KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU TÁCH CHIÉT POLYSACCHARIDE TÙ QUẢ THẾ NẤM CORDYCEPS MILỈTARIS Nguôi hướng dẫn ThS vũ DUY NHÀN Sinh viên thục hiện HOÀNG THỊ NHÀN Lóp 13 01 K20 Hà Nội 2017 VIỆN DẠ.
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIÉT POLYSACCHARIDE TÙ QUẢ THẾ NẤM CORDYCEPS MILỈTARIS Nguôi hướng dẫn : ThS vũ DUY NHÀN Sinh viên thục : HỒNG THỊ NHÀN Lóp : 13.01 - K20 Hà Nội - 2017 VIỆN DẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC ======£03====== KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CÚU TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE TÙ QUẢ THÊ NÁM CORDYCEPS MỈLITARỈS Người hướng dẫn : ThS VŨ DUY NHÀN Sinh viên thực : HỒNG THỊ NHÀN Lóp : 13.01- K20 Hà Nội - 2017 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LÒI CẢM ON Lời tơi xin bày tị lịng kính trọng biết cm sâu sac tới Th.s Vũ Duy Nhàn, người trực tiếp hướng dẫn, động viên giúp đỡ tỏi trình nghiên cứu thực tập đe thực đề tài “ “Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ q nấm Codyceps militarìs” Tơi xin cám ơn ban lãnh đạo Viện Hóa học-Vật liệu/Viện Khoa học Cơng nghệ qn anh chị Phịng Hóa sinh, tạo điểu kiện thuận lợi cho suốt trình thực tập làm đê tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Phòng Đào tạo Viện Đại học Mờ Hà Nội, thây cô tạo điêu kiện suốt trình học tập trường thực hiên luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hoàng Thị Nhàn Hoàng Thị Nhàn Lớp: 1301-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC Danh mục chữ viết lắt Danh mục hình Danh mục báng MỚ ĐẦU PHÀN 1: TÓNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Codyceps militaris 1.1.1 Đặc điếm nấm Codyceps militaris 1.1.2 Thành phần hóa học Codyceps militaris 1.1.2.1 Adenosine 1.1.2.2 Cordycepin 1.1.2.3 Sterols 1.1.2.4 Nucleotides 1.1.2.5 Protein amino acid Acid béo qqw.việa.y.ịện.Ị^ị.j^.MỞHàNội 1.2.6 1.1.2.7 Polysaccharide 1.1.2.8 Acid cordyceptic .10 1.1,2.9 1.1.3 Ergosterol 11 Các ứng dụng từ quă nấmCodyceps militaris 11 ỉ 1.3.1 Tăng cường khả nâng miễndịch 11 1.1.3.2 Điểu trị bệnh ung thư 11 1.1.3.3 Giải độc thận 12 ì 1.3.4 Điêu trị bệnh phôi 12 1.1.3.5 Điều trị bệnh tim mạch 12 1.1.3.6 Tăng sức bền 13 1.1.3.7 1.2 1.2.1 Làm giảm LDL-Cholesterol máu 13 Giới thiệu ve Polysaccharide từ nấm Cordyceps militaris 13 Đặc diêm Polysaccharide từ thề nấm Cordyceps militaris 13 Hoàng Thị Nhàn Lớp: 1301-CNSH Khóa luận tốt nghiệp 1.2.2 Viện Đại học Mở Hà Nội Hiện trạng tách chiết tinh Polysaccharide từ thể nấm Cordyceps militaris 14 1.2.3 1.3 Tác dụng dược lý polysaccharide 17 Tình hình nghiên cứu tách chiết Polysaccharide từ quà thê nấm Cordycep nũlitarís 18 1.3.1 Tinh hình nghiên cứu Polysaccharide giới 18 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ni Cordyceps militarís Việt Nam.20 PHÀN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 23 2.1 Nguyên liệu thiết bị nghiên cứu 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Thiết bị hóa chất 24 2.2 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 24 Phương pháp tách chiết Polisaccharide từ Quà thẻ nấm Cordyceps militarís 25 2.2.2 Xác định hàm lượng Polysàccharidetheo phương pháp phenol-sunfuric Milchel.DuBois, K.A.Gilles cs, 1956 25 2.2.3 Thu nhận Polysaccharide bàng phương pháp kết tùa 28 2.2.4 Phân tích nhóm chức Polysaccharide bang 1R 28 PHÂN 3: KẾT QUÁ 30 3.