A. Xác định các phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch
Thí nghiệm 1. Xác định chất khử trùng thích hợp
Chồi và mắt đốt ngang thân cây lan Kim tuyến sau thu hái, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được thử nghiệm khử trùng bằng cồn 70o và H2O2 0,01% trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó được rửa sạch lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0.2% than hoạt tính + 0,8% dịch chiết chuối. Thí nghiệm được tiến hành với các công thức khử trùng:
CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s. CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s. CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s.
CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s). CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s). CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s).
CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút.
CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút.
CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút.
Thí nghiệm 2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch
khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1). Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm.
Thí nghiệm 3. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro
Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar.
Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu.
B. Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp
Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu.
Thí nghiệm 4. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A. setaceus)
Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*). Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là:
Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: Knud* + Nền môi trường
CT2: MS + Nền môi trường
CT3: Knudson C + Nền môi trường
Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các
công thức là:
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: ĐC
CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin
Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: ĐC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA
CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA
Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường:
Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.
CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA
C. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra rễ. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu.
Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ
CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar
Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ
CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar CT2: Nền + 1% than hoạt tính
CT3: Nền + 3% than hoạt tính CT4: Nền + 5% than hoạt tính
D. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chăm sóc tới khả năng sinh trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro ngoài vườn ươm.
Cây cao 3-4cm, mọc 3-4 lá và có 3-4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm.
* Cách bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi chậu trồng 3 cây.
- Định kì theo dõi: 7 ngày/1lần, chúng tôi đo chiều cao cây, đến rễ lá, số nhánh trong mỗi lần đo định kì.
- Số cây theo dõi
- Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm
Thí nghiệm 10. Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro
Giá thể:
CT 1: Giá thể 100% dớn
CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa CT 3: Giá thể 100% xơ dừa
CT 4: Giá thể 100% bột dừa
Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể
Thí nghiệm được bố trí với thời gian huấn luyện cây khác nhau:
CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày
Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen.
Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%. Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau:
ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày