Chiết tách, phân lập một số hoạt chất từ cây bụt giấm hibiscus sabdariffa ứng dụng kiểm nghiệm trà bụt giấm hòa tan 4

59 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4 1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 4 1 1 Hợp chất HS6 (5 Hydroxymethyl 2 furaldehyde) Hợp chất HS6 thu được dưới dạng dầu màu vàng, tan tốt trong chloroform, hiện màu xanh đen với thuốc thử H2SO4EtOH Phổ khối lượng phun mù điện tử của hợp chất HS6 cho đỉnh ion phân tử là 163= M+H+2H2O + (positive), cho phép xác định cấu trúc phân tử là C6H6O3 Suy ra độ bất bão hòa = 4 Phổ 1H NMR cho tín hiệu proton của nhóm aldehyde (–CHO) tại δppm= 9,54 (1H; s); h.

CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 4.1.1 Hợp chất HS6 (5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde) Hợp chất HS6 thu dạng dầu màu vàng, tan tốt chloroform, màu xanh đen với thuốc thử H2SO4/EtOH Phổ khối lượng phun mù điện tử hợp chất HS6 cho đỉnh ion phân tử 163= [M+H+2H2O]+ (positive), cho phép xác định cấu trúc phân tử C6H6O3 Suy đợ bất bão hịa = Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton nhóm aldehyde (–CHO) δppm= 9,54 (1H; s); hai tín hiệu proton ghép cặp ortho với số ghép đặc trưng vòng furan δH = 7,49 (1H; d; 3,5 Hz) 6,60 (1H; d; J= 3,5 Hz) Phổ 13 C-NMR kết hợp phổ DEPT cho tín hiệu sáu carbon, bao gồm một carbon cacbonyl (C=O) δC = 177,9; hai carbon bậc ba (sp2) mang oxy δC = 162,1 151,7; hai carbon bậc ba (sp2) δC = 124,3 109,6; một carbon bậc hai (sp3) δC = 55,9 Phổ HSQC cho thấy tín hiệu proton δH = 5,58 (1H; t; 11,5 Hz) tương quan với carbon nào, suy tín hiệu proton nhóm –OH tḥc alcol bậc (-CH2OH) Dựa vào liệu cho phép dự đốn hợp chất HS6 gồm có vịng furan nhóm -CHO –CH2OH Phổ HMBC cho thấy proton nhóm aldehyde (-CHO) tương quan với carbon bậc ba vòng thơm (sp2) mang oxy δC = 151,7, C-2 Carbon bậc ba vòng thơm (sp2) mang oxy lại δC= 162,1 C-5 Hai proton H-6a, H-6b nhóm –CH2- cho tín hiệu δH = 4,51 (2H; d; 5,0 Hz) tương quan với carbon C-5 59 thể tương quan với carbon bậc ba (sp2) δC = 109,6 suy tín hiệu carbon C-4 Hình 4.1 Tương quan HMBC hợp chất HS6 Từ phổ HSQC cho thấy proton δH = 6,60 (1H; d; 3,5 Hz) tương quan với C-4 H-4 Proton H-4 ghép cặp ortho với tín hiệu proton δH = 7,48 (1H; d; 3,5 Hz), proton phải H-3 Suy C-3 carbon cho tín hiệu δC = 124,3 Dựa vào liệu số nghiệm hợp chất HS6 so sánh tài liệu tham khảo (trình bày bảng 4.1) cho phép xác định hợp chất HS6 5-Hydroxymethyl-2furaldehyde [15] Hình 4.2 Cấu trúc hóa học hợp chất HS6 60 Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR hợp chất HS6 tài liệu tham khảo 13 TT HS6 177,9 151,7 124,3 109,6 162,1 55,9 C-NMR [15] 177,9 151,7 124,3 109,6 162,1 57,9 H-NMR HMBC H13C HS6 9,54 (1H; s) [15] 9,54 (1H; s) C2 7,49 (1H; d; 3,5) 6,60 (1H; d; 3,5) 7,48 (1H; d; 3,5) 6,60 (1H; d; 3,5) C2,4,5 C2,3,5 4,50 (2H; d; 5,0) 4,50 (2H; d; 5,0) C4,5 Hình 4.3 Phổ 1H-NMR hợp chất HS6 61 Hình 4.4 Phổ 13C-NMR hợp chất HS6 Hình 4.5 Phổ HMBC hợp chất HS6 62 Hình 4.6 Phổ HSQC hợp chất HS6 4.1.2 Hợp chất HS2 (Quercitrin) Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) xuất tín hiệu proton vịng benzen [H 6,39 (1H; s; H-8); 6,22 (1H; s; H-6)] [H 6,94 (1H; d; Hz, H-5’); 7,33 (1H; d; Hz, H-6’), 7,36 (1H; s; H-2’), mợt nhóm methyl H 0,96 (3H; d; Hz); một proton anomer H 5,37 (1H; s) bốn tín hiệu oxymethyl Phổ 13 C-NMR (125 MHz, MeOD) cho thấy HS2 có 21 carbon gồm carbon đường rhamnose ([C 103,56 (C-1”), 71,92 (C-2''); 72,15 (C-3''); 73,28 (C-4''), 72,03 (C-5”), 17,65 (C-6”)], 15 carbon olefin, kết hợp với kỹ thuật DEPT phân loại thành carbon sp2 bậc ba mang oxy [C 165,92 (C-7); 163,23 (C-5); 159,32 (C-2); 158,55 (C-9); 149,81(C-4’); 146,43 (C-3’); 136,25 (C-3)]; carbon sp2 bậc ba [C 99,84 (C-6); 94,73 (C-8); 116,39 (C-2’); 122,86 (C-6’); 116,96 (C-5’)]; carbon sp2 bậc bốn [C 105,91 (C-10); 123,00 (C-1’)] carbon carbonyl C 179,67 Tín hiệu carbon anomer [C 103,56 (C-1’’)], tín hiệu methyl [C 17,65 (C-6’’)], bốn 63 tín hiệu CH nối với oxy lại phân tử đường gần [C 71,92 (C-2''); 72,15 (C-3''); 73,28 (C-4''), 72,03 (C-5”)] Phổ DEPT cho thấy cấu trúc HS2 có mợt nhóm CH3, 10 nhóm CH có 10 carbon bậc Dữ kiện phổ NMR khẳng định HS2 một flavonol mang đường rhamnose Phổ 1H NMR xuất tín hiệu mợt nhóm hydroxyl kiềm nối chứng tỏ nhóm hydroxy phải gắn vào C-5 Trên phổ HMBC, tương quan proton kiềm nối với carbon sp2 bậc ba C 99,84; carbon sp2 bậc ba mang oxy C 163,23; carbon sp2 bậc bốn C 105,91, ba carbon C-6; C-5 C-10 Kết hợp với HSQC, proton H-6 có đợ dịch chuyển hóa học H 6,22 (1H; s) Proton ghép meta với proton H-6 phải H-8 H 6,39 (1H; s) Phổ HMBC cho thấy proton H-6 H-8 tương quan với C-10 một carbon mang oxy C 165,92 hẳn phải C-7 Ngồi ra, proton H-8 cịn cho tương quan HMBC với carbon mang oxy C 156,4, điều khẳng định tín hiệu C 158,55 C-9 Trên phổ HMBC, ba proton H 6,94 (1H; d; Hz); H 7,33 (1H; d; Hz) H 7,36 (1H; s) tḥc mợt vịng benzene lần 1,2,4- Cả proton cho tương quan với carbon bậc bốn C 123,00 carbon mang oxy C 149,81 Do hai carbon C-1 C-4 Proton H 7,36 (1H; s) tương quan với C-2 xuất dạng mũi đơn H-2, proton H 7,33 (1H; d; Hz ) tương quan với C-2 ghép ortho với proton H 6,94 (1H; d; Hz) phải H-6, proton H 6,94 (1H; d; Hz) lại H-5 Từ phân tích dự đoạn HS2 quercitrin Số liệu phổ hợp chất so sánh với số liệu phổ quercitrin công bố tài liệu [16] cho kết quả phù hợp (bảng 4.2) 64 Bảng 4.2 Dữ liệu phổ NMR hợp chất HS2 tài liệu tham khảo 13 C-NMR HS2 [16] 159,32 158,1 136,25 134,1 179,63 180,2 163,15 160,8 