Nghiên cứu tách chiết thành phần hóa học và khả năng chống oxy hóa của hợp chất từ cao chè dây ở quảng nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CHÚNG TỪ CAO CHÈ DÂY QUẢNG NAM Người hướng dẫn : TS ĐẶNG ĐỨC LONG Người hướng dẫn : NCS NGUYỄN THỊ XUÂN THU Sinh viên thực : ĐẶNG THỊ THÚY AN Số thẻ sinh viên : 107120238 Lớp : 12SH Đà Nẵng, tháng 5/2017 TÓM TẮT Chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch) thảo dược phổ biến vùng nhiệt đối, từ lâu sử dụng làm thuốc điều trị bệnh dày – hành tá tràng Nghiên cứu tách chiết đánh giá khả chống oxy hóa hợp chất từ cao chiết chè dây Quảng Nam Các nồng độ cồn khác khảo sát nhằm chọn nồng độ thích hợp cho trình chiết tách cao chè dây Đồng thời sử dụng phương pháp sắc ký cột cổ điển để tách chiết hợp chất hóa học từ mẫu cao etyl acetate, kết thúc q trình thu nhận chất kết tinh có màu vàng Hợp chất kết tinh định danh phương pháp HPLC với chất chuẩn myricetin thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa chúng phương pháp bắt gốc tự DPPH Kết thu nhận từ HPLC chất kết tinh có chất Một hai chất xác định myricetin khả chống oxy hóa mạnh Từ khóa: “cao chè dây”, “sắc ký cột”, “chống oxy hóa”, “nồng độ cồn”, “DPPH” ABSTRACT Che day (Ampelopsis cantoniensis Planch), which belong to the Vitaceae family, is a popular herb in the tropical areas Using this to brew tea is known as a treatmen to gastric ulcers and gastrointestinal diseases in Vietnamese traditional medicine In this research, the extraction of different compounds from Ampelopsis cantoniensis plant was carried out using different concentration of ethanol Result show a solution of 70% ethanol yields the highest effeciency of che day extraction Using the classic column-chromatography method, crystals of polyphenol compounds were obtained These compounds then were indentified by using HPLC method with myricetin as standard and assessed anti – oxidant activity using DPPH test One of obtained compounds were confirm to be myricetin and possesses poten anti-oxidant properties Keywords: “Che day rich- extract”, “column chromatography”, “anti-oxidant”, “ethanol concentration”, “DPPH ” ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA CỘNG HỊA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: … …………….………….…… Số thẻ sinh viên: ……………… Lớp:…………… Khoa: Ngành: ……………… Tên đề tài đồ án: ……………………………………………… ………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: …………………………………… …………………………………………… …… ………………………………………………………………………………………… … ………………………………….… ……………………… ……………………… Nội dung phần thuyết minh tính toán: … ……………………………………………………………………………………… … ……………………………………………………………………………………… … ……………………………………………………………………………………… … ……………………………………………………………………………………… … ……………………………………………………………………………………… Các vẽ, đồ thị ( ghi rõ loại kích thước vẽ ): … ……………………………………………………………………………………… … ……………………………………………………………………………………… … ……………………………………………………………………………………… … ……………………………………………………………………………………… Họ tên người hướng dẫn: ………………………………… …………………… Ngày giao nhiệm vụ đồ án: …… /……./201… Ngày hoàn thành đồ án: …… /……./201… Trưởng Bộ môn …………………… Đà Nẵng, ngày tháng năm 201 Người hướng dẫn LỜI CẢM ƠN Trong năm học trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng, em tích lũy tri thức, kinh nghiệm phương pháp nghiên cứu, học tập hành trang hỗ trợ cho em tương lai Với lòng biết ơn sâu sắc , em xin gửi đến thầy cô công tác trường Đại học Bách Khoa, thầy khoa Hóa, đặc biệt thầy môn Công nghệ Sinh học NCS Nguyễn Thị Xuân Thu nhiệt tình truyền đạt kiến thức giảng dạy em suốt năm năm qua Em xin chân thành cảm ơn thầy TS Đặng Đức Long NCS Nguyễn Thị Xn Thu tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Nếu khơng có lời khun thầy cho em giai đoạn khó khăn em khó có thề hồn thành tốt đề tài Em xin chân thành cảm ơn đến thầy cán phịng thí nghiệm KS Võ Cơng Tuấn KS Phạm Thị Kim Thảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành tốt thí nghiệm phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ sinh học Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn gia đình hỗ trợ tài động viên, giúp đỡ nguồn động lực giúp đỡ em thời điểm khó khăn học tập để hoàn thành tốt đề tài giao; với giúp đỡ, hỗ trợ bạn lớp 12SH bạn thực đề tài phịng thí nghiệm quãng thời gian học tập làm thí nghiệm Bước đầu vào làm nghiên cứu khoa học, không tránh khỏi bỡ ngỡ thiếu sót, em mong nhận thơng cảm đóng góp ý kiến quý báu thầy cô để đề tài em hoàn thiện Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành Cán phản biện thầy cô Hội đồng bảo vệ dành thời gian để xem xét đánh giá góp ý đồ án em Đà Nẵng, ngày 26 tháng năm 2017 Đặng Thị Thúy An i CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết tính tốn đồ án tốt nghiệp trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực đồ án cảm ơn thông tin trích dẫn đồ án rõ nguồn gốc rõ ràng phép công bố Đà Nẵng, ngày … tháng … năm 2017 Sinh viên thực Đặng Thị Thúy An ii MỤC LỤC Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời cảm ơn i Lời cam đoan liêm học thuật Mục lục Danh sách bảng biểu, hình vẽ ii iii v CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phân loại phân bố chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch) 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Vị trí phân bố 1.2 Đặc điểm thực vật 1.2.1 Đặc điểm thực vật họ Nho (Vitaceae) 1.2.2 Đặc điểm chi Ampelopsis số loài thuộc chi Ampelopsis 1.2.3 Đặc điểm thực vật chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch) 1.3 Những nghiên cứu thành phần hóa học 1.3.1 Những nghiên cứu thành phần hóa học có chi Ampelopsis .4 1.3.2 Những nghiên cứu hợp chất hay gặp chi Ampelopsis 1.3.3 Những nghiên cứu hợp chất loài Ampelopsis cantoniensis 1.3.4 Những nghiên cứu myricetin .7 1.3.5 Những nghiên cứu dihydromyricetin 1.4 Những nghiên cứu tác dụng sinh học chi Ampelopsis loài A.cantoniensis 1.4.1 Theo kinh nghiệm dân gian 1.4.2 Theo y học đại 1.5 Kỹ thuật sắc ký sử dụng cô lập hợp chất hữu [2] 1.5.1 Các loại pha tĩnh sử dụng sắc ký .11 1.5.2 Sắc kí cột hở cổ điển 13 1.5.3 Sắc ký lớp mỏng 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Nguyên liệu hóa chất .17 2.1.2 Dụng cụ thiết bị .17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 iii 2.2.1 Nghiên cứu khả chiết tách chè dây nồng độ cồn khác 17 2.2.2 Chiết thu phân đoạn chè dây qua dung mơi có độ phân cực khác 18 2.2.3 Định tính flavonoid tổng thơ cao cồn phương pháp hóa học SKLM với mỏng silica gel 60 F254 (MERCK) 19 2.2.4 Phân lập chất chè dây sắc kí cột với chất nhồi silicagel 60 .20 2.2.5 Thử hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập phương pháp bắt gốc tự DPPH .21 2.3 Phương pháp xử lí số liệu 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Kết nghiên cứu khả chiết tách chè dây nồng độ cồn khác 23 3.2 Kết chiết thu phân đoạn chè dây qua dung mơi có độ phân cực khác .23 3.3 Định tính flavonoid tổng thơ cao cồn tổng số phương pháp hóa học SKLM với mỏng silica gel 60 F254 (MERCK) .24 3.3.1 Bằng phương pháp hóa học 24 3.3.2 Bằng sắc ký lớp mỏng 25 3.4 Phân lập chất chè dây sắc kí cột với chất nhồi silicagel 60 26 3.5 Thử hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập phương pháp bắt gốc tự DPPH .30 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 4.1 Kết luận 33 4.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học số lồi thuộc chi Ampelopsis Bảng 1.2 Phân loại sắc ký theo chất tượng xảy trình tách chất .10 Bảng 1.3 Các cấu hình sắc ký khác 11 Bảng 1.4 Các loại gel thường hay sử dụng 13 Bảng 2.1 Cách pha mẫu thử dung dịch acid ascorbic .22 Bảng 2.2 Trộn mẫu với dung dịch DPPH 22 Bảng 3.1 Khối lượng cao chè dây nồng độ cồn 23 Bảng 3.2 Khối lượng cao chiết phân đoạn chè dây .23 Bảng 3.3 Kết định tính flavonoid 24 Bảng 3.4 Vị trí màu sắc vết sắc ký lớp mỏng .26 Bảng 3.5 Các công đoạn thu gộp 27 Bảng 3.6 Kết đo OD517nm mẫu thử vitamin C 31 Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính kháng oxy hóa cao chè dây, hợp chất 31 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây chè dây – A.cantoniensis (huyện Đơng Giang, tỉnh Quảng Nam) Hình 1.2 Chè dây khơ Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo myricetin .7 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo dihydromyricetin Hình 1.5 Bề mặt silicagel 11 Hình 1.6 Tạo liên kết hydro chất tan silicagel 12 Hình 1.7 Sắc ký cột cổ điển 14 Hình 1.8 Bình sắc ký lớp mỏng .15 Hình 1.9 Sự dịch chuyển hợp chất sắc ký lớp mỏng 15 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết thu phân đoạn qua dung mơi có độ phân cực khác .19 Hình 3.1 Cao chiết etyl actate 24 Hình 3.2 Cao chiết hexan 24 Hình 3.3 Định tính sắc ký lớp mỏng với thuốc thứ 25 Hình 3.4 Các bình penicilin thu nhận 26 Hình 3.5 Chất kết tinh thu từ CD2  CD5 27 Hình 3.6 Vị trí CD4RT/H20 sắc ký lớp mỏng soi đèn UV 254nm nhuộm màu thuốc thử Vanilla 28 Hình 3.7 Vị trí CD4RT/H20 so voi CD4RT/Et 28 Hình 3.8 Kết chất chuẩn Myricetin thực HPLC 29 Hình 3.9 Kết mẫu thử