Nghiên cứu tách chiết và phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES SP KCTC 0041BP sau khi đã đột biến mất GEN MIII

VIỆN DẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỈOCg-*-SíXS8 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DÈ TÀI: NGHIÊN CứU TÁCH CHlếT VÀ PHÂN TÍCH cấu TRÚC KHÁNG SINH THU ĐUọC Từ CHÚNG Xạ KHUấN STREPTOMYCES SP KCTC 0041BP SAU KHI ĐÃ ĐỘT BlếN MấT GEN GER Mill Giáo viên hưóng dẫn :Th.s Nguyễn Thị Ngọc Anh Sinh viên thục hiên :Nguyễn Hoài Linh Lớp :ll-02 Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập thực đề tài em nhận nhiều quan tâm, giúp đờ quý thầy cỏ, gia đình hạn hè Với lịng biết ơn sâu sac nhát em xin gửi tới cô giáo - ThS Nguyễn Thị Ngọc Anh - người định hướng nghiên cứu, giúp đỡ tạo điểu kiện tốt cho em suốt trình thực tập hồn thành đề tài nghiên cứu cùa Em xin chân thành cảm ơn TS Tạ Thị Thu Thúy - Chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mờ Hà Nội, toàn thê thay cô giáo, anh chị kĩ thuật viên bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Sinh học phân tứ ln bên cạnh động viên, khích lệ, ủng hộ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Bước đầu tìm hiếu, thực đề tài với von kiến thức hạn che nhiều bỡ ngỡ Mặc dù bân thân có nhiều cố gắng, khơng tránh khỏi thiều sót nên em mong nhận ý kiến đóng góp q Thây - Cơ đê khóa luận ém dầy dụ hqn Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Hoài Linh Nguyễn Hồi Linh Lóp 11-02 Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC HÌNH V DANH MỤC CÁC BÁNG vi MỚ ĐÂU PHÁN 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tông quan vê kháng sinh 1.1.1 Lịch sử kháng sinh 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.5 Các nghiên cứu gần kháng sinh 1.2 Tổng quan xạ khuấn Streptomyces 1.2.1 Vai 1.2.2 Giới thiệu xạ khuấn Streptomyces 10 1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 10 1.3 Xạ khuẩn Streptomyces sp K.CTC 0041BP 11 1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy 11 1.3.2 Đặc điếm sinh lý, sinh hóa 13 1.3.3 Khá kháng khuân với số vi sinh vật kiếm định 13 1.3.4 Phân loại 13 1.4 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041 bp đột biến GerMIII 13 1.5 Tổng quan kháng sinh dyhidrochalcomycin 14 1.5.1 Cấu trúc cùa dyhidrochalcomycin 15 1.5.2 Vai trò hoạt tính sinh học 15 1.5.3 Các nghiên cứu dihydrochalcomycin 16 1.6 Đại cương gen gerMIII (2-O-methyltransferase) 21 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu 23 Nguyễn Hồi Linh Lóp 11-02 Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.1 Vật liệu hóa chất thiết bị 23 2.1.1 Vật liệu 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.4 2.2 Thiết bị 25 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 25 2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 27 2.2.3 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô dung môi hữu 27 2.2.4 Phương pháp thư hoạt tính kháng sinh khoanh giấy lọc 29 2.2.5 Phương pháp sac ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) 30 2.2.6 Phương pháp Prep - TLC (Prepare TLC) 31 2.2.7 Phương pháp sắc ký lóng kết hợp khối phố (Liquid Chromatography Mass) 2.2.8 33 Phương pháp ion h^tia 0iện ESI (Electrophox^si^ Spray ^jnization) 34 PHÀN 3: KÉT QUA VÀ THAO LUẠN 35 3.1 Tách chiết kháng sinh thô bang dung môi hữu 35 3.2 Thừ hoạt tính kháng sinh bang phương pháp khoanh giấy lọc 36 3.3 Tthừ hoạt tính kháng sinh phương pháp sắc ký lóp móng TLC 38 3.4 Tinh kháng sinh bàng Prep - TLC (Prcpare-TLC) 40 3.5 Ket phân tích kháng sinh phương pháp sắc ký lóng kết hợp khối phố (LC-Mass) phương pháp ESI-Mass 41 3.6 Quy trình tách thu nhận kháng sinh thơ quy mơ phịngthí nghiệm 43 3.7 Qui trình tinh quy mơ phịng thí nghiệm 45 PHẦN 4: KÉT LUẬN VÀ DỀ XUẤT 46 4.1 Kết Luận 46 4.2 Đe Xuất 46 TÀI LIỆU THAM KHÁO 47 Nguyễn Hoài Linh iii Lóp 11-02 Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TÁT Chữ viết tắt Chú thích Amp Ampicillin Bp Base paire c Carbon CKS Chat kháng sinh DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates RNA Ribonucleic Acid Gr+ Gram dương Gr Gram âm Neo Neomycin vsv Vi sinh vật HPiiCviện Viện Đị học High Perfomance Liquid Chromatography LB Luria Bertani TLC Thin Layer Chromatography LC-Mass Liquid Chromatography Mass PKS Polyketidc Synthase ESI-Mass Electrophoresis Spray Ionization Mass dvC Đơn vị Cacbon Nguyễn Hoài Linh iv Lóp 11-02 Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Khn lạc cua chùng Streptomyces sp KCTC 004IBP trênmôi trường ISP2 12 Hình 1.2 Hình dạng KTKS KTCC chúng Streptomyces sp KCTC 004IBP phóng đại (x 4.500-15.000) 13 Hình 1.3.Cấu trúc cùa Dihydrochalcomycin .15 Hình 1.4 Dự đoán đường sinh tổng hợp gốc đường khứ bước cuối hoàn thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin 19 Hình 1.5 Nhóm gen sinh tổng hợp dihyrochalcomycin phân lập từpGERI-5 cosmid 22 Hình 3.1 Phân pha chiết dịch kháng sinh 35 Hình 3.2 Sản phấm kháng sinh chùng đột biến sau quay cô 36 Hình 3.3 Ket q thử hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP đột biến 37 Hình 3.4 Kết q kíềni tfa\:hặy TLC c&t chủng kỉreịttịìnyces sp KCTC 0041BP(W) chúng đột biến M3-1-10(10), M3-8-I3(13) 38 Hình 3.6 Kết thứ hoạt tính kháng sinh sau tinh 40 Hình 3.5 Kct q thứ hoạt tính kháng sinh phương pháp TLC với chúng xạ khuấn Streptơmyces sp KCTC 0041BP ban đầu(W) chúng đột biến M3-l-10(10), M3-8-13(13) 39 Hình 3.7 Ket chạy TLC sau tách khói bột silicagel 41 Hình 3.8A hình 3.8B: Phân tích cấu trúc phân tứ Dihydrochalcomycin bàng LC-Mass 42 Hình 3.9A hình 3.9B: Phân tích cấu trúc cùa dẫn xuất kháng sinh từ chùng đột biến gen GerMIlI 43 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình thu nhận kháng sinh thơ 44 Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tinh quy mơ phịng thí nghiệm 45 Nguyễn Hồi Linh Lóp 11-02 Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BANG Bảng 1.1 Dự đoán chức cùa gen ORFs nhóm gen sinh tống hợp dihydrochalcomycin 17 Bảng 3.1 Ket quà thứ hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 004IBP ban đầu chúng đột biến M3-8-13, M3-1-10 37 Bàng 3.2 Kết thừ hoạt tính kháng sinh phương pháp TLC với chùng đột biến M3-1-10, M3-8-13 chủng wild type 38 Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Nguyễn Hoài Linh vi Lóp 11-02 Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Bệnh nhiễm khuấn nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến an tồn cùa người Những trận dại dịch khơng cướp sinh mạng người mà chí cịn dẫn đến diệt vong cùa đế chế hùng mạng Chính điều thơi thúc nhà khoa học giới phái tìm chất có khã phịng chong điều trị bệnh nhiễm khuẩn Ngày với phát triển vượt bậc cơng nghệ sinh học tìm nhiều chất kháng sinh (CKS) phục vụ đời sống người Trong số 10.000 CKS tìm có khoáng 2.000 chất thực vật tạo khoảng 8.000 chất kháng sinh vi sinh vật tổng hợp xạ khuẩn tồng hợp 80% 1111 Tuy nhiên, việc sử dụng CKS không hợp lý làm xuất hiện tượng kháng kháng sinh, số lượng vi khuẩn kháng với chất kháng sinh ngày gia tăng Vì vậy, kèm với biện pháp sử dụng kháng sinh an tồn, hợp lý việc nghiên cứu sàn xuất chat kháng sinh có nhiều đặc tính ưu việt thựcsựrấtcầnthiểpi^ viện Viện Đại học Mở Hà Nội Xạ khuấn Streptomyces sp KCTC0041BP dang dược nghiên cứu nhiều nước Hàn Quốc, Việt Nam Đây chùng hoang dại sinh tồng hợp Dihydrochalcomycin phân lập xác định cấu trúc hóa học bời nhóm nghiên cứu Hàn Quốc 119] Kháng sinh Dihydrochalcomycin (C35H58O14) kháng sinh thuộc nhóm Macrolide 16C, sứ dụng điều trị nhiễm trùng đường hô hấp Kháng sinh Dihydrochalcomycin tách chiết từ chũng xạ khuân Streptomycessp KCTC 004IBP có tác dụng ức chế tiêu diệt vi khuẩn Gr' (Gram âm) Gr+ (Gram dương) bang cách liên kết vào tiểu phần 50S cùa ribosome, ngăn càn trình sinh tống hợp protein vi khuấn Nhiều nhà khoa học dang quan tâm nghiên cứu loại kháng sinh bới nhiều ưu điếm vượt trội cùa độc, dung nạp lốt, thái trừ nhanh, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đặc biệt chưa xuất hiện tượng kháng thuốc Nguyễn Hồi Linh Lóp 11-02 Viện dại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Các nhóm nghiên cứu giới xác định tồn nhóm gen cùa xạ khuấn Tồn nhóm gen tham gia sinh tống hợp có chuỗi trình tự 75.5kb có khoảng 23 ORF chứa thơng tin di truyền mã hóa gen tham gia đường tông hợpDihydrochalcomycin: gerữ, gerMl, gerN, gerR gerPl, gerP2, gerG gerE gcrD, gerF, gerM2, gerP3, gerH, gerK gerM3, gerĩ 1, gerK, gerS 1, gerS2, g