Nghiên cứu tạo đột biến UV tăng hiệu suất sinh tổng hợp axit clavulanic từ chủng xạ khuẩn streptomyces clavuligerus

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -ỉcxat * Sũxst KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ Tt „ _u tạ T. ti- u\ B —T it sinh tong họp axit clavulanictừ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus." Giáo viên hướng dẫn: TS.Tạ Thị Thu Thúy Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hồng Hoa Lớp: 13-02 Hà Nội-2017 MỤC LỤC MỞ ĐÀU Phần I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 1.1.2 Khái niệm kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 CÚC kháng sinh nhóm p - lactam 10 1.2 Đại cương xạ khuẩn 14 1.2.1 Đặc diêm chung xạ khuân 14 1.2.2 cẩu tạo xạ khuẩn 14 1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ưong xạ khuẩn 16 1.2.4 Các yếu tố ảnh hướng đến khả sinh kháng sinh xạ khuẩn 17 1.2.5 Đặc điểm Streptomyces cỉavuligerus 18 1.2.6 Giới thiệu axit clavulanic .20 t 22 1.3.1 Khái niệm đột biến 22 1.3.2 Mục đích 22 1.3.3 Đột biến nhân tạo bàng tác nhân vật lý .23 1.3.4 Đột biến nhân tạo bàng tác nhân hóa học 23 1.3.5 ĐỘI biến nhân tạo phương pháp sốc nhiệt 24 1.3.6 Một số thành tựu ứng dụng dột biến gen tăng khả sinh kháng sinh vi sinh vật 24 1.4 Mục tiêu nội dung nghiên cứu cũa đe tài „ .24 1.4.1 Mục tiêu nghiên cứu 24 L4.2.NỘÌ dung nghiên cửu 24 Phần - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu .25 2.1 Vật liệu nghiên cứu .25 2.1.1 Các chủng vi sinh vật 25 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 25 Báng 2.3.Môi trưởng LB 28 2.2.Sơ đồ quy trình nghiên cứu 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy chùng vi sinh vật 29 2.3.2 Phương pháp bảo quản giong 31 2.3.3 Phương pháp xác định khối lượng tế bào .31 2.3.4 Phượng pháp gây đột biến xạ khuẩn tia uv 31 2.4 Tách chiết thu kháng sinh „ 35 Phần 3-KẾTQUÁ 37 3.1 Xác định hoạt lính axil chủng S.clavuligerus ' 37 3.2 S0 sánh khả đột biển từ bào tử khuẩn ly 38 3.4 Kết quà nghiên cứu ảnh hưởng thời gian gây đột biến uv đến khả sinh trưởng sinh axit 39 3.5 Kết sàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuẩn đột biên 4(1 3.7 Ânh hường môi trường dinh dường đến khả nâng sinh trưởng sinh tổng hợp axil chùng đột biển .41 3.7.1 Ảnh hưởng hàm lượng cacbonhydrat đến khả sinh trưởng sinh axit 41 3/7 Ánh hưửnư cửa ngưôn pspton tới khả nãnợ sinh trường sinh kháng sinh 42 3.7.3 Ánh hưởng hùm lượng đa lượng 44 3.8 Ảnh hưởng cùa điều kiện nuôi cẩy 45 3.8.1 Ánh hưởng thời gian nuôi cấy 45 3.8.2 Ảnh hưởng pH 45 3.8.3 Ánh hưởng nhiệt độ 46 3.9 Quy trình tách thu nhận axit quy mơ thí nghiệm .47 4.L Kết luận 48 4.2.Để xuất 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẤT D Đường kính (rung bình vịng vơ khuẩn tính theo milimel Gram (-) Gram dương Gram (+) Gram âm h Giờ HSCC Hệ sợi chất HSKS Hể sợi khí sinh LB Luria Bertanỉ TLC Thin Layer Chromatography v/p Vòng/phút Amo Amoxicillin STT Nội dung Tran g 10 Bảng Cơ che tác dụng cíia kháng sinh Bàng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bàng 3.1 Môi trường NDYE 26 Mơi trường giàu khống 27 Mơi trường LB 27 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng Ạ Bảng thử nong độ kháng sinh Amp Amox với B.cereus 37 Bảng thử nồng độ kháng sinh Amp Amox với E.coli 37 Bảng kết kểt hơp axit clavưlanic kháng sinh 38 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Kết so sánh đột biến lừ khuẩn ly bào tử 38 Ti lệ sống sót chủng xạ khuẩn qua thời gian chiếu tia uv 39 Kèt sàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuân đột biến 40 Kết quà vể khả ức chể vi sinh vật chủng xạ khuẫn S.ciavuỉigerus Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat đến khả nãng sinh trường sinh tồng họp axil chùng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biển Bảng 3.9 Ành hưởng nguồn pepton đến khả sinh trưởng 43 sinh tơng hợp axìt chủng xạ khn S.cỉavuỉigerus đột biển Bảng Ánh hưởng hàm lượng đa lượngđến khả sinh trưởng 3.10 sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavưligerus đột biến 44 SIT Nội dung Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.3 Hình 1.3 Hình 1.6 Hình 1.7 Hĩnh 1.8 Hình 3.1 Hình ; Nấm mốc Penicillium chrysogenum bào tử chúng Hình 3.3 Kiêm tra tính kháng khuân chủng clavuligerusđột biến Hình 3.4 Ánh hưởng nguồn cacbonhydrat đền khà sinh tổng Hình 3.5 Ánh hường nguồn pepton đến khả sinh tổng hợp Hình 3.6 chủng khuân độtđến biênkhả sinh tông Ánh hườngxạcủa hàmS.cỉavuỉigerus lượng đa lượng Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian ni cay den khả sinh Hình 3.8 Biểu đồ ảnh hường cùa pH nuôi cấy đến khà sinh tổng Hình 3.9 Biểu đồ ảnh hưởng cùa nhiệt độ nuôi cấy đến sinh Tran g Công thức câu tạo kháng sinh penicillin 11 Công thức cấu tạo kháng sinh Ampicillin 12 Công thức cấu tạo kháng sinh Amoxicillin 12 Công thức cấu tạo kháng sinh cephalosporin 12 Khuân lạc,khuân ty bào từ xạ khuân 16 Hình ânh chủng xạ khuân S.cỉavuỉigerus khuân ty 20 Cấu tạo axit clavulanic 21 Hình thừ hoạt tính khuẩn ty bào lữ 39 40 41 tự nhiên 42 hợp axit chủng xạ khuấn S.clavuligerus đột biến 43 axit 44 hợp axil cùa chung xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến 45 tống họp axit chùng S.clavuligerus 46 hợp axit chủng S.cỉavuiigerus tổng họp axit cúa chúng S.clavuĩigerus 46 MỠ ĐÀU Công nghệ sinh học môn tập hợp ngành khoa học công nghệ bao gồm: sinh học phân từ, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học, cơng nghệ học, nham tạo quy trình cơng nghệ khai thác quy mơ cơng nghiệp hoạt động song cúa vi sính vật, tế bào động, thực vật đe sản xuất sàn phâm có gíấ trị phục vụ đời song, phát triển kinh te - xã hội báo vệ môi trường Kháng sinh lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học.Kháng sinh chế phẩm sinh học sản xuất nhàm tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh thiện tình trạng bệnh lý người, động vật, thực vật Tình trạng kháng kháng sinh lại mối lo ngại nay.Theo To chức Y tế Thế giới (WHO) dự tính đến năm 2050 giây có người tử vong siêu vi khuẩn kháng thuốc, tương đương với khàng 10 triệu người mồi năm Khi đó, bệnh thơng thường ho hay vết cát có the gây tử vong Hiện để ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh người phải tìm chr : £ ‘ hoạt lự _ I* k' ' g sinh lăng _, „ _ ngày trở thành hiểm họa lồi người Trong chùng xạ khuẩn Streptơmyces cỉavuỉigenus có khà sinh axit clavuỉanic giúp ta ngăn chặn phần khả kháng thuốc số chủng vi sinh vật có khả sinh enzym p — lactamase Clavulanic acid chất bán tơng hợp có khả nãng ức chề hoạt động nhóm |3 — lactamase enzym vi sinh vật tiết đế làm giâm hoạt lực kháng sinh cùa nhóm — lactam.Nó sản phẩm chuyển hóa thứ cấp chủng xạ khuẩn Streptomỵces clavuligerus Tuy nhiên, khã sinh axit chúng xạ khuần tự nhiên chưa cao, cần có biện pháp cải thiện suất nhằm thu hằm lượng sinh axit cao Vì nhóm nghiên cứu thực đề tài: “Nghiên cứu tạo đột biến uv tăng suât sinh tổng hợp clavulaníc acid từ xạ khuân Streptomyces cỉavuỉigerus” Phần 1: TÔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sình 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh - Trên Thế giới Sự phát triển vỉ sinh vật học nói chung vi sinh vật cơng nghiệp nói riêng, với bước ngoặt lịch sứ phát minh đại chất kháng sinh Alexander Fleming vào năm 1928, nhà khoa học người Anh tình cờ phát chủng nấm Penicillium notatum nhiềm sinh vào môi trường nuôi cấy Straphyỉococus aureus ức che phát triến vi khuân Ồng chứng minh loại nâm tiết chất có khả ức chề phát triển Starphỵlococus aureus, chất sau gọi Penicillin [22] [26] Hình 1.1 Nấm mốc Peniciỉlium chrysogenum bào tử chúng Vìbộ phận sinh sàn lồi nấm mốc có hình dạng giống bút lơng nên đặt tên Penicilìium(liếng la linh Penicillium nghĩa bút lông) Nấm 1938, Fleming nhận thư hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford Ernst Boris Chain Howard Walter Florey, vởi lời đề nghị hợp tác với ông đê tiếp tục thực cơng trình nghiên cứu ve Penicillin họ thứ nghiệm thành công Penicillin chuột vào năm 1940 Năm 1944,nhóm chọn loại nam sinhPeniciỉlin ưu việt chúng Peniciỉlium chrysogenum, chế tạo loại Penicillin có hoạt tính cao triệu lần Penicillin Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928 Nãm 1945,Flemỉng giải thường Nobel y học Ernst Boris Chain Howard Walter Florey Cùng với việc phát Penìcilin.thập ki 40,50 kĩ XX ghi nhân bước tiên vượt bậc việc khám phá hàng loạt chất kháng sinh có giá trị y học như:Sulfonamid (Gerhard Domard, 1932), Streptomycin (Selman Waksman Albert Schat,1944), Cloramphenicol(Erhlich,1947), Chlotctraxyclin (Dugar,1948), Tốc độ tìm kiểm chất kháng sinh ngày đẳy mạnh.Nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học vể y học, dược phâm nông nghiệp nhiều nước the giới van liên tục phát hàng loạt chất kháng sinh có giá trị ứng dụng thực tiền.Năm 1945 phát 30 chất kháng sinh, năm 1949 số 150 chất kháng sinh, năm 1953 xấp xi 450 chất kháng sinh, năm 1980 có 5.500 chất đến số lượng chẩt kháng sinh phát lên tởí 17.000 chẩt khoảng 30.000 chat kháng sinh bán tông hợp.Tuy nhiên, số chi có l-ỉ-2% chất kháng sinh có đủ tiêu chuẩn để sử dụng y học từ xạ khuân Streptomyces CDRLL - 312, cótác dụng ngăn chặncholesterol, tăng sức đề kháng chât độc chuột, ngồi kháng sinh cịn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Tại Nhật Bân, năm 2003, Yatakemycin tách chiết tử xạ khuẳn Streptomyces sp TP - A0356 bang phương pháp sắc ký cột Chất kháng sinh có khả kìm hãm phát triển nẩm Aspergillus Candida albicans Chất cịn có khã nãng chơng lại tê bào ung thư, có giá trị MIC 0,01-T 0,3 mg/ml Tại Hàn Quổc, năm 2007, phân lập loài xạ khuẩn Síreptomyces sp C684 sinh chất kháng sinh Laidlomycin, chat tiêu diệt nhũng tụ cầu kháng Methicillin cầu khuẩn kháng Vancomycin Năm 2002, Ẩn Độ phân lập chủng Streptomyces sp 201 có khả sinh chat kháng sinh - methylheptyl isonicotinate, chất kháng sính có kháng nhiều loại nấm gây bệnh Furasium ơxysporum, F Sơỉina, - Tại Việt Nam Ó Việt Nam người nghiên cứu chất kháng sinh giáo sư Đặng Vãn Ngữ Ơng lấy dịch ni cấy nấm Penìcilíium chrysogenum xạ khuẩn Streptomycesgrieus điêu trị vết thương cho thương binh chiên dịch Đông Xuân 1951-1952, kháng chiến chống Pháp Năm 1968, môn công nghiệp Dược (trường Đại học Dược Hà Nội) thành lập đào tạo cán chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho cồng nghiệp kháng sinh Năm 1970, đơn vị nàybắt đầu nghiên cứu chuyên đề kháng sinh GS Trương Công Quyển phụ trách.Tại đâyđã phân lập dược hàng nghìn chủng xạ khuân từ mâu đât khác nhau.Đáng ý tuyên chọn chùng có chống vi khuẩn Gram (-), có hiệu tốt đổi với vi khuân gây bệnh mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) Kháng sinh lấy tên Dekamycin sau xác định Neomycin Từ năm 1974,tạí Viện Khoa học Việt Nam (nay Viện Khoa học Cơng Nghệ Việt Nam) có nhóm nghiên cứu chất kháng sinh.Nhiều chủng ví sinh vậ mg bào vệ thực vật.Một số chể phấm kháng sinh hhư: Tetravit, Biovit, Baxitraxin sản xuât đưa vào sử dụng chân ni Sau Việt Nam nhiều đối tác nước ngồi Liến Xơ (cũ), Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác giúp sản xuất điều chế kháng sinh song không thành công nhiều nguyên nhân Từ năm 1985 - 1990, chương trình nghiên cứu cẩp Nhà nước vểsản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin Tetracyclin kết đạt không cao vể công nghệ lần hiệu suất Từ năm 2000 đen nay, nước ta có so nhóm đà tham gia nghiên cửu kháng sinh thu số kết như: nghiên cứu tồi ưu điều kiện lên men môi trường sản xuất kháng sinh Vancomycin từ chủng Síreptomyces orientates (2004); nghiên cứu quy trình cơng nghệ lên men sàn xuat Vancomycin (2006); nghiên cứu quy trình tách chiết, linh chế Doxorubicin (DXR)từ xạ khuẩn làm nguyên liệu điều che thuốc điều tri ung thư hệ bạch huyết đồng hóa số nguồn cacbonhydrat khác với tỳ lệ thấp sinh acid thấp Như vậy, nhóm nghiên cứu chọn glyxerol nguồn cacbonhydrat để pha chế môi trường nuôi cấy cho chùng • Ánh hường hàm lượng Glyxerol Sau lựa chọn hàm lượng glyxerol khác để khảo sát ảnh hưởng hàm lượng glyxerol môi trường nuôi đền khả sinh tống hợpaxit , cụ thể là: 0,1%; 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0% Kểt xác định phương pháp đo đường kính vịng vơ khn sau ngày nuôi cấy với vi sinh vật kiểm địnhlà Hình 3.4 :Anh hưởng hàm lượng glycerol đến sinh tổng hợp axit chủng S.cktvuligerus đột biển Qua kêt biếu đổ cho thấy chủng xạ khuân S.clavuỉigerus tự nhiên nuôi môi trưởng giàu khống có hàm lượng glycerol 1.5% tạo hàm lưựng axit nhiều cịn mơi trường giàu khống có hàm lượng glycerol khác hàm lượng axit tạo Như vậy, hàm lượng cacbonhydrat cao hay thấp ânh hưởng lớn đến khả sinh axit cùa chủng xạ khuẩn s.cỉavuỉigerusđột biến: hàm lượng cacbonhydrat q thấp khơng đủ dinh dirởng cho phát triển hàm lượng cacbonhydrat cao lại ức chế tổng hợp axit chủng 3.7.2 Ánh hường nguồn peptontởi khả nãng sinh trưởng sinh kháng sinh Tại hàm lượng glyxerol l,5%tối ưu chủng xạ khuấntiếp tục ni cấy mơi trưởng giàu khống nguồn pcpton với hầm lượng 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0% ;2,5% Khà sinh kháng sinh xác định sau ngày ni lẳc 28°c băng phương pháp đo đường kính vịng vơ khn với vi sinh vật kiêm định B.cereusvằ kháng sình Amox Bâng 3.9.Ánh hường cùa nguồn pepton đến khả sinh trường sinh tổng hợp axit chững 5.c/ứVM/ígỂHtóđột biến Hàm lượng nitơ tống Trọng lượng ướt Đường kính vịng vơ khn (g/1) ữ(mm) 0,5% 23,5 17 1,0% 25,96 19,3 1,5% 24,5 18,7 2,0% 23,84 17,5 7,3 0.50% 1% 1.50% 2% 2,50% Hàm lượng pepton Hình 3.5:Anh hường hàm lượng pcpton đến sinh tổng hợp axit cùa chủng S.clavuligerus đột biến Theo kểt bảng ta thây: hàm lượng peptonthích hợp cho khả sinh axit cùa chủng 1,0% đường kính vịng vơ khuẩn trung bình đạt lớn nhất, hàm lượng khác kính vịng vơ khuẩn thu nhỏ Như vậy, nồng độ nitơcao hay thấp ânh hưởng tới sinh axitcủa chủng 3.7.3 Ảnh hưởng hàm lượng đa lượng Với hàm lượng glyxerol bâng 1,5% nitơ bang 1%, chủng xạ khuân dược nuôi cấy môi trưởng giàu khống có hàm lượng đa lượng khác nhau0,2%,0,25%; 0,3%; 0,35%; 0,4%, Sau ngày nuôi cấy chủng, la liến hành kiểm tra hoạt tính axit với vi sinh vật kiểm định B Cereusvà kháng sinh Amox, thu kết bàng 3.3 Bàng 3.9 Anh hướng cùa hàm lượng đa lượngđên khả sinh trưởng sinh axit cùa chủng S.cỉavuỊigerusđột biến Hàm lượng khoáng Trọng lượng ướt Đường kính vịng vơ khuẩn (g/l) Ỡ (mm) 0,2.% 25,64 18 0,25% 26,1 19,5 18.5 J /c/ 0,4% 17.7 24,67 Hàm lượng đa lượng 17 Hình 3.6:Anh hường cùa hàm lượng đa lượngđển khả sình tơng hợp axit chủng S.cỉavuligerus đột biến Theo kết bâng ta Ihấy: hàm lượng đa lượng thích hợp cho khả sinh kháng sinh chủng 0,25% đường kính vịng vơ khn trung bình đạt lớn nhất, tạí hàm lượng khác kính vịng vơ khuẩn thu nhó Như vậy, nồng độ đa lượng cao hay thấp ảnh hướng tới nàng sinh kháng sinh chúng 3.8 Ánh hiring điều kiện nuôi cấy 3.8.1 Anh hưởng thời gian nuôi cấy Với hàm lượng glycerol 1,5% peplon l%,ngng đa lượng 0,25%, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn thời gian để khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit là48h, 72h, 96h, !20h,142h Đối với môc thời gian nghiên cứu, ta tiến hành kiêm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiêm định làS.cereuí kháng sinh Amox, thu kết sau Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hướng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tống hợp axit chủng S.clavuỉigerusđột biến Qua kểt biêu đổ cho thây chủng xạ khuân S.clavuligerus tự nhiên phát triển tốt khoảng thời gian 72h - 96h, khoảng thời gian lượng sản phẩm tạo nhiều xạ khuẩn lăng trưởng với sổ lượng lớn lượng sán phẩm trao đoi chất tạo nhiều Trước khoảng thời gian lượng axit tạo chưa nhiều xạ khuẩn thích ứng chậm với mơi trường ni cấy Sau khoáng thời gian 96h nuối cấy xạ khuắn phát triền chậm lại môi trường dinh dường cạn kiệt the lượng axit tạo giảm dần 3.8.2 Ánh hưởng pH Với hàm lượng glyxerol 1,5% peptonl%, nguồn đa lượng 0,25% nuôi cấy khoảng thời gian 72-Ỉ-96 Nhóm nghiên cứu lựa chọn pH đế khảo sát ảnh hướng pH môi trường nuôi cấy đến sinh tống hợp kháng sinh 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5.Sau ta tiến hành kiếm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiểm định B.cereus, thu kểt nhưhình 3.7 Hình 3.8.Biêu đồ ảnh hưởng cùa pH ni cấy đến khả nãng sinh tông hợp axit chủng S.clavuligerus 3.8.3 Anh hưởng nhiệt độ Với hàm lượng glycerol 1,0% nitơ 0,25%, yểu tố đa lượng nuôi cấy khoảng thời gian 724-96 giờ, pH 7, nhóm nghiên cửu tiếp tục lựa chọn mốc nhiệt độ khác đe kháo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit cùa chủng xạ khuẩn S.cỉavuỉigerus tự nhiên lằ 24°C; 26 °C; 28 °C; 30 U C; 32 °C Sau tiến hành kiêm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiêm định làB.reretư kháng sinh Amox, thu kết hình Hình 3.9.Biểu đồ ành hưởng nhiệt độ ni cấy đến khà sính tổng họp axit chúng S.clavuligerus tự nhiên Qua kêt biêu đô cho thây chùng xạ khuân S.cỉavuỊigerus tự nhiên ni mơi trưởng giàu khống tạo nhiều sản phẩm nhiệt 28°c, lượng acid tạo nuôi chủng môi trường giàu khống nhiệt độ khác hơn, đặc biệt nhiệt độ 24°c lượng axit dược tạo rât Điêu cho thây nhiệt độ ni cay có ành hưởng lớn đển khà nãng sinh axit chùng xạ khuân S.clavuligerus 3.9 Quy trình tách thu nhận axit quy mơ thí nghiệm Quy trình tách chiết axitquy mơ phịng thí nghiệm: Bước 1: Thu dịch ni mơi trường giàu khống Bước 2: Ly tâm nhiệt độ phòng 10 phút với tốc độ 6000 v/p, 4oC để loại bỏ sinh khối tế bào Bước 3: Thu dịch nuôi roi bồ sung dung môi n-butanol tỷ lệ 2:3 chuân pH=2 Bước 4: Lắc hỗn hợp 28oC Bước 5: Ly tâm hỗn hợp nhiệt độ 4oC,10 phút với toe độ 6000 v/p đế tạo phân lớp phần djch có chứa axit dung mơi Bước Ế CLA hịa tan Bước 7: Quay khơ chân khơng đê thu CLA ên bao gom dung mổi PHÀN VI:KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 4.1 Kết luận Sau [hời gian nghiên cứu nhóm thực mục liêu đề thu kết quà sau: Tối S.cỉavuỉigerusđột ưu thành biến phần sinh môi trường trường sinh dinh dưỡng tổng hợp thích axit họp cao để chúng nhất: nguồn cacbonhydrat glycerol với hàm lượng 1,5% , nguồn pepton với hàm lượng 1%, yêu tó đa lượng 0,25g/l Chúng phát triên mạnh khoảng thời gian 72-96 nuôi cấy môi trường có pH=7» nhiệt độ 28°c Chọn chủng S.cỉơvuỉigerus đột biến chiếu tia uv với thời gian 120s cho khà ức chế p — lactamaselớn thu 19mm với vi sinh vật kiêm định làB.ccrus Nghiên cứu đưa quy trình tách axit từ xạ khuần S.clavuligeriỉs đột biển quy mô phịng thí nghiệm 4.2 ĐỒ vnát - Tiếp ng hợp axìt clavulanic từ chủng xạ khuân S.clavuligerus - Thu nhận axit clavulanic từ chủng xạ khuân S.clavuligerus với quy mô lớn đe áp dụng vào ngành y -dược TÀI LIỆU THAM KHẢO A: TÀI LIỆU TIÊNG ANH Townsend, CA (Oct 2002) "New reactions in clavulanic acid biosynthesis." Current Opinion in Chemical Biology (5): 5839 doi:10.1016/S1367-5931(02)00392-7 PMID 12413541 Jump upA Reading, c.; Cole, M (1 May 1977) "Clavulanic Acid: a BetaLactamase-Inhibit! ng Beta-Lactam from Si reptomyces clavuligerus" Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11 (5): 852857 doi:10.1128/AAC.l 1.5.852 Arulanantham H, Kershaw NJ Hcwitson KS Hughes CE, Thirkcttlc JE, Schofield CJ (January 2006) "ORF 17 from the clavulanic acid biosynthesis gene cluster catalyzes the ATP-dependent formation of N-glycyl-clavaminic acid" J Biol Chem 281 (1): 27987.doi:10,1074/jbc.M507711200 PMID 16251194 Tahlan K Park HU, Wong A, Beatty PH Jensen SE (March 2004) "Two sets of paralogous genes encode the enzymes involved in the early stages of clavulanic acid and clavam metabolite biosynthesis in Streptomyces clavuligerus” Antimicrob Agents Chemother 48 (3): 9309 doi:10.1128/AAC.48.3.930-939.2004 PMC 353097 a.PMID 14982786 10 Reading C.; Cole, M (I May 1977) "Clavulanic Acid: a Beta-LactamaseInhibiting Beta-Lactam from Streptomyces clavuỉigerus" Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11(5): 852-857 doi:10.1128/A AC 11.5.852 PMC 352086 a, PMID 879738 11 Jump upA Busby, RW; Townsend, CA (Jul 1996) "A single monomeric iron center in clavaminate synthase catalyzes three nonsuccessive oxidative transformations." Bioorganic & Medicinal Chemistry (7): 105964 doi: 10.1016/0968-0896(96)00088-0 PMID 8831977 Jump upA Bachmann, BO; Townsend, CA (Sep 19, 2000) "Kinetic mechanism of the beta-lactam synthetase of Streptomyces clavuligerus." Biochemistry 39 (37): 1118793.doi: 10.1021/bi000709i PMỈD 10985764 8-Jump upA Khaleeli, Nusrat; Li Rongfeng; Townsend, Craig A "Origin of the jLLactam Carbons in Clavulanic Acid from an Unusual Thiamine Pyrophosphate-Mediated Reaction1' Journal of the American Chemical Society 121 (39): 9223-9224 doi:10.1021/ja9923134 Jump upA Joint Formulary Committee British National Formulary, 47th edition London: British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain: 2004 10 Jump upA "Drug Record - Amoxiciilin-Clavulanate" LiverTox - Clinical and Research Information on Drug-Induced Liver Injury Retrieved April 24, 2013 11 JLimp upA' irtajadu ) A, Gr â lera M, Clement Paredes A, García Munoz E, Tallon Guerola M 2008 8) "Hypersensitivity to clavulanic acid in children" Allergol Immunopathol (Madr) 36(5): 308-10 doi:10.1016/S0301-0546(08)75228-5.PMID 19080805 2009 aggaley K Brown A Schofield c (1997) "Chemistry and biosynthesis of clavulanic acid and other clavams" Nat Prod Rep 14 (4): 30933 doi: 10.1039/np9971400309 PM ID 9281835 13 Jump upA Doran J, Leskiw B, Aippersbach s, Jensen s (1990) "Isolation and characterization of a beta-lactamase-inhibitory protein from Streptomyces clavuligerus and cloning and analysis of the corresponding gene" J Bacteriol 172 (9): 4909-18 PMC 213145 PM1D 2203736 14 Jump upA Aharonowitz Y Demain A (1 August 1978) "Carbon Catabolite Regulation of Cephalosporin Production in 15 Streptomycesclavuligerus" Anlimicrob Agents Chemother 14 (2): 159— 64.doi: 10.1128/aac 14.2.159 PMC 352426 PMTD 697343 16 Jump upA Garcia-Dominguez M, Martin J, Liras p (1989) "Characterization of sugar uptake in wild-type Streptomyces clavuligerus, which is impaired in glucose uptake, and in a glucose-utilizing mutant" J Bacterio! 171 (12): 680814 PMC 210580 PM ID 2687256 17 Jump upA Kirk s (2000) "The physiology of clavulanic acid production by Streptomyces cỉavuỉigerus (PhD thesis)" University of Surrey, UK 77 Reading c, Cole M (Ỉ977) "Clavuianic Acid: a Beta-Lactamase-lnhibiting Beta-Lactam from Streptomyces clavuligerus" Antimicrob Agents Chemother 11 (5): 852-7.dơi: 10.1128/aac.l1.5.852 PMC 352086 $ PMID 879738 18 *Junụ elavuligerus sp , a beta-lactam antibiotic producer International Journal of Systematic Bacteriology 21 (4): 326-3Ì.dơi:10.1099/002077J3-21-4-326 19 Jump up* Nabais AMA, Dafonseca MMR (1995) 'The Effect of Solid Medium Composition on Growth and Sporulation of Streptomyces-Clavuligerus - Spore Viability During Storage at +4-Degrees-C".Biotechnology Techniques (5): 361-4 doi:ỉ0.ỉ007/BF00638871 20 Jump up* Tahlan K, Anders C, Jensen s (2004) "The Paralogous Pairs of Genes Involved in Clavulanic Acid and Clavam Metabolite Biosynthesis Are Differently Regulated in Streptomyces clavuligerus" J Bacteriol 186 (18): ữẩ 6286-97 doi: 10.1128/JB 186.18.6286-6297.2004 PMC515150 iẳ PMID 15342599 21 Waksman, s A (1961) The Actinomycetes Classification, identification DNA descriptions of genra ADN species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA B: TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 22 Cao Văn Thu Bài giáng kháng sinh Vitamin, Bộ môn Công nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội, 2000 23 Biển Vãn Minh (2000), Nghiên cứu khả nâng sinh chái kháng sinh cùa sổ chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội 24 Bùi Thị Hà, Nghiên cứu xạ khuân sinh CKS chổng nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến Sinh học, Hà Nội, 2006 25 Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, Nhà xuất bàn y học Hà Nội,Trang 720, 2005 26 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một sổ phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 - 345 27 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyển, Phạm Văn Ty (2002), Ví' sinh vật học, Nhà xuất bàn Giáo Dục, Hà Nội, tr 39 - 41 28 Ngi ĩiỉán chu yếu, Vietsciences, 15/02/2006 29 PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, giáo trình vi sinh vật học (lập 2) - (tr 12 - 19) 30 BÙĨ ThỊ Việt Hà, Nghiên cứu xa khuân sinh chat kháng sinh chồng nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiền sĩ Sình học, Hà Nội, 2006 ... tài: ? ?Nghiên cứu tạo đột biến uv tăng suât sinh tổng hợp clavulaníc acid từ xạ khuân Streptomyces cỉavuỉigerus” Phần 1: TÔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sình 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh -... nhiên chủng xạ khuẩn đột biến Sau lựa chọn khoảng thời gian đột biến chúng có khả sinh axit cao th nh axit cao.Ket đưực tile bi _g sau Báng 3.6 Ket sàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuẩn đột biến Ký hiệu. .. hiệu chủng đột Hoạt tính axit Ký hiệu chủng đột Hoạt tính axit biến S.cỉavulìgerus chủng với bicn chủng với B.cereus S .clavuligerus B.cereus UV5 -1 D (mm) 18 UV5 -6 D (mm) 19 UV5 -2 18 UV5 -7 19,5 UV5 -3