2007)
Nguyên tắc
p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) được sử dụng làm chất nền và bị α- glucosidase thủy phân thành p-nitrophenol và α-D-glucose. Xác định hàm lượng p- nitrophenol sinh ra bằng cách đo độ hấp thu quang tại bước sóng 410 nm. Lượng glucose sinh ra tỉ lệ thuận với p-nitrophenol (pNP), vì vậy dựa trên đợ hấp thu của
p-nitrophenol ở bước sóng 410 nm để xác định lượng glucose sinh ra.
Khi mẫu thử nghiệm có sự ức chế α-glucosidase thì hàm lượng p-nitrophenol tạo thành sẽ giảm. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế là dịch chiết và mẫu khơng có ức chế để xác định % ức chế.
Xây dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50.
Hóa chất:
- -glucosidase: 0,3 UI/ml.
- DMSO: Dimethyl sulfoxide
- p-Nitrophenyl--D-glucopyranoside: 200 M.
- Cao chiết: 40, 200, 400, 600 và 800 g/ml.
- Chứng âm: gồm tất cả thành phần trừ cao chiết, thay bằng DMSO.
- Chứng dương (acarbose): 40, 200, 400, 600 và 800 g/ml. Cách tiến hành:
- Cao chiết pha trong DMSO thành 5 nồng độ: 40 g/ml, 200 g/ml, 400 g/ml, 600
g/ml, 800 g/ml. Sau đó ủ ở 30oC trong 5 phút dung dịch A.
- Dung dịch A (1 mL) được thêm vào 2 ml α-glucosidase 0,3 UI/ml.Hỗn hợp được đem đi lắc ở nhiệt đợ phịng trong 20 phút.
102
- Tiếp theo thêm vào 1 ml p-nitrophenyl--D-glucopyranoside 200 M. Tiếp tục được lắc ở nhiệt đợ phịng trong 20 phút.
- Sau cùng, thêm vào 3.0 ml NaOH 50 mM và đo đợ hấp thụ tại bước sóng 410 nm.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Khả năng ức chế α-glucosidase được tính như sau:
% Ức chế = x100 A A A control sam ple control Trong đó:
Acontrol: đợ hấp thụ của chứng âm Asample:độ hấp thụ của mẫu thử
Xây dựng đồ thị tương quan giữa % ức chế α-glucosidase và nồng độ chất ức chế để xác định IC50. So sánh IC50 của mẫu thử và chứng dương acarbose để đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase.