

cao Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển

từ điều kiện in vitro ra vườn ươm Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn

ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80

% theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005)

Chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất

• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử

Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự

phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983)

Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo

Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin

tự nhiên, quan trọng nhất là IAA Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm

giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA NAA

• Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của

tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002) Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994) Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine) Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007) Do vậy, khi

sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng

về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành

mô sẹo

Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng

mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S.C Van Winkle et al, 1995) Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990)

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở

Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy,

nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích thích

tạo củ của hoa Lili (Nhut et al, 2001), tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê Thị Kim Đào, 2001)…

Các chất hữu cơ bổ sung

Ngoài các thành phần dinh dưỡng bắt buộc kể trên trong môi trường nuôi

cấy mô tế bà thực vật in vitro, người ta còn bổ sung thêm một số thành phần hỗn

hợp tự nhiên khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, nước ép cà chua, khoai tây, chuối… Các thành phần này thường chứa nguồn dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng đa dạng như amino acid, đường, vitamin, nucleic acid, auxin, cytokinin

Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy Tất cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et al.,(1961) cho thấy trong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Inositol, auxin, cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20

%

Tác nhân làm đặc môi trường

Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở dạng lỏng hoặc đặc, nhiều loại môi trường nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải sinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử dụng phổ biến nhất Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose

có thể cũng được sử dụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc

1.3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường,…

Ánh sáng

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòa một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây Tùy từng loại nuôi cấy, yêu cầu cường độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo, thường không cần ánh sáng Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi cấy thông qua tác động nên trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng cũng như dinh dưỡng khoáng Thông thường trong

phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/ ngày với cường độ 2000 lux

Nhiệt độ

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ

220C đến 250C Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,…

pH môi trường

pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 - 5,8

Trạng thái môi trường

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây

1.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra

ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng

Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…

Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở Vì vậy, khi

chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương Cần cung

cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây

Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy

in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể Để

tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây

1.4 Quy trình sản xuất cây cấy mô

Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn:

a) Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn

cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…

Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ

ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991)

b) Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính

c) Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 - 300C

Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng

1-2 tháng tùy từng loại cây Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 - 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu

d) Tái sinh rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng

e) Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra

ngoài vườn ươm Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường

1.5 Tình hình nghiên cứu cây lan Kim tuyến

1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu chủ yếu ở Trung

Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005)

Chow và CS (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân

sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng Năm 1987, Liu và

CS đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô Cũng năm 1987, Ho và CS, năm 1992, Lee và CS đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu nuôi cấy

Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim

tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào

mẫu là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối Môi trường được

sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA

Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus Formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml +

2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA + 2% than hoạt tính

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được xếp trong

nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc gia và Khu Bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen Ở Việt Nam do bị người dân thu hái tự phát để bán làm thuốc nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố Do vậy, có thể nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim

tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa

có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn

Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình

thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến này như:

Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban

đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính

Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung

Thành Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro

loài Lan kim tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl

N ă m 2 0 1 0 , Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên

cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim

tuyến.”

Các tác giả trên đã bước đầu tiến hành thăm dò ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và bước đầu tiến hành nhân giống thử nghiệm lan Kim tuyến nhưng chưa tác giả nào đưa ra quy trình hoàn chỉnh để nhân giống loài lan

Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Do đó, trong nghiên cứu này, chúng

tôi đặc biệt chú trọng đến nghiên cứu nhân nhanh và quy trình ra cây hoàn chỉnh cho loài thảo dược quý hiếm này

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Hình 2.1 Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ Vườn quốc gia Tam Đảo,

Vĩnh Phúc

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

+ Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng công nghệ tế bào Thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

+ Thời gian: từ tháng 11/2011 - 12/2012

2.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy thích hợp, tìm ra các môi

trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro

- Xác định điều kiện ra cây và bước đầu đưa cây ra vườn ươm

2.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho

công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

2.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cho lan Anoectochilus setaceus Blume

- Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume

như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Nghiên cứu xác định chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan vào mẫu thích hợp

2.4.2 Nghiên cứu xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

(Anoectochilus Setaceus Blume)

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Điều kiện nuôi cấy

- Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210C

- pH của môi trường là: 5,4

CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s

CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s

CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s

CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s)

CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s)

CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s)

CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút

CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút

CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút

Thí nghiệm 2 Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch

khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1)

Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm

Thí nghiệm 3 Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro

Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar

Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu

B Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu

Thí nghiệm 4 Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A setaceus)

Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*) Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là:

Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar

CT1: Knud* + Nền môi trường

CT2: MS + Nền môi trường

CT3: Knudson C + Nền môi trường

Thí nghiệm 5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các

công thức là:

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar

CT1: ĐC

CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP

CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP

CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP

CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP

CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin

CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin

CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin

CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin

Thí nghiệm 6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar

CT1: ĐC

CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA

CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA

CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA

CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA

CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA

CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA

CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA

CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA

CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA

CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA

Thí nghiệm 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường:

Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l

agar

CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA

CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA

CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA

CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA

CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA

CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA

C Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra

rễ Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu

Thí nghiệm 8 Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ

CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar

Thí nghiệm 9 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

Các thí nghiệm được tiến hàn trên nền môi trường nghèo dinh dưỡng

CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar CT2: Nền + 1% than hoạt tính

- Số cây theo dõi

- Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm

Thí nghiệm 10 Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro

Giá thể:

CT 1: Giá thể 100% dớn

CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa

CT 3: Giá thể 100% xơ dừa

CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen

Thí nghiệm 12 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến

tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được

rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50% Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau:

ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày

2.5.2 Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu

Các chỉ tiêu theo dõi

Σ Số mẫu tạo chồi

3 Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100

Σ Số mẫu cấy ban đầu

Σ Số mẫu thu được

4 Hệ số nhân (lần) =

Σ Số mẫu cấy ban đầu

Σ Chiều cao các chồi

5 Chiều cao TB chồi (cm) =

Σ Chồi theo dõi

Σ Số chồi thu được

Tỷ lệ sống của cây con = x 100

Tổng số cây trồng ban đầu Đặc điểm của cây con (màu sắc lá, hình thái lá và rễ)

13 Thời gian thu thập: cứ 1 tuần quan sát và ghi số liệu 1 lần

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào

mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro

Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và

sạch bệnh Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật

liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết

định thành công của toàn bộ quá trình Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống

Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh

dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa ) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả) Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn

và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp

3.1.1 Xác định chất khử trùng thích hợp

Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng Trong thí nghiệm này

hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian

khác nhau Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất Kết quả thu được sau 15 ngày thể hiện ở Bảng 3.1

ởng của chất khử trùng và thời gian khử

ch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày)

trùng Thời gian khử

trùng (s)

Tỷ lệ mẫu sống (%)

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

52,38 47,62 38,10 23,81 9,52 19,05 38,01 28,57 33,33

trùng đến hiệu quả theo dõi sau 15 ngày)

Tỷ lệ mẫu sống (%)

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế bào

thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, thời gian khử trùng

với cồn 70⁰ trong 10s (CT1) cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (47,62%) do thời gian

ngắn thành tế bào ít bị phá hủy là nhưng tỷ lệ nhiễm cũng cao (52,38%) do chưa

đủ để dung dịch khử trùng giết chết các nguồn bệnh Khi tăng thời gian khử trùng lên 20s (CT2) thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm giảm là 28,57% và 47,62% Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 30s (CT3) thì tỷ lệ sống tiếp tục giảm còn 14,29% và 38,1%

Với chất khử trùng là NaClO 2%

NaClO 2% là hóa chất có tính sát khuẩn cao nên khi tăng thời gian khử trùng

thì tỷ lệ nhiễm sẽ giảm nhưng nếu thời gian khử trùng lâu thì dung dịch có thể xâm nhập vào bên trong gây độc với mẫu Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng trong thời gian 5 phút (CT4) thì tỷ lệ nhiếm cao (23,81%) do thời gian chưa đủ để diệt các nguồn bệnh Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút (CT5) thì tỷ lệ nhiễm thấp nhất (9,52%), tỷ lệ sống cao (57,14%) Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên tới 15 phút(CT6) dung dịch đã gây độc cho mẫu nên tỷ lệ sống thấp hơn (33,33%), tỷ lệ nhiễm tăng lên Như vậy, thời gian khử trùng

bằng NaClO 2% tốt nhất là trong 10 phút, cho tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp Khử trùng bằng phương pháp kết hợp giữa cồn 70⁰ và NaClO 2%

Khi kết hợp cả hai chất khử trùng trên với thời gian khử trùng thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm của từng chất nên cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ

lệ nhiễm giảm Kết quả thí nghiệm cho thấy, phương pháp khử trùng là ngâm

cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (CT8) cho tỷ lệ sống

cao nhất đạt 90,48% và tỷ lệ nhiễm thấp (28,57%)

Như vậy, thời gian khử trùng mẫu có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của

mẫu cấy Công thức khử trùng CT8 (ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh

mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu