VIỆN ĐẠI HỌC MỎ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ĩ0ĨO» G8G8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ TÀI PHÂN LẬP VÀ TUYẾN CHỌN MỘT SÓ CHỦNG XẠ KHUẤN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CHẤT HŨ’U co VÀ úc CHÉ VIBRIO TÙ’ MÂU TRẦM TÍC.
VIỆN ĐẠI HỌC MỎ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ĩ0ĨO»:*G8G8 - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ TÀI PHÂN LẬP VÀ TUYẾN CHỌN MỘT SÓ CHỦNG XẠ KHUẤN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CHẤT HŨ’U co VÀ úc CHÉ VIBRIO TÙ’ MÂU TRẦM TÍCH BIÉN THU THẬP TẠI THANH HĨA - QUẢNG BÌNH - QUẢNG TRỊ Giáo viên hướng dẫn : TS LÊ THỊ HƠNG MINH Giáo viên hưóng dẫn : TS vũ THỊ QUYÊN Sinh viên thực : NGUYỀN THỊ THỦY NGÂN Lóp : 13-01 Hà Nội-2017 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẤT Chữ viết tắt Chú thích AND Axit deoxyribonucleotit Agar Agarose ARN Axit ribonucleotit BLAST Basic Local Alignment Search Tool CMC Carboxymethyl cellulose EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid G(-) Gram âm G(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh LB Lauria Bctani PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate vsv Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định XK Xạ khuẩn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : Hình ảnh cấu tạo phân lập xạ khuấn Hình 4.1: Một sổ hình ảnh noi lấy mẫu mẫu thu Hình 4.2 Một số hình ảnh phân lập xạ khuẩn Hình 4.3 Một số hình ánh làm chủng xạ khuấn Hình 4.4 Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng số chủng vi khuẩn Vibrio Hình 4.5 Khả thủy phân tinh bột tan Hình 4.6 Khả phân giải casein Hình 4.7 Khá phân giải cellulose Hình 4.8 Kết điện di đồ AND tổng số chủng xạ khuẩn (Giếng 1-3 mẫu G290, G280, G278) Hình 4.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Hình 4.10: Điện di đồ sản phấm PCR gen 16S ADN riboxom chủng G290, G280, G279 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 Danh sách tọa độ mẫu mẫu trầm tích thu thập đưọc Thanh Hóa - Quảng Bình - Quảng Trị Báng 4.2 Danh sách 15 chủng xạ khuấn phân lập Báng 4.3 Kết thử hoạt tính kháng số chủng vi khuấn Vibrio chủng xạ khuẩn MỞ ĐÀU Vùng biền Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km 3.260 km bờ biến (khơng tính đào), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nước ta tính đa dạng cảnh quan tự nhiên nguồn lợi thuỷ sinh vật Với mong muốn khám phá, khai thác sừ dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú cùa biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, công nghệ sản xuất sinh học chuyến dần từ khai thác sang tim hiều, ứng dụng đưa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ vùng nước ngập mặn, biển xa bờ, chí cã đáy biến sâu để sinh trưởng bền vững dựa sờ công nghệ Xạ khuấn (Actinomycetes) nhóm vi khuẩn nhân thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Xạ khuấn quan tâm nghiên cứu nhiều có khả sàn xuất sán phấm trao đối chất quan trọng Trong số 8000 chất kháng sinh biết giới có 80% có nguồn gốc từ xạ khuấn chủ yếu từ chi Streptomyces Micromonospora Giai đoạn năm 1980 trớ trước nhà nghiên cứu yếu tập trung vào khám phá chúng xạ khuẩn mặt đất Từ vài thập ký trờ lại nhà khoa học phát chùng xạ khuấn biến có nhiều đặc tính quý như: khả sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế tế bào ung thư có ý nghĩa ứng dụng y học ( Theo Tạp trí sinh học 2016, 38( 1): 109-114) Nuôi trồng thủy sản lĩnh vực phát triền nhanh năm gần ngày mở rộng Việc sử dụng nhiều thức ăn thuốc kháng sinh dẫn đến môi trường nuôi bị ô nhiễm, tạo chùng vi khuấn kháng thuốc cân hệ vi sinh vật đường ruột Đây thách thức lớn cho ngành thuỷ sân việc kiểm soát bệnh thủy động vật nâng cao suất, chất lượng cùa sàn phẩm Một nguồn nguy hiềm cho thuỷ sản nói chung cho ngành ni tơm nói riêng vi khuan Vibrio Vibrio có thề gây bệnh tất cà giai đoạn sinh trưởng cùa tôm xcm nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng, ti lệ chết lên tới 100% Việc phân lập tuyền chọn chúng xạ khuấn từ trầm tích biển có đối kháng vi khuẩn gây bệnh Vibrio tiền đề quan trọng đế để tạo sán phẩm sinh học tách chiết tinh chế chất có hoạt tính sinh học cao góp phần ngăn ngừa bệnh dịch cài thiện mơi trường Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: “Phân lập tuyên chọn số chủng xạ khuân có khả phân giải chất hữu ức chế Vibrio từ mẫu trầm tích hiến thu thập Thanh Hóa Qng Bình - Qng Trị” Mục tiêu: Sàng lọc chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích biến có hoạt tính phân giái chất hữu đổi kháng số loài Vibrio đế làm sớ cho xử lý môi trường nuôi trồng thủy sán Định danh bang sinh học phân tử chủng lựa chọn Nội dung nghiên cứu: - Phân lập chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích biến thu thập vùng biến Thanh hóa - Qng Bình - Quãng Trị - Sàng lọc vi sinh vật có hoạt tính phân giái chất hữu đối kháng số loài Vibrio - Định danh tên khoa học bời gene 16S-rRNA số chùng có hoạt tính cao lựa chọn PHẦN 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu nước giới 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới Săn lượng nuôi tôm giới bị suy giảm dịch bệnh, đặc biệt vi khuân Vibrio hay vi rút gây Kháng sinh sử dụng với khối lượng lớn nhằm kiểm soát dịch bệnh, nhiên, việc sứ dụng nhiều trường hợp thường không mang lại hiệu quà làm tăng thêm mầm bệnh, úng dụng cùa chế phàm sinh học ni trồng thủy sàn chìa khóa giãi vấn dề Theo dự báo Tồ chức Nông Lương Liên hợp quốc (FAO), ngành nuôi trồng thủy sản đáp ứng nửa nhu cầu sản phấm thúy sản đến nãm 2020 ngành khai thác bị khai thác mức, dẫn đến sản lượng khai thác suy giảm Nghề nuôi tôm mớ rộng toàn giới, đặc biệt nước nhiệt đới nhu cầu sàn phấm ngày tăng Tuy nhiên, nghề nuôi tôm bị ánh hưởng bời bệnh vi khuấn vibrio vi rút gây Mật độ thả nuôi ao hồ bế chứa cao nguyên nhân tạo mam bệnh việc sử dụng thức ăn giàu protein tạo môi trường thuận lợi cho vi khuân gây bệnh phát triển Vibrio nguyên nhân gây dịch bệnh tơm Đế kiếm sốt dịch bệnh vi khuẩn Vibrio gây ra, người ta sử dụng thuốc kháng sinh, nhiên, thời điếm này, hiệu việc sử dụng thuốc kháng sinh thấp Ớ Philipines, bệnh vi khuấn Vibrio gây tốn thất lớn sản lượng tôm gây thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm năm 1996 Vi khuân Vibrio kháng lại loại thuốc kháng sinh chloramphenicol, furazolidone, oxytetracycline, streptomycin nguy hiềm so với trước Tại Thái Lan, người nuôi sử dụng norfoxacin thức ăn, loại thuốc hiệu việc chong lại vi khuấn Vibrio Tuy nhiên, điều trị khơng mang lại hiệu sau ngừng thuốc tồn tơm bị chết hai ngày Rõ ràng, dòng vi khuẩn Vibrio kháng thuốc Chlorine sử dụng rộng rãi trại giống ao nuôi; nhiên, việc sứ dụng lại kích thích phát triền cúa gen kháng thuốc vi khuấn Một số người nuôi tôm Thái Lan cho biết chlorine sử dụng ao nuôi đế diệt động vật phù dutrước thả tôm, nhiên sau dừng thả chlorine thi khuẩn Vibrio lại phát triển nhanh chóng Như vậy, Vibrio khơng chi kháng thuốc mà nguyên nhân gây thêm mầm bệnh Việc sử dụng thuốc chống vi khuẩn làm tinh hình trở nên tồi tệ Ncu thuốc kháng sinh hay thuốc sát trùng sử dụng đế diệt trừ vi khuẩn; số vi khuẩn, mầm bệnh vần sống sót, bời chúng mang gen kháng thuốc [44] Biện pháp đồ cải thiện chất lượng nước nuôi trồng thúy sản áp dụng vi sinh vật/enzyme cho hồ nuôi, gọi “bioremedation” Bioremedation gồm sử dụng the song (vi khuân, nấm, actinomycetes, cyanobacteria cà thực vật) đổ làm giảm loại bị hồn tồn chất nhiễm độc hại Việc sử dụng vi khuấn có lợi (probiotics) để chỗ nguồn bệnh trình cạnh tranh sử dụng chăn nuôi cho thấy hiệu vượt trội so với dùng kháng sinh chấp nhận đế kiếm soát nguồn bệnh nuôi trồng thủy sàn Các nhà nghiên cứu chứng minh việc sừ dụng probiotics nuôi trồng thủy sán cãi thiện chất lượng nước cách làm cân bàng quần vi sinh vật nước giảm lượng vi sinh vật gây bệnh [35,37,38,39] Rất nhiều vi sinh vật có khả cạnh tranh, sản sinh chất ức chế kích thích sinh trường khác Vi sinh vật có hiệu quà đối kháng kích thích sinh trưởng ứng viên quan trọng probiotics nuôi trồng thủy sản Tiềm probiotic chùng vi khuấn khác nhau, loài, khác [40] Einar (2002) báo cáo Vibrio Pseudomonas loài vi khuân có triền vọng probiotics cho cá Bacillus cho hệ nuôi tôm [34,36] Năm 1998, Moriaty báo cáo sứ dụng probiotic Bacillus thương mại làm tăng chất lượng sống tôm nuôi hồ [41] Sử dụng probiotics Trung Quốc bat đầu từ nhập hàng từ Anh, Mỹ Nhật vào thập niên 1990’s Ở Thượng Hải có 100 nhà sán xuất sản phẩm vi sinh dung cho ni trồng thủy sàn ký thịa thuận vào năm 2006 an toàn thực phẩm sử dụng probiotics Các trại nuôi tôm Án Độ sử dụng thành cơng probiotics kế từ 1995 Hiện có nhiều chế phẩm sinh học dùng nuôi trồng thủy sàn, vài ví dụ bao gồm: Item Code đế làm hồ nuôi; Bioclean Aqua Fish loạt sản phẩm công thức vi khuấn cân cãi thiện chất lượngnước nuôi trồng thủy sản sức khởe cúa cá Ngồi cịn nhiều chế phấm khác Bioclean Aqua Fis.Pond Clarifier, Biogut Aqua probiotics cho tôm, Bacterialconsortium, probiotics để hoạt hóa enzymes; aquatic probiotic; probiotics đổ cải thiện hoạt tính đường ruột 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước Ở Việt Nam năm gần bệnh tôm cá xuất với tuần suất dày diễn biến phức tập hơn, bệnh tôm trở thành rào cản phát triến mở rộng nuôi tôm cà mặt số lượng, chất lượng, tính cân đối, tính liên tục ánh hướng tới thị trường xuất Theo báo báo kết quà nuôi thủy sàn năm 2003 ngành cho thấy nước có 546,757 ha, tỉnh từ Đà Nằng đến Kiên Giang có tới 29,000ha, chiếm 97,06% diện tích có tơm bị chết nước Nãm 2008 diện tích tơm sú tơm thẻ bị bệnh cùa nước 98,955ha tống thiệt hại 160 tý đồng Hậu q có nhiều vùng ni tơm thất bại liên tục bị bở hoang, gây nên tác động nghiêm trọng kinh tế - xã hội Trong số tác nhân gây bệnh cho tôm, ta thấy vi khuẩn Vibrio tác nhân phân bố rộng khắp, xuất môi trường nuôi nước mặn, nước lợ, gây bệnh phổ biến tôm [45] Ket nghiên cứu cùa Nguyễn Trọng Nho ctv (1996) đầm tơm tình Nam Trung Bộ [6] bị bệnh có số lượng vi khuẩn Vibrio tống số từ 110-1500 tế bào/ml Theo Phan Lương Tâm ctv (1998), Nguyễn Việt Thắng (1998) kháo sát ngun nhân gây chết tơm tinh phía Nam cho đầm nuôi tôm bị chết, số lượng vi khuẩn Vibrio spp tổng số cao Một số đề tài nghiên cứu cúa Ngô Thị Tường Châu (Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội) cs: “Tối un hóa nguồn Hình 4.8 Kct điện di đồ AND tổng số chủng xạ khuẩn (Giếng 1-3 mẫu G290, G280, G278) 4.6.2 Nhân gen I6S ADN ríboxom Từ ADN genom chủng nghiên cứu, sứ dụng cặp mồi 16SFJ6SR, tiến hành PCR nhân đoạn gen 16S với chu trinh nhiệt sau: 94°c - phút, 94°c - 30 giây, 56°c - 45 giây, 72°c - phút,(32 chu kỳ từ bước đến bước 4), 72°c - phút, kết thúc 4°c Hình 4.9 Chu trình nhiệt phăn ứng PCR Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thú cùa gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khn ADN gcnom theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 1500 bp Ket quà điện di đồ sản phẩm PCR (hình 4.10) cho thấy sản phàm PCR chủng chì xuất băng có kích thước khoảng 1000bp-2000bp Như chu trình phàn ứng PCR thiết lập hồn tồn phù hợp với mục đích nhân dòng đoạn gen 16S chủng nghiên cứu 2000bn 15Q0bp lOOObp Hình 4.10: Diện di đồ sản phẩm PCR gen 16S ADN riboxom chủng G290, G280, G279 Giếng 2,3,4: sán phẩm PCR cùa chủng xạ khuấn G290, G280, G278 Giếng : thang ADN chuẩn Đe chắn khuyếch đại đoạn gen 16S ARN riboxom chúng xạ khuẩn có hoạt tính cao, chúng tơi tiến hành tinh lượng lớn sản phấm PCR đố tiến hành đọc trình tự nuclcotit 4.6.3 Kết giải trình tự gene 16S ba chủng xạ khuẩn Trình tự gen xác định theo phương pháp cùa Sanger&đtg Sau xừ lý liệu thu qua chương trình GENE DOC, chúng tơi đà nhận trình tự hồn chinh gen 16S ARN riboxom cùa chủng • Trinh tự cùa đoạn gen 16S ARN riboxom cúa chúng G278 có độ dài 1447 bp Tỳ lệ: A( 18% 266); T(24% 320); G(25% 376); C(33% 485) TGGGGGAACC TTCGGGTGTT TCACCGCAGC AGẦCCCCAAT CTCATTGTAC GACGTCGTCC CGAAGAGTTG CTCACGACAC CATCTCTGAT TTAAGCCACA GCGGCCGTAC TGTTGCCCAC TCGCTCCCCA CGGTGTTCCT CCGAACTCTA CCGACGCGAC CCTẦCGTATT CACTTTCGCT GGCGTCGCTG GAGTCTGGGC CGTCGCCTTG CCGCCGGAGC GTTTCCAGGG CACTAATCCC ATCCCGA CGTAGGGCAG ACCGACTTTC AATGCTGATC CCGAACTGAG CGGCCATTGT CCACCTTCCT CTGGCAACAC GAGCTGACGA GCTTTCCGGT TGCTCCGCCG TCCCCAGGCG ACCTAGTGCC CGCTTTCGCT CCTGATATCT GCCTGCCCGT AAGCCGCCTA ACCGCGGCTG TCTTCCCTGC CATCAGGCTT CGTGTCTCAG GTGAGCCATT TTTCGACCCG CTTGTCCCAG CACCCGAAGG ATCCGTCTGC GTGACGTGAC TGCGATTACT ACCGGCTTTT AGCACGTGTG CCGAGTTGAC GGGACAAGGG CAGCCATGCA GTATGTCAAG CTTGTGCGGG GGGCACTTAA CACCGTTTAC CCTCAGCGTC GCGCATTTCA ATCGACTGCA CGAGCTCTTT CTGGCACGTA TGAAAGAGGT TCGCCCATTG TCCCAGTGTG ACCTCACCAA CCAAGATGCC AGTGCAGGGC TGGTTCATCG ATCCCTCCCA GGGCGGTGTG AGCGACTCCG TGAGATTCGC CAGCCCAAGA CCCGGCGGTC TTGCGCTCGT CCACCTGTAC CCTTGGTAAG CCCCCGTCAA TGCGTTAGCT GGCGTGGACT AGTATCGGCC CCGCTACACC GACCCGGGGT ACGCCCAATA GTTAGCCGGC TTACAACCCG TGCAATATTC GCCGGTCGCC CAAGCTGATA TTGGCAGGTC AGATTGCCCA TCGACTATCA CAGGGGGTTG TACAAGGCCC ACTTCATGGG TCCACCTTGC CATAAGGGGC TCCCGTGAGT TGCGGGACTT ACCGACCACA GTTCTTCGCG TTCCTTTGAG GCGGCACGGA ACCAGGGTAT CAGAGATCCG AGGAATTCCG TAAGCCCCGG ATTCCGGACA GCTTCTTCTG AAGGCCGTCA CCCACTGCTG CTCTCAGGCC GGCCGCGGGC AGTATCCGGT CGTGTTACTC CGAGCGGAGC GGCCACCGGC GGGAACGTAT GTCGAGTTGC GGTATCGCAG ATGATGACTT CCCCAACCTC AACCCAACAT AGGGGGGCAC TTGCGTCGAA TTTTAGCCTT CAACGTGGAA CTAATCCTGT CCTTCGCCAC ATCTCCCCTA GCTTTCACAA ACGCTTGCGC CAGGTACCGT TCCCTCACGC CCTCCCGTAG GGCTACCCGT TCATCCTGCA ATTAGACCCC ACCCGTTCGC AGGAACCCAC Sử dụng chương trình BLAST đế so sánh trinh tự đoạn gcn cùa chủng G278 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuấn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Kết quà cho thấy đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) so với gen 16S ARN riboxom cúa chúng Streptomyces sp AOI 107 mã số KU38271 1, phân lập từ mầu trầm tích biến Trung Quốc • Trinh tự cùa đoạn gen 16S ARN riboxom cùa chủng G280 có độ dài 1448 bp Tỷ lệ: A( 18% 271); T(24% 332); G(25% 366); C(33% 479) TGCAATAGGT GGCTTCGGGT TATTCACCGC TGCAGACCCC CAGCTCATTG CTTGACGTCG ACCCCGAAGG AACATCTCAC GGCACCATCT TCGAATTAAG GCCTTGCGGC TGGAATGTTG CCTGTTCGCT GCCACCGGTG CCCTACCGAA CACAACCGAC TGCGCCCTAC ACCGTCACTT CACGCGGCGT CGTAGGAGTC CCCGTCGTCG CTTCẦCCGCC ACCCCGTTTC TTCGCCACTA CAATCCAA TCAGTTGTCT GTTACCGACT AGCAATGCTG AATCCGAACT TACCGGCCAT TCCCCACCTT GCTTGCTGGC GACACGAGCT CTGATGCTTT CCACATGCTC CGTACTCCCC CCCACACCTA CCCCACGCTT TTCCTCCTGA CTCTAGCCTG GTGACAAGCC GTATTACCGC TCGCTTCTTC CGCTGCATCA TGGGCCGTGT CCTTGGTGAG GGAGCTTTCG CAGGGCTTGT ATCCCCACCC AACATATCAT TTCGTGACGT ATCTGCGATT GAGACCGGCT TGTAGCACGT CCTCCGAGTT AACACGGGAC GACGACAGCC CCGGTGTATG CGCCGCTTGT AGGCGGGGCA GTGCCCACCG TCGCTCCTCA TATCTGCGCA CCCGTATCGA GCCTACGAGC GGCTGCTGGC CCTGCTGAAA GGCTTTCGCC CTCAGTCCCA CCATTACCTC ACCCGCCAAG CCCAGAGTGA GAAGGTGGTT GTGCTACCTC GACGGGCGGT ACTAGCGACT TTTTGAGATT GTGCAGCCCA GACCCCGGCG AAGGGTTGCG ATGCACCACC TCAAGCCTTG GCGGGCCCCC CTTAATGCGT TTTACGGCGT GCGTCAGTAT TTTCACCGCT CTGCAGACCC TCTTTACGCC ACGTAGTTAG GAGGTTTACA CATTGTGCAA GTGTGGCCGG ACCAACAAGC ATGCCTTGGC AGGGCAGATT CATCGTTCGA CCACAAGGGG GTGTACAAGG CCGACTTCAT CGCTCCACCT AGACATAAGG GTCTCCCGTG CTCGTTGCGG TGTACACCGA GTAAGGTTCT GTCAATTCCT TAGCTGCGGC GGACTACCAG CGGCCCAGAG ACACCAGGAA GGGGTTAAGC CAATAATTCC CCGGCGCTTC ACCCGAAGGC TATTCCCCAC TCGCCCTCTC TGATAGGCCG AGGTCAGTAT GCCCACGTGT CTGCATTGTA TTGGGCCACC CCCGGGAACG GGGGTCGAGT TGCGGTATCG GGCATGATGA AGTCCCCAAC GACTTAACCC CCACAAGGGG TCGCGTTGCG TTGAGTTTTA ACGGACAACG GGTATCTAAT ATCCGCCTTC TTCCGATCTC CCCGGGCTTT GGACAACGCT TTCTGCAGGT CGTCATCCCT TGCTGCCTCC AGGCCGGCTA CGGGCTCATC CCGGTATTAG TACTCACCCG AGCATCACGC Kết quà so sánh trinh tự đoạn gen cũa chủng G280 với trình tự gen 16S ARN riboxom cúa xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gcn quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) so với gen 16S ARN riboxom cùa chủng Streptomyces sp GS13 mã so JX465725 phân lập từ mầu bùn từ nước thài Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc cơng bố • Trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng G290 có độ dài 1441 bp TGGGAGAAGG TCGGGTGTTA CACCGCAGCA GACCCCAATC TCATTGTACC ACGTCGTCCC CGAAGGGCTT TCTCACGACA CCATCTCTGA ATTAAGCCAC TGCGGCCGTA ATGTTGCCCA TTCGCTCCCC CCGGTGTTCC ACCGAACTCT ACCGACGTGA CCCTACGTAT TCACTTTCGC CGGCGTCGCT GGAGTCTGGG TCGTCGCCTT ACCGCCGGAG TAAGCACCCG ACAAGTCGGC CCGACTTTCG ATGCTGATCT CGAACTGAGA GGCCATTGTA CACCTTCCTC GCTGGCAACA CGAGCTGACG TGCTTTCCGG ATGCTCCGCC CTCCCCAGGC CACCTAGTGC ACGCTTTCGC TCCTGATATC AGCCTGCCCG CAAGCCGCCT TACCGCGGCT TTCTTCCCTG GCATCAGGCT CCGTGTCTCA GGTGAGCCAT CTTTCGACCC GCCAGAAGCC ATCCATGTGC TGACGTGACG GCGATTACTA CCGGCTTTTT GCACGTGTGC CGAGTTGACC CGGGACAAGG ACAGCCATGC TGTATGTCAA GCTTGTGCGG GGGGCACTTA CCACCGTTTẦ TCCTCAGCGT TGCGCATTTC TATCGACTGC ACGAGCTCTT GCTGGCACGT CTGAAAGAGG TTCGCCCATT GTCCCAGTGT TACCTCACCA GCCAAGATGC A TACTCCCACA GGCGGTGTGT GCGACTCCGA GAGATTCGCT AGCCCAAGAC CCGGCGGTCT GTTGCGCTCG ACCACCTGTA GCCTTGGTAA GCCCCCGTCA ATGCGTTAGC CGGCGTGGAC CAGTATCGGC ACCGCTACAC AGACCCGGGG TACGCCCAAT AGTTAGCCGG TTTACAACCC GTGCAATATT GGCCGGTCGC ACAAGCTGAT CTTGGCAGGT GGGGGAATGG ACAAGGCCCG CTTCATGGGG CCACCTTGCG ATAAGGGGCA CCCGTGAGTC TTGCGGGACT CACCGACCAC GGTTCTTCGC ATTCCTTTGA TGCGGCACGG TACCAGGGTA CCAGAGATCC CAGGAATTCC TTAAGCCCCG AATTCCGGAC CGCTTCTTCT GAAGGCCGTC CCCCACTGCT CCTCTCAGGC AGGCCGCGGG CAGTATCCGG GCCACCGGCT GGAACGTATT TCGAGTTGCA GTATCGCAGC TGATGACTTG CCCAACACCC TAACCCAACA AAGGGGGGCA GTTGCGTCGA GTTTTAGCCT ACAACGTGGA TCTAATCCTG GCCTTCGCCA GATCTCCCCT GGCTTTCẦCA AACGCTTGCG GCAGGTACCG ATCCCTCACG GCCTCCCGTA CGGCTACCCG CTCATCCTTC TATTAGATTG Tý lệ: A(18% 251); T(23% 298); G(26% 349); C(33% 443) Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng G290 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuấn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thay, đoạn gcn có độ tương đồng cao (99%) so với gen 16S ARN riboxom cúa chúng Streptomyces coelicoflavus KS-3, mà số KT895421 Đại học Công nghệ Hunan Trung Quốc.công bố Từ kết so sánh trình tự gene 16S ARN riboxom cùa chùng phân lập Chúng tơi kết luận chúng nghiên cứu G278, G280, G290 thuộc chi Streptomyces spp Streptomyces chi lớn cùa ngành Actinobacteria chi thuộc nhánh Streptomycetaceae Streptomyces chứng minh sàn xuất hợp chat ức chế chất chuyển hóa có liền quan đến suy giâm việc hình thành màng sinh học, hoạt động cảm biến chống lại tác nhân gây bệnh (You ct al., 2007) hoạt động chống độc lực vi khuấn Vibrio sp (Iwatsuki et al., 2008) Bên cạnh hiệu ứng ức chế vi khuẩn gây bệnh ni trồng thủy sản, Streptomyces ghi nhậncó hoạt động chống virus, đặc biệt virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV; Jenifer et al, 2015) Bên cạnh tăng trưởng tốt cùa tôm, tất cà thức ăn bố sung Streptomyces cho thấy cãi thiện hiệu suất tăng trưởng cá cảnh Xiphophorus helleri (cá đuôi kiếm đỏ) sau 50 ngày thử nghiệm cho ăn so với chế độ ăn đối chứng khơng có Streptomyces sp (Dharmaraj Dhevendaran, 2010) Hon nữa, nghiên cứu tưong tự cho thấy việc sản xuất hormone tăng trưởng, axit kích thích tố cúa Streptomyces sp khiến tốc độ tăng trường tốt hơn, the qua việc cho cá Xiphophorus helleri ăn thức ăn bố sung Streptomyces (Dharmaraj Dhevendaran, 2010) Tại trang trại Viveros Negros, nơi bị thiệt hại nặng nề vi khuấn Vibrio gây Các loại thuốc kháng sinh sử dụng thức ăn, nhiên hiệu q mang lại khơng cao Sự có mặt cùa vi khuẩn Vibrio ao nuôi vùng thường mức 103-104/ml vịng 2-3 tuần ao nuôi sinh sản Tuy nhiên, chế phẩm sinh học sứ dụng khơng thay xuất bệnh tỷ lệ sống rat cao (80-100%) có diện vi khuấn Vibrio nước Như vậy, việc sừ dụng chế phẩm sinh học dựa nguyên tắc cạnh tranh loại trừ phương pháp thay hữu hiệu việc phòng điều trị bệnh tôm, đồng thời hướng tới ngành nuôi tôm bền vững, thân thiện với môi trường mang đến sán phấm chất lượng, an toàn cho người tiêu dùng [44] PHÀN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận • Từ mẫu trầm tích biển thu Thanh Hóa - Quảng Bình - Quáng Trị, đà tuyển chọn 15 chủng xạ khuẩn thừ hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định • Đã chọn chủng xạ khuấn có khả kháng tốt số vi sinh vật kiếm định Chủng G280 có đường kính kháng vi khuẩn K alginolyticus 13mm, kháng vi khuân V cholera lOmm, kháng vi khuân V parahaemolyticus 13mm; chùng G290 có đường kính kháng vi khuấn V alginolyticus 13mm, kháng vi khuẩn V vulnificus 15mm, kháng vi khuẩn V parahaemolyticus 14mm; chúng G278 có đường kính kháng vi khuấn V cholera 13mm, kháng vi khuẩn V parahaemolyticus 16mm • Cà chủng có sinh enzyme với độ mạnh yếu khác nhau, nhiên chủng G278 có sinh amylase cao với vịng phân giải 15mm, chúng G278 có khâ sinh protease cao với vòng phân giải 25mm chúng có sinh cellulase cao G278 với vịng phân giái 23mm • Từ số đặc điểm hình thái so sánh trình tự gene 16S ARN riboxom cùa chủng phân lập Chúng tơi kết luận chúng nghiên cứu G290, G280, G278 thuộc chi Streptomyces spp 5.2 Kiến nghị • Cần có nghiên cứu thêm đặc điêm lý sinh hóa sinh đê có thê khang định chùng nghiên cứu G278, G280, G290 thuộc lồi Streptomyces • Tối ưu hóa điều kiện q trình lên men lựa chọn giá thể để sản xuất thứ nghiệm chế phẩm sinh học đối kháng chúng Vibrio, sp ba chủng: G278, G280, G290 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, NXBKHKT Hà Nội, 1972 [2]Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cữu nâng cao hoạt tinh khảng sinh chùng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 hang kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học Hà Nội, 2000 [3]Chcn M., Xiao X., Wang F, Arthrohacter ardleyensis sp nov isolatedfrom Antarctic lake swdiment and deep-sea sedimen, Arch Microbiol, 183, pp 301-305, 2008 Norcardiopis alkalipila phân lập từ đất sa mạc Ai Cập có thê sống pH 9,5-10 [4] ] Nguyễn Lân Dũng, Nguyền Đinh Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội [5] Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuân thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chong nấm gây bệnh đạo ôn thối rễ phân lập Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học, viện CNSH, Trung tâm KHTN CN Quốc Gia, Hà Nội [6] Nguyễn Trọng Nho , Tạ Khác Cường , Lục Minh Diệp , Nguyễn Thị Xuyến (1997), Nghiên cứu cãi tiến quy trình ni tơm sú thịt Khánh Hịa đạt hiệu q kinh tế cao suất ốn định, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Nha Trang [7] Nguyễn Tác An (1998), Báo cáo đề tài “Điều tra trạng môi trường ven biền thành phố Nha Trang đề xuất giải pháp cài thiện phát triến môi trường”, Nha Trang [8], Lại Thúy Hi ền (1998), “Một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa cũa số chúng vi khuấn khừ sulphat phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ”, Tạp chí sinh học, 8, tr 37-38 [9] Võ Thị Thứ , La Thị Nga, Trương Ba Hùng , Nguyền Minh Dương , Nguyền Liêu Ba (2003), Nghiên cứu tạo chế phẩm Biochie đánh giá tác dụng chếphấm đến môi trường nước nuôi tôm cá , Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 12/2003 [10] Vũ Trung Tạng (2001), Cơ sở sinh thái học, Nhà xuất bán giáo dục, Hà Nội [11] Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước giàu hợp chất nitơ photpho, Nhà xuất bán Khoa học tự nhên Công nghệ, Hà Nội [12] Nguyễn Hữu Thọ (2001), “Biến động cùa sulfite, ammonia, nitrite, BOD, COD, chlo hữu môi trường nước ánh hướng đến khả xãy bệnh đốm trắng, bệnh đàu vàng tơm ni Khánh Hịa”, Tạp trí thủy sản, 43, Bộ Thủy sàn-Trung tâm nghiên cứu thúy sán III, tr 5-15 [13] Võ Thị Thứ , La Thị Nga, Trương Ba Hùng , Nguyễn Minh Dương , Nguyễn Liêu Ba (2003), Nghiên cứu tạo chế phẩm Biochie đánh giá tác dụng chế phẩm đen môi trường nước nuôi tôm cá , Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 12/2003 [14] Nguyền Tác An (1996), Phương pháp quản lý chất lượng nước phục vụ nuôi trồng thủy hải sản, Giáo trình cao học, Dạ i học thủy sàn Nha T rang [15] Văn Phú (2003), “Bio - niềm tin trọn vẹn người nuôi tôm ”, Tạp chí thúy sản, (12/2002, 1/2003) [16] 16] Đồ Thu Hà, Nghiên cún xạ khuân sinh chất kháng sinh trống nấm phân lập đất Quáng Nam - Đà Nang, Luận án Tiến sĩ sinh học, Hà Nội, 2004 [17] 17] Trịnh Ngọc Hồng, Nghiên cứu tính đối kháng cùa xạ khuân với số vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện, Luận án Thạc sĩ Sinh học 2009 [18] BSTY Nguyễn Xuân Hòa - PGS TS Phạm Hồng Sơn Trường Đại Học Nông Lâm Huế- Khoa Chăn Nuôi -Thú Y-BỘ môn Ký sinh - Truyền nhiễm Tài liệu Tiếng Anh [19] Nor Ainy Mahyudin (2008), “Actinomycetes and Fungi associated with marine Invertebrates: A potential source of bioactive compounds”, Doctor of Philosophy in Microbiology at the University of Canterbury, New Zealand [20] Paul R Jensen, Dwight R., and Fenical w (1991), “Distribution of Actinomycetes in Near-Shore Tropical Marine Sediments”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 57, No 4, 1102-1108 [21] Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Yang Y, Li H, Xu c, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinomacells in vitro, Tranpsl,2007 [22] Past! M B., Pometto A p., Nuti M p., Crawford D L., Ligninsolubilizing abbility of actinomyces isolated from termite (Termitidae) gutt, Appl Environ Microbiol, pp.2213-2218, 1990 [23] Steger K, PhD Thesis: Compostion of microbial communities in compost A too! to assess process development and quality of thr final product Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 2006 [24] Scong c N„ Kimm Y s., Lee s D„ Hah Y c„ Kirn s B„ Goodfellow M, Mycolic acid-containning actinomycetes associated with actived sludge foam, J Microbiol, 37, pp.66-72, 1999 [25] Chen M., Xiao X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake swdiment and deep-sea sedimen, Arch Microbiol, 183, pp 301305, 2008 Norcardiopis alkalipila phân lập từ đất sa mạc Ai Cập sống pH 9,5-10 [26] Hozzein W.N., Li WJ., All M.I.A, Hammouda o., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C.L., Nocardiopsis alkliphila sp now., a novel alkaliphilic actinomyces isolated from desert soil in Egypt, Int J Syst Evol Microbial, 54, pp.247-252, 2004 [27], Boyd c E and Tucker c s (1998), Pond aquaculture water quality Management, Kluwer Academic Publishers, London, pp 5.)))))) [28], Artemia Internation LLC (2002), “Sprirulina superfood for ornamental fish”, Technical Information Shrimp Larval and Enrichment Feeds, Dec [29], Wang-Xiang-Hong, LiJun, JiWei-Shang, Xu-Huai-Shu (2002), Application of Probiotics in Aquaculture, Ocean University of Chindo, China, May 20, pp 145-147 [30], Hebe M Dionisi, Alice c Layton, Gerda Harms, [grid R Gregory, Kevin G Robinson and Gray s Sayler (2002), “Quantification of Nitrosomonas oligotropha - like Ammonia Oxidizing Bacteria & Nitrospira spp from Full-Scale Wastewater Treatment Plants by Microbiology, pp 245-253 Competitive PRC”, Application and Evironmental [31] Kakani (2003), “Probiotics: their role in aquaculture, Energee - American Standard Products”, Inc, Jan 10 [32] Austin B & Zhang X-H (2006) "Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates" Letters in Applied Microbiology 43 (2):119214.(10) [33] R Gupta, O.K Beg, p Lorenz, Bacteria! alkaline protease: molecular approaches and industrial application, Appl Microbiol Biotrechol 59 (1), p 15, 2002 [34], Einar R, 2002 Good vs Bad bacteria The talk on fish health In: SEAFDEC Asian aquaculture, Xxiv (2): 3-20 [35], Ige BA, 2013 Probiotics use in intensive fish farming Africal J Microbiol Res., 7(22):2701-2711 [36] Kolndadacha OD, Adikwu IA, Okaeme AN, Atiribom RY, Mohammed A, and Musa YM, 2011 The role of probiotics in Aquaculture in Nigeria - a review Continental J Fisheries and Aquatic Science, (1): - 15 [37] Kolndadacha OD, Adikwu IA, Okaeme AN, Atiribom RY, Mohammed A, and Musa YM, 2011 The role of probiotics in Aquaculture in Nigeria - a review Continental J Fisheries and Aquatic Science, (1): - 15 [38] Merrifield DL, Dimitroglou A, Focy A, Davies SJ, Baker RMT, Bogwald J, Castex M, Ringo E, 2010b The current status and future focus of probiotic and prebiotic applications for salmonids Aquaculture, 302:1-18 [39] Rico A, Phu T, Satapomvanit K, Min J, Shahabuddin A M, Henriksson p J G, Muray FJ, Little DC, Dalsgaard A, Van den Brink p, 2013 Use of veterinary medicines, feed additives and probiotics in four major internationally traded aquaculture species farmed in Asia Aquaculture, 412-413 [40] Soccol CR, de Souza Vandenberghe LP, Spier MR, Medeiros ABP, Yamaguishi CT, Lindner JDD, Pandey A and Thomas-Soccol V, 2010 The potential of probiotics: a review Food Technol Biotechnol., 48(4):4l3-434 [41] Moriaty DJW, 1998 Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds Aquaculture, 164:351-358 Các trang web tham khảo [42] http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm [43]http://www.vnua.edu.vn:85/tc khktnn/Upload%5C2102014tc%20so%205%204.pdf [44] https://www.chungvisinh.com/che-phain-sinh-hoc-trong-nuoi-trong-thuy-sangiup-kiem-soat-dich-benh.html/ [45]http://tcxt, 123doc.org/documcnt/2440965-nghicn-cuu-muc-do-nhicm-vi-khuanvibrio-spp-gay-benh-tren-tom-su-penaeus-monodon-fabricius-1798-nuoi-thamcanh-trong-he-thong-nuoi-da-cap-tai-hai-phong.htm [46] http://icbr.ac.vn/databasc/HNTQ5/982.pdf [47Ịhttps://voer.edu.vn/c/kha-nang-cua-vi-sinh-vat-phan-huy-mot-so-nhomchat/f65b4fl9/3e9bcf9e ... tài: ? ?Phân lập tuyên chọn số chủng xạ khuân có khả phân giải chất hữu ức chế Vibrio từ mẫu trầm tích hiến thu thập Thanh Hóa Qng Bình - Qng Trị? ?? Mục tiêu: Sàng lọc chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích. .. tọa độ mẫu mẫu trầm tích thu thập đưọc Thanh Hóa - Quảng Bình - Quảng Trị Báng 4.2 Danh sách 15 chủng xạ khuấn phân lập Báng 4.3 Kết thử hoạt tính kháng số chủng vi khuấn Vibrio chủng xạ khuẩn. .. Quảng Trị Hình 4.1: Một số hình ảnh noi lấy mẫu mẫu thu 4.2 Phân lập xạ khuẩn từ trầm tích Từ mẫu trầm tích đà thu nhập, tiến hành xử lý mầu, cấy chãi lên mơi trường phân lập có bố sung kháng sinh