Hiện nay, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được xếp trong nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc gia và Khu Bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen. Ở Việt Nam do bị người dân thu hái tự phát để bán làm thuốc nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố. Do vậy, có thể nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn.
Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến này như:
Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro
thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính.
Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành. Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro
loài Lan kim tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.
N ă m 2 0 1 0 , Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim tuyến.”.
Các tác giả trên đã bước đầu tiến hành thăm dò ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và bước đầu tiến hành nhân giống thử nghiệm lan Kim tuyến nhưng chưa tác giả nào đưa ra quy trình hoàn chỉnh để nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến nghiên cứu nhân nhanh và quy trình ra cây hoàn chỉnh cho loài thảo dược quý hiếm này.
CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiêncứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)
Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên
Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ Vườn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc.
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
+ Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng công nghệ tế bào Thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
+ Thời gian: từ tháng 11/2011 - 12/2012
2.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy thích hợp, tìm ra các môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro.
2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến.
- Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan
Anoectochilus setaceus Blume.
- Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume).
2.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cho lan Anoectochilus setaceus Blume.
- Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao.
2.4. Nội dung nghiên cứu
2.4.1. Nghiên cứu xác định chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan vào mẫu thích hợp.
2.4.2. Nghiên cứu xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp.
+ Xác định môi trường nền thích hợp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thành và hệ số nhân.
2.4.3. Nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh. 2.4.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume).
2.5. Phương pháp nghiên cứu Điều kiện nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy
- pH của môi trường là: 5,4. - Nhiệt độ phòng nuôi: 25±20C - Cường độ ánh sáng: 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày đêm
2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
A. Xác định các phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch
Thí nghiệm 1. Xác định chất khử trùng thích hợp
Chồi và mắt đốt ngang thân cây lan Kim tuyến sau thu hái, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được thử nghiệm khử trùng bằng cồn 70o và H2O2 0,01% trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó được rửa sạch lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0.2% than hoạt tính + 0,8% dịch chiết chuối. Thí nghiệm được tiến hành với các công thức khử trùng:
CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s. CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s. CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s.
CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s). CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s). CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s).
CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút.
CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút.
CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút.
Thí nghiệm 2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch
khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1). Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm.
Thí nghiệm 3. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro
Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar.
Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu.
B. Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp
Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu.
Thí nghiệm 4. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A. setaceus)
Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*). Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là:
Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: Knud* + Nền môi trường
CT2: MS + Nền môi trường
CT3: Knudson C + Nền môi trường
Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các
công thức là: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: ĐC
CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin
Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: ĐC
CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA
CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA
Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường:
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA
C. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra rễ. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu.
Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ
CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar
Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ
CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar CT2: Nền + 1% than hoạt tính
CT3: Nền + 3% than hoạt tính CT4: Nền + 5% than hoạt tính
D. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chăm sóc tới khả năng sinh trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro ngoài vườn ươm.
Cây cao 3-4cm, mọc 3-4 lá và có 3-4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm.
* Cách bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi chậu trồng 3 cây.
- Định kì theo dõi: 7 ngày/1lần, chúng tôi đo chiều cao cây, đến rễ lá, số nhánh trong mỗi lần đo định kì.
- Số cây theo dõi
- Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm
Thí nghiệm 10. Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro
Giá thể:
CT 1: Giá thể 100% dớn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa CT 3: Giá thể 100% xơ dừa
CT 4: Giá thể 100% bột dừa
Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể
Thí nghiệm được bố trí với thời gian huấn luyện cây khác nhau:
CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày
Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen.
Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể
Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%. Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau:
ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày
2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu
Các chỉ tiêu theo dõi
Σ Số mẫu nhiễm
1. Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi
Σ Số mẫu sống
2. Tỷ lệ mẫu sống ( %) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi
Σ Số mẫu tạo chồi
3. Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100
Σ Số mẫu cấy ban đầu
Σ Số mẫu thu được 4. Hệ số nhân (lần) =
Σ Số mẫu cấy ban đầu Σ Chiều cao các chồi 5. Chiều cao TB chồi (cm) =
Σ Chồi theo dõi Σ Số chồi thu được
6. Số chồi (chồi/mẫu) = Σ Số mẫu ban đầu
Σ Số đốt 7. Số đốt (đốt/chồi) = Σ Số chồi Σ Số lá 8. Số lá (lá/chồi) = Σ Số chồi Σ Số mẫu tạo rễ 9. Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = x 100
Σ Số mẫu theo dõi Σ Số rễ
10. Số rễ (rễ/chồi) =
Σ Chiều dài rễ 11. Chiều dài TB rễ (cm) =
Σ Số rễ
Phương pháp xử lý số liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số liệu được xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL và IRRISTART 5.0 trên máy vi tính.
12. Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống của cây con, đặc điểm của cây con
Số cây sống
Tỷ lệ sống của cây con = x 100
Tổng số cây trồng ban đầu Đặc điểm của cây con (màu sắc lá, hình thái lá và rễ). 13. Thời gian thu thập: cứ 1 tuần quan sát và ghi số liệu 1 lần.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro
Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và sạch bệnh. Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết định thành công của toàn bộ quá trình. Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống.
Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa...) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả). Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp.
3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp
Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng... Trong thí nghiệm này hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh. Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử