Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây hồng rừng (diospyros kaki thunb var silvestris makino) và đánh giá một số hoạt tính sinh học in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỒNG THỊNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY HỒNG RỪNG (DIOSPYROS KAKI THUNB VAR SILVESTRIS MAKINO) VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỒNG THỊNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY HỒNG RỪNG (DIOSPYROS KAKI THUNB VAR SILVESTRIS MAKINO) VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển HÀ NỘI 2022 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, người thầy trực tiếp hướng dẫn đề tài này, tận tình bảo hỗ trợ tơi suốt q trình thực nghiên cứu Thầy đam mê, tâm huyết nghiên cứu, tác phong làm việc thể chuyên nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới HVCH Sengkham Choumlivong, SV Nguyễn Hải Yến, SV Nguyễn Thị Minh Nguyệt, SV Trần Thị Tho, SV Phan Thị Hiền, SV Vũ Thị Ngân đồng hành suốt thời gian làm nghiên cứu Luận văn thạc sĩ Bộ môn Dược học cổ truyền Các bạn nhiệt tình, đam mê với khoa học, thể sức trẻ cống hiến cho khoa học, tích cực trao đổi kinh nghiệm quý giá trình nghiên cứu học tập giai đoạn dịch Covid -19 kéo dài, bạn nỗ lực khắc phục khó khăn tích cực học tập nghiên cứu khoa học trường Tôi xin chân thành cảm ơn tới ThS Lê Hương Giang công tác Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội, TS Lê Thanh Hương, công tác Trường Đại học Khoa học công nghệ Hà Nội bảo giúp đỡ nhiều mặt kiến thức chun mơn q trình thực đề tài Sự hỗ trợ góp phần khơng thể thiếu để tơi hồn thiện đề tài Tơi xin gửi lời biết ơn tới tồn thể thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội suốt khoảng thời gian học tập trường, xin kính chúc thầy cô mạnh khỏe công tác tốt Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2022 Học viên NGUYỄN HỒNG THỊNH MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Diospyros L 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Phân bố chi Diospyros L 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Dyospyros L 1.1.4 Thành phần hóa học chi Dyospyros L 1.2 Tác dụng sinh học chi Diospyros L 1.2.1 Tác dụng giảm đau, chống viêm 1.2.2 Tác dụng kháng khuẩn 1.2.3 Tác dụng hạ đường huyết 10 1.2.4 Tác dụng sinh học khác 11 1.2.5 Sử dụng y học cổ truyền 12 1.3 Tổng quan Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb var silvestris Makino) 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 17 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Thuốc thử, dung mơi hóa chất hiết bị nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 i 2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 19 2.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO tế bào đại thực bào RAW 264.7 cao phân đoạn hợp chất phân lập 22 2.2.3 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzym α -glucosidase enzym α - amylase của cao phân đoạn hợp chất phân lập 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Kết nghiên cứu thành phần hóa học 26 3.1.1 Định tính nhóm hợp chất phương pháp hóa học 26 3.1.2 Chiết xuất phân lập hợp chất 26 3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 29 3.2 Kết đánh giá tác dụng sinh học in vitro cao phân đoạn chất tinh khiết phân lập 37 3.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO từ tế bào RAW 264.7 37 3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzym -amylase 40 3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzym  - glucosidase 42 CHƯƠNG BÀN LUẬN .46 4.1 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất phân lập 46 4.2 Đánh giá tác dụng sinh học cao phân đoạn chất tinh khiết phân lập 50 4.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO từ tế bào RAW 264.7 50 4.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase enzym α-amylase51 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AA : Arachidonic acid BuOH : Butanol CAT CC : Catalase : Column Chromatography CS : Cell Survival DCM : Dicloromethan DEPT DMEM : Detortionless enhancement by polarization transfer : Dulbecco ‘s Modified Eagle Medium DMSO EPP ESI MS EtOAc EtOH : : : : : : Dimethyl Sulfoside Ethyl phenylpropiolate ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy Ethyl acetat Ethanol GSH HPLC iNOS MeOH NMR MS MIC MBC : : : : : : : : Glutathione High Performance LiquidChromatography Inducible nitric oxid synthase Methanol Nuclear magnetic resonance Mass Spectrometry Nồng độ ức chế tối thiểu Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu NO pNPG RP-18 SKLM SOD TLC var : : : : : : : Nitric oxyd P-nitrophenyl α-D-glucopyranosid Reversed Phase C-18 Sắc ký lớp mỏng Superoxid dismutase Thin Layer Chromatography Varietas iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thành phần hóa học số thuộc chi Diospyros L Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu phương pháp hóa học 26 Bảng 3.2 So sánh số liệu NMR hợp chất HR1 với tài liệu tham khảo 30 Bảng 3.3 So sánh số liệu NMR hợp chất HR2 với tài liệu tham khảo 32 Bảng 3.4 So sánh số liệu NMR hợp chất HR3 với tài liệu tham khảo 33 Bảng 3.5 So sánh số liệu NMR hợp chất HB3 với tài liệu tham khảo 36 Bảng 3.6 Sàng lọc khả ức chế sản sinh NO tế bào RAW 264.7 kích thích LPS mẫu Hồng rừng 38 Bảng 3.7 IC50 khả ức chế sản sinh NO HR.EA tế bào RAW 264.7 kích thích LPS 39 Bảng 3.8 Giá trị IC50 cao phân đoạn hợp chất phân lập 39 Bảng 3.9 Sàng lọc khả ức chế enzym a- amylase 41 Bảng 3.10 Sàng lọc khả ức chế enzym a - glucosidase 43 Bảng 3.11 IC50 khả ức chế -glucosidase 44 Bảng 3.12 Giá trị IC50 phân đoạn hợp chất phân lập 45 iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Hình thái thực vật số lồi thuộc chi Diospyros L Hình 1.2 Hình thái thực vật Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb var silvestris Makino) Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn 20 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ Hồng rừng 27 Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat, n- 29 butanol Hình 3.3 Cấu trúc hóa học HR1 31 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học HR2 33 Hình 3.5 Cấu trúc hóa học HR3 35 Hình 3.6 Cấu trúc hóa học HB3 37 v ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Diospyros L thuộc họ Thị (Ebenaceae) chi lớn họ, phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới, đa dạng khu vực Đơng Nam Á, có số loại thuộc Tây Á, Nhật Bản Đông Nam nước Mỹ [14] Ở Việt Nam thống kê 70 lồi [2], có số lồi thuộc chi Diospyros L nghiên cứu giới Cây Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb var silvestris Makino) thuộc chi Diospyros L sinh trưởng phát triển tự nhiên địa bàn Lào Cai Với lợi khí hậu, thổ nhưỡng, tri thức địa đồng bào dân tộc thiểu số thuốc, việc sử dụng rộng rãi dược liệu quý có giá trị kinh tế Tam thất, Đương quy, Đinh lăng, Atiso,… Hồng rừng sử dụng làm thuốc thời gian gần địa bàn tỉnh Lào Cai Thành phần hóa học Hồng rừng gồm có flavonoid, phenolic acid, tanin, carotenoid, triterpenoid [10], [11], chứa đa dạng chất dinh dưỡng protein, chất béo đặc biệt vitamin C [27] Về tác dụng sinh học bao gồm chống oxy hóa, hạ đường huyết, chống viêm, tác dụng tim mạch, cầm máu Để chứng minh trí thức dân gian sử dụng tác dụng chống viêm, hạ đường huyết dược liệu bổ sung sở liệu hóa học, hoạt tính sinh học in vitro nâng cao công dụng giá trị ứng dụng thực tiễn Hồng rừng, tiến hành đề tài “Chiết xuất, phân lập số hợp chất từ Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb var silvestris Makino) đánh giá số hoạt tính sinh học in vitro” với mục tiêu sau: Chiết xuất, phân lập nhận dạng - hợp chất từ Hồng rừng Đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzym α-glucosidase, enzym α-amylase in vitro ảnh hưởng đến giải phóng NO từ tế bào RAW 24.7 cao phân đoạn hợp chất phân lập từ Hồng rừng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Diospyros L 1.1.1 Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật Armen L Takhtajan (2009) chi Diospyros L có vị trí phân loại sau [45]: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Sổ (Dillenianae) Liên Đỗ quyên (Ericanae) Bộ Thị (Ebenales) Họ Thị (Ebenaceae) Chi Diospyros L 1.1.2 Phân bố chi Diospyros L Chi Diospyros L chi lớn họ Ebenaceae, có khoảng 500 lồi, phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới (Châu Á có tới 200 loài) số nơi thuộc khu vực ôn đới, đa dạng khu vực Đơng Nam Á, có số lồi Tây Á, Nhật Bản Đông Nam nước Mỹ [45] Trung Quốc có 60 lồi nhiều Đơng Nam Tây Nam Trung Quốc [42] Ở Việt Nam, chi Diospyros L có khoảng 70 lồi [1] có lồi cho gỗ có giá trị sử dụng, hai lồi có ăn Hồng (D kaki L.f.) Cậy (D lotus L.) [4] Trong tổng số 24 loài thuộc chi Diospyros từ vùng khác có loài phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới Châu Á D kaki Thunb., D Lotus L., D oleifera Cheng loài Châu Mỹ D virginiana L Hình thái thực vật lồi D kaki Thunb., D lotus L., D oleifera Cheng, D virginiana L có nhiều nét tương đồng lá, hoa, quả,… Một số loài thuộc chi quan trọng mặt thương mại, cho trái cây, Phổ 13 C NMR HR3 Phụ lục 7: Dữ liệu phổ NMR hợp chất HB3 phổ 1H NMR HB3 Phổ 13 C NMR HB3 Phụ lục 8: Dữ liệu phổ MS hợp chất HB3 Datafile Name:Lo HB3.194.lcd Sample Name:Lo HB3.194 mAU mAU 26.032/ 1.00 210nm,4nm /26.032 4500 4000 214 Phụ lục Dữ liệu HPLC hợp chất HB3 4000 3500 3500 3000 3000 2500 2500 1000 282 241 1500 1500 338 263 2000 2000 1000 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 /28.651 /29.440 /27.488 /24.510 /23.615 /20.939 /18.496 /18.891 /17.760 /15.687 /16.126 /15.072 /9.723 /5.524 /6.033 /6.261 /6.875 /11.393 500 500 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 nm Datafile Name:HR2 sach chay lai.lcd Sample Name:HR2 sach chay lai mAU mAU 500 800 210nm,4nm 10.386/ 1.00 239 Phụ lục 10 Dữ liệu HPLC hợp chất HR2 700 450 400 600 350 500 /10.386 300 250 400 200 300 150 200 100 2.5 5.0 7.5 12.5 15.0 17.5 22.5 388 391 /24.289 /22.907 /21.167 20.0 /22.057 /19.070 /14.724 /12.720 10.0 /17.466 0.0 /7.571 /5.610 /3.997 /2.384 /2.853 100 50 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 nm Datafile Name:HR3 sach chay lai.lcd Sample Name:HR3 sach chay lai mAU mAU 2.961/ 1.00 210nm,4nm 3500 3250 235 Phụ lục 11 Dữ liệu HPLC hợp chất HR3 1250 3000 1000 2500 2250 2000 212 2750 750 1750 1500 500 /2.961 1250 1000 750 /6.647 /5.185 /2.495 250 250 /3.840 500 -250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 nm Phụ lục 12 Ảnh TLC khảo sát hệ dung môi Bước sóng 365nm Bước sóng 254nm Ánh sáng thường Sắc ký lớp mỏng cao phân đoạn ethyl acetat Phụ lục 13 Ảnh TLC hợp chất phân lập ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỒNG THỊNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY HỒNG RỪNG (DIOSPYROS KAKI THUNB VAR SILVESTRIS MAKINO) VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT... Makino) đánh giá số hoạt tính sinh học in vitro? ?? với mục tiêu sau: Chiết xuất, phân lập nhận dạng - hợp chất từ Hồng rừng Đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzym α-glucosidase, enzym α-amylase in. .. liệu hóa học, hoạt tính sinh học in vitro nâng cao công dụng giá trị ứng dụng thực tiễn Hồng rừng, tiến hành đề tài ? ?Chiết xuất, phân lập số hợp chất từ Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb var silvestris