99,84 98,5 165,82 94,73 164,4 93,4 10 1’ 2’ 158,55 105,91 123,00 116,39 157,2 104,5 120,1 115,8 3’ 4’ 5’ 146,43 149,81 116,96 144,9 148,1 115,3 6’ 122,86 120,9 TT HS2 6,22 (1H; d) 6,39 (1H; s) 7,36 (1H; s) 6,94 (1H; d; 8Hz) 7,33 (1H; d; 8Hz) H-NMR [16] 6,24 (1H; d; 2,3Hz) 6,24 (1H; d; 2,3Hz) 7,28 (1H; d; 2,4Hz) 6,86 (1H; d; 7,8Hz) 7,25 (1H; dd; 8Hz; 2,4Hz) Hình 4.7 Cơng thức hóa học hợp chất Quercitrin 65 Hình 4.8 Phổ 1H-NMR hợp chất HS2 Hình 4.9 Phổ 13C-NMR hợp chất HS2 66 Hình 4.10 Phổ DEPT hợp chất HS2 Hình 4.11 Phổ HMBC hợp chất HS2 67 Hình 4.12 Phổ HSQC hợp chất HS2 4.2 Khảo sát tiêu nguyên liệu - Kết quả khảo sát tiêu bản nguyên liệu trình bày bảng 4.3: Bảng 4.3 Kết quả khảo sát tiêu bản nguyên liệu Chỉ tiêu Kết Độ ẩm (%) 91,78 Hàm lượng chất khơ (%) 8,22 Hàm lượng tro tồn phần (%) 1,38 Xác định hàm lượng đạm (mg/g mẫu) 0,36 Xác định hàm lượng đường khử (mg/g mẫu) 2,87 Từ bảng kết quả 4.3, cho thấy nguyên liệu đài hoa bụp giấm có lượng ẩm cao (91,78%), hàm lượng chất khơ tương đối (8,22%) Hàm lượng tro tồn phần thấp (1,38%) chứng tỏ ngun liệu có hàm lượng khống Bên cạnh đó, nguyên liệu chứa đạm đường khử Kết quả thí nghiệm chứng tỏ, bụp giấm nguồn nguyên liệu giá trị, phù hợp để sản xuất sản phẩm có lợi cho sức khỏe trà hịa tan 68 V Na2S2O3 0,05 N (ml) 9,2 8,7 8,5 8,3 8,2 8,1 V Na2S2O3 0,05 N (ml) 0,5 0,7 0,9 1,1 Phương trình đường chuẩn glucose V Na2S2O3 (ml) 1.4 y = 0.5143x + 0.1857 R² = 0.9031 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 1.5 2.5 Nồng độ glucose chuẩn (mg/ml) Ống nghiệm Thông số NC Lần Lần Lần V dung dịch nghiên cứu (ml) 2 V Na2S2O3 0,05 N (ml) 8,9 0,2 0,3 0,2 V Na2S2O3 0,05 N (ml) V Na2S2O3 0,05 N trung bình (ml) 0,23 Hàm lượng đường khử (mg/g mẫu) 2,87 Kết xác định hàm lượng đạm phương pháp Lowry Ống nghiệm Thông số 107 Nồng đợ albumin (µg/ml) Giá trị OD 50 100 150 200 250 0,081 0,112 0,138 0,171 0,191 0,233 Phương trình đường chuẩn albumin 0.25 y = 0.0006x + 0.0808 R² = 0.994 Giá trị OD 0.2 0.15 0.1 0.05 0 50 100 150 200 Nồng độ protein (µg/ml) Lặp lại Thơng số Giá trị OD 250 300 Lần Lần Lần 0,184 0,187 Giá trị OD trung bình 0,189 Nồng đợ protein có mẫu thử (a, µg/ml) 179,78 Hàm lượng protein (M, mg protein/g mẫu) 0,195 0,36 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu : nước đến hiệu suất trích ly Lặp lại Lần Lần Lần 1:15 20,9 20,9 22,0 1:20 29,1 22,1 26,2 1:25 45,0 44,1 42,6 1:30 44,3 43,2 46,7 1:40 44,8 45,1 44,2 Nghiệm thức 108 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất trích ly Lặp lại Lần Lần Lần 30 oC 33,7 36,4 35,4 60 oC 39,4 33,9 33,6 70 oC 34,5 35,5 37,3 80 oC 43,0 44,4 41,5 85 oC 34,7 28,5 36,6 90 oC 28,3 25,9 33,0 Nghiệm thức 109 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trích ly Lặp lại Lần Lần Lần 10 phút 38,1 36,0 37,7 15 phút 41,8 41,5 38,1 20 phút 42,9 43,2 39,8 Nghiệm thức 110 25 phút 43,0 42,7 43,2 30 phút 44,3 43,8 43,4 35 phút 39,6 41,2 43,8 111 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ dịch chiết sau cô đặc đến chất lượng sản phẩm Bảng kết quả đánh giá cảm quan màu sắc thí nghiệm khảo sát nồng đợ dịch chiết sau cô đặc Nghiệm thức 3% 5% 10 % 15 % 4 4 5 5 4 4 10 11 4 12 5 13 4 14 5 15 4 Trung bình 2,87 4,4 4,27 1,87 Người thử 112 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ đường phối trộn đến chất lượng sản phẩm Bảng kết quả đánh giá cảm quan vị thí nghiệm khảo sát tỷ lệ đường phối trộn Nghiệm thức 35 % 40 % 50 % 60 % 1 2 5 3 4 3 5 4 10 3 Người thử 113 11 5 12 13 5 14 2 15 Trung bình 1,80 2,60 4,33 3,80 114 10 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ maltodextrin phối trộn đến chất lượng sản phẩm Bảng kết quả đánh giá cảm quan thí nghiệm khảo sát tỷ lệ maltodextrin phối trộn Nghiệm thức 15 % 20 % 25 % 30 % 2 4 2 3 4 2 2 4 10 2 11 12 13 2 14 4 15 Trung bình 1,60 2,27 4,60 3,40 Người thử 115 11 Kết đánh giá chất lượng sản phẩm tồn diện Bảng kết quả đợ ẩm, chất khơ sản phẩm hồn thiện Lặp lại Thông số Khối lượng cốc (mo, g) 62,01 53,57 Trung bình 52,3 Khối lượng mẫu (m1, g) Khối lượng mẫu + cốc sau sấy (m2, g) 63 Hàm lượng chất khơ tồn phần (X, %) 99 99 98 98,67 Độ ẩm (W, %) 1 1,33 116 1 54,56 53,28 Bảng kết quả tro toàn phần sản phẩm hoàn thiện Lặp lại Thông số Khối lượng chén nung (mo, g) Trung bình 67,63 50,41 64,57 Khối lượng chén nung + mẫu (m1, g) 68,63 51,41 65,57 Khối lượng chén nung + tro (m2, g) 67,71 50,5 64,65 Hàm lượng tro toàn phần (Y, %) 8,33 Bảng kết quả đợ hịa tan sản phẩm hồn thiện Lặp lại Thông số Khối lượng bột trà (g) 1 Khối lượng dịch trà ban đầu (g) 97,9 Khối lượng cốc (g) 45,33 44,39 46,57 Khối lượng mẫu đem sấy (g) 24,49 24,41 24,40 Khối lượng mẫu + cốc sau sấy (g) 45,58 44,65 46,82 Hàm lượng chất khơ có mẫu sấy (g) 0,25 0,26 0,25 1 0,99 100 100 99 Hàm lượng chất khơ có dịch trà ban đầu (g) Đợ hịa tan (%) Trung bình 98,22 96,93 99,67 12 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa bụp giấm Cao chiết cồn Nồng độ (mg/ml) Thông số ODm % Ức chế gốc tự 1/4 1/8 1/16 1/32 Lần 0,014 0,064 0,140 0,198 Lần 0,013 0,057 0,147 0,201 Lần 0,020 0,061 0,135 0,196 Lần 95,37 78,83 53,69 34,51 117 Lần 95,70 81,15 51,38 33,52 Lần 93,38 79,82 55,35 35,17 Trung bình (%) 94,82 79,93 53,47 34,40 Cao chiết nước Nồng độ (mg/ml) Thông số ODm % Ức chế gốc tự 1/4 1/8 1/16 1/32 Lần 0,017 0,071 0,132 0,181 Lần 0,021 0,081 0,151 0,184 Lần 0,022 0,070 0,178 0,207 Lần 94,38 76,52 56,34 40,13 Lần 93,05 73,21 50,06 39,14 Lần 92,72 76,85 41,12 31,53 Trung bình (%) 93,38 75,53 49,17 36,93 Chứng âm Lần Lần Lần Trung bình 0,312 0,303 0,292 0,3023 ODc Vitamin C Nồng độ (mg/ml) 1/4 1/8 1/16 Lần 0,034 0,08 0,187 0,205 Lần 0,032 0,098 0,190 0,217 Lần 0,033 0,114 0,181 0,230 Lần 88,75 73,54 38,14 32,19 Lần 89,41 67,58 37,15 28,22 Lần 89,08 62,29 40,13 23,93 Thông số ODm % Ức chế gốc tự 1/32 Trung bình (%) 88,08 67,80 38,47 28,11 13 Kết khảo sát khả ức chế α-glucosidase 118 Cao cồn Nồng độ (g/ml) 40 200 400 600 800 0,045 0,043 0,057 0,069 0,089 0,096 Lần 0,156 0,073 0,070 0,086 0,107 0,110 Lần 0,156 0,057 0,084 0,079 0,093 0,106 Lần 0,154 0,061 0,071 0,092 0,108 0,109 Trung bình 0,155 0,064 0,075 0,086 0,103 0,108 Asample 0,021 0,018 0,017 0,014 0,012 % Ức chế α-glucosidase 80,91 83,64 84,55 87,27 89,09 OD ban đầu OD sau phản ứng Acontrol 0,11 Cao nước Nồng độ (g/ml) 40 200 400 600 800 0,039 0,050 0,085 0,116 0,122 0,144 Lần 0,062 0,058 0,090 0,119 0,120 0,141 Lần 0,063 0,058 0,094 0,115 0,124 0,146 OD ban đầu OD sau phản ứng 119 Lần 0,056 0,054 0,090 0,119 0,123 0,143 0,060 0,057 0,091 0,118 0,122 0,143 0,007 0,006 0,002 0,000 0,001 66,67 71,43 90,48 100,00 95,24 40 200 400 600 800 0,048 0,04 0,048 0,051 0,054 0,057 Lần 0,085 0,074 0,081 0,078 0,075 0,067 Lần 0,08 0,073 0,08 0,074 0,075 0,066 Lần 0,088 0,073 0,08 0,079 0,074 0,068 0,084 0,073 0,080 0,077 0,075 0,067 0,033 0,032 0,026 0,021 0,010 8,33 11,11 27,78 41,67 72,22 Trung bình Acontrol 0,021 Asample % Ức chế αglucosidase Acarbose Nồng độ (g/ml) OD ban đầu OD sau phản ứng Trung bình Acontrol Asample % Ức chế αglucosidase 0,036 120 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC: Họ tên: Nguyễn Kim Khánh Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 29/09/1994 Nơi sinh: Bình Dương Email: nguyenkimkhanh2909@gmail.com Điện thoại: 0943619255 II Q TRÌNH ĐÀO TẠO: Năm 2012 – 2016: học Cử nhân Công nghệ sinh học – Trường Đại học Bình Dương Năm 2017 – 2019: học Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh III Q TRÌNH CƠNG TÁC CHUN MƠN: Thời gian Nơi công tác Công việc đảm nhiệm XÁC NHẬN CỦA Tp HCM, ngày tháng Năm 2019 CƠ QUAN / ĐỊA PHƯƠNG Người khai (Ký tên, đóng dấu) (Ký tên) 121 ... 26,2 1:25 45 ,0 44 ,1 42 ,6 1:30 44 ,3 43 ,2 46 ,7 1 :40 44 ,8 45 ,1 44 ,2 Nghiệm thức 108 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất trích ly Lặp lại Lần Lần Lần 30 oC 33,7 36 ,4 35 ,4 60 oC 39 ,4 33,9 33,6... (%) 46 43 .85 44 42 .97 42 .01 42 41 .53 40 .44 40 38 37.3 36 34 C1 (10) C2 (15) C3 (20) C4 (25) C5 (30) Thời gian (phút) Hình 4. 15 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trích ly 72 C6 (35) Bảng 4. 6... 24 Nhiệt độ: 0oC Áp suất: 85 ,4 Pa Sấy thăng hoa Nhiệt đợ: -38oC Nghiền, rây Bao gói Trà hịa tan Hình 4. 24 Quy trình sản xuất trà hịa tan từ đài hoa bụp giấm 86 Hình 4. 25 Sản phẩm trà hòa tan