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết 30 3.2 Nghiên cứu ănh hướng ti lệ mẫu/ dung môi dùng để tách chiết 31 3.3 Kháo sát ảnh hướng yếu tố đến hiệu suất tách chiết 32 3.3.1 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hướng thời gian chiết 32 Nghiên cứu ành hưởng cùa nhiệt độ chiết 34 3.4 Xây dựng quy trình tách chiết 35 3.5 Kết đo phổ .40 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHÁO 45 Hoàng Thị Nhàn Lớp: 1301-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC CHỦ CÁI VIÉT TẮT Chừ viết tắt Nội dung CP Cordyceps Polysaccharide C.Militaris Nhộng trùng hạ thảo c sinensis Đông trùng hạ thào Sp Species- Một loài Spp Species plural- Nhiều loài P1 Polysaccharide thu từ dịch sau chiết với nước P2 Polysaccharide thu từ phần bã bổ sung NaOH 4% P3 Polysaccharide thu sau kết tua Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hoàng Thị Nhàn Lớp: 1301-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cordyceps mililaris .5 Hình 1.2: cấu trúc hóa học cùa Adenosine Hình 1.3: cấu trúc hóa học cùa Cordycepin Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo polysaccharide 10 Hình 2.1: Cordyceps militaris nuôi cấy Viện Khoa học công nghệ quân - BQP 23 Hình 2.2: Mầu dùng đế tách chiết 23 Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tách chiết tinh Cordyceps polysaccharide 25 Hình 2.4: Mầu đo đường chuẩn 27 Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn glucose( p.g/ml') 27 Hình 2.6: Máy ép thủy lực Specac 29 Hình 2.7: Máy đo phổ spectrum two 29 Hình 3.1: Ánh hướng phương pháp chiết tới hàm lượng polysaccharide dịch chiết,.ThỊj.việa.Việ»Đạihọe"MỞHàNội 30 Hình 3.2: Ảnh hường cùa phương pháp chiết tới khối lượng Polysaccharide thu 30 Hình 3.3: Anh hưởng cùa ti lệ mầu/dung môi dung dịch chiết 31 Hình 3.4: Anh hưởng ti lệ mẫu/dung môi lên khối lượng polysaccharide thu 32 Hình 3.5: Anh hường thời gian chiết lên hàm lượng polysaccharide thu 33 Hình 3.6: Ánh hường thời gian chiết khối lượng polysaccharide thu 33 Hình 3.7: Ánh hướng nhiệt độ chiết tới hàm lượng polysaccharide thu 34 Hình 3.8: Ảnh hưởng nhiệt độ chiết tới khối lượng polysaccharide thu 34 Hình 3.9: Sơ đồ quy trình tách chiết Polysaccharide 36 Hồng Thị Nhàn Lớp: 1301-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.10: Phổ hồng ngoại IR cùa mẫu CM-hs-CPS2 chuẩn theo kết nghiên cứu cùa Fengyao Wu [19] 40 Hình 3.11: Kct đo phổ hồng ngoại IR cùa mẫu P1 41 Hình 3.12: Ket đo phổ hồng ngoại IR mầu P2 42 Hình 3.13: Ket quà đo phố hồng ngoại IR mẫu P3 42 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hồng Thị Nhàn Lớp: 1301-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại khoa học Bảng 1.2: Thành phan acid béo cùa Cordyceps militaris Bàng 1.3: Hàm lượng cùa số loại đường có Polysaccharide quà sợi nấm Cordyceps militaris 14 Bàng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides 14 Bàng 1.5: Hiện trạng kỹ thuật tinh Polysccharide 16 Bảng 1.6: Khả kháng khối u cúa số polysaccharide thu nhận từ số loại nấm 18 Báng 2.1: Thiết bị dùng thí nghiệm 24 Báng 2.2: Xây dựng phương trình đường chuấn Glucose 26 Bàng 3.2: So sánh phồ IR mầu 42 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hoàng Thị Nhàn Lớp: 1301-CNSH MỞ ĐẦU Chi nấm Cordyceps biết đến cách 2000 năm trước cơng ngun, với 350 lồi tồn giới Trong có lồi Cordyceps sinensis thường ký sinh sinh trường lên ấu trùng lồi trùng thuộc chi Hepialus Thường gặp ấu trùng loài Hepiaỉus armoricanus Sàn phẩm thồ nấm xác ấu trùng dân gian Trung Quốc từ xưa gọi Đông Trùng Hạ Thảo, loại dược liệu quý bậc y học cổ truyền Trung quốc.Bên cạnh Cordyceps sinensis cịn có lồi nấm Cordyceps militaris có đặc điếm tương tự Lồi nấm Cordyceps militaris phân bố yếu vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao 4000m so với mực nước biền vùng Tây Tạng (Trung Quốc), số vùng thuộc Nepan Butan[5] Trong chi Cordyceps cịn có lồi khác Cordyceps militaris (L ex Fr.)Link có thành phần tính chất dược liệu tương tự với Cordyceps sinensis Loài nấm dược liệu với nhiều tên thông dụng khác Thu„vieii yi^iiiDaiJopc Mớ -Ắ so quoc gia như: Đông trùng hạ thảo, Trung tháo; Bãc Trùng thảo (Trung Quốc), Tong ch’ung ch'o (Hàn Quốc), Tochukaso (Nhật Bán), Yarchakunbu (Tây Tạng) Shonkor Kumar Das cộng sự, 2010 [5], Loài Nấm Cordyceps niilitaris có hàm lượng hoạt chất có hoạt tính sinh học thể cordycepin, ergosterol, mannitol, cordyepolysaccharide nhiều thành phần khác tương đương, chí cịn cao lồi Cordyceps sinensis[5] Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng, sinh khối loài nấm có số chức dược lý: bào vệ gan, tăng cường chức thận, chống ung thư bạch cầu, chống hình thành khối u hạn che di căn, cải thiện khả tiết insuline người tiêu đường, tăng cường khả [5,7], Các nghiên cứu gần chi thể Cordyceps militaris ấu trùng bị chúng kí sinh có chứa chất có hoạt tính sinh học quan trọng, có phố tác dụng dược lý rộng polysaccharides, cordycepin, ergosterol! 81 Cordyceps polysaccharides (CP) nhóm hoạt chất giàu quan trọng Hoàng Thị Nhàn Lớp: 1301 - CNSH tíìn/i 3.5: Án/i /tường t/iờigian c/iiết /ên /làm /ưọngpo/ysacc/iaride t/m Hình 3.6: Anh hưởng thời gian chiết khối lượng polysaccharide thu Nhận xét: Khi tăng thời gian từ 30 phút lên đến 60 phút, hàm lượng tăng dần, tăng lên 90 phút hàm lượng lại giảm dần, thời gian chiết lâu lẫn nhiều tạp chất ảnh hường đến trình phân tích làm giảm hàm lượng Polysaccharide Đối với khối lượng, tăng thời gian chiết từ 30 phút lên đến 60 phút, khối lượng polysaccharide tăng từ 47.569855 lên đến 69.0761255 tăng thời gian lên 90 phút khối lượng lại giảm xuống cịn 38.2456/tg, thời gian chiết dài ảnh hương tới số ml chiết Do vậy, lựa chọn thời gian 60 phút đổ tách chiết polysaccharide 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ chiết Nhiệt độ chiết yếu tố ảnh hưởng lớn tới trình tách chiết Vì chúng tơi tiến hành khão sát chiết mẫu với thông số chiết cố định: phương pháp siêu âm, thời gian 60 phút, dung môi chiết: H2O, số lần chiết: Thông số khảo sát: 50°C, 60°C, 80°C, 100°C ỉ/ài/i ĩ 7: Áỉi/i /lưởng n/úệt độ c/iiết tói/làm /ưọĩigpcỉỵsacc/iarãỉe t/iu Hìn/i 3.8: Ájỉ/i/lưỏĩig a/ãệt độ chiết tóiẢ7/ỐÌỉượrtgpofysacc/taride t/ia dime Nhận xét: Khi nhiệt độ dung mơi trích ly cao hàm lượng Polysaccharide cao Hàm lượng 50°C 0.4223 pg/ml 100°C hàm lượng tăng 0.5671 pg/ml Khi nhiệt độ tăng phân tử dung mơi chuyến động hỗn độn giúp trình di chuyến phần từ dung môi xâm nhập, xáo trộn vào sâu bên phần bột thể nấm Cordyceps militaris Đối với khối lượng, tăng nhiệt độ từ 50°C lên 80°C khối lượng lại tăng từ 55.475 pg lên 64.5897 pg Tuy nhiên 100°C khối lượng lại giảm xuống cịn 54.145 pg Vì nhiệt độ cao, dịch chiết thấp dần tới khối lượng giám 3.4 Xây dựng quy trình tách chiết Sau khảo sát yeu tố ănh hường tới q trình chiết, chúng tơi thống đưa quy trình tách chiết Polysaccharide thu Polysaccharide sau: Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hoàng Thị Nhàn 35 Lớp: 1301 - CNSH Hình 3.9: Sơ đồ quy trình tách chiết Polysaccharide Hồng Thị Nhàn 36 Lớp: 1301 - CNSH MỘT SĨ HÌNH ÁNH TRONG Q TRÌNH TÁCH CHIÉT POLYSACCHARIDE Mầu + 100ml H2O Dịch sau lọc Bố sung 80ml cồn, đề qua đêm, li tâm ủ với 50ml NaOH 55°c Ly tâm dịch Dịch+ 10ml CH3COOH Ly tâm 5000v/p ophút Cặn sau ly tâm Cân 5g bột nấm Codyceps militaris khô Đem ngâm chiết với OOrnl nước nóng oo°c h Lọc lấy phần dịch, phần bã tiếp tục bồ sung 100ml nước cất chiết lần Ih Lọc tách riêng phần dịch phần bã •Đoi với phần dịch: Gộp phần dịch cùa lan chiết vào làm giảm tích xuống cịn 2Oml 1OO°C, ly tâm thu dịch Bố sung 80ml ethanol 96°c ủ qua đêm tù lạnh Ly tâm 5000vòng/phút lOphút thu cặn (Pl) • Đối với phần bã Bã đem sấy khô, bổ sung 50ml NaOH 4% vào ủ Ih 55°c Lọc tách phần dịch bã nấm tiếp tục bổ sung 50ml NaOH 4% vào, ũ Ih 55°C Gộp phần dịch bã lần chiết đem ly tâm 5000vòng/phút loại bỏ cặn Phần dịch nồi đem trung hòa bàng 10ml Axit acetic, để tù lạnh qua đêm Tiếp tục ly tâm thu phần dịch kết tủa Phần dịch bồ sung lần thể tích Ethanol 96°c để lắng qua đêrri Ly thu kết tủa làm khô (P3) Báng 3.1: Kết sau tách chiết Polysaccharide từ Cordyceps inilitaris Hàm Mầu Cặn (g) lượng p Thê tích dịch (/rg/ml) (ml) Dịch chiết với nước nóng (P1) Khối Polysaccharide (Mg) 0.714 0.279 164 15.152 0.303 1.898 0.0952 80 7.6 0.152 0.157 0.088 320 28.16 0.563 Dịch chiết với NaOH (P2) Tủa(P3) % lượng Nhận xét: Theo kết băng trên, phân đoạn tách chiết chưa hàm lượng Polysaccharide.Ó phân đoạn P1 hàm lượng polysaccharide cao Hoàng Thị Nhàn 39 Lớp: 1301 - CNSH 0.279 /zg/ml, hàm lượng thấp P3 0.088 jUg/ml Kết cho thấy tổng hàm lượng Polysaccharide thu mồi phân đoạn giám dần Hiệu suất thu Pl P2, P3 tương ứng nấm Cordyceps militaris 0.303%, 0.152%, 0.563% Ket tách chiết polysaccharide từ giá thể có hàm lượng polysacchardide 0,78% Như vậy, tách chiết polysaccharide từ đạt giá trị hàm lượng cao giá thê, nhiên phần quà tách chiết tốn Theo kết nghiên cứu Guanghao(2007) [17| thu 0.1641g polysaccharide tách chiết từ 20g Cordyceps militaris với hiệu suất đạt 0.82% Chúng kết luận với phương pháp chiết này, hàm lượng polysaccharide thu tương đối tốt 3.4 Kết đo phổ Theo nghiên cứu Fengyao Wu đặc điểm cấu trúc hoặt động chống oxy hóa củạ polysaccharide Ịừ.c militaris (16/9/2011) chiết polysaccharide có tên CM-hs-CPS2 [ 19] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wave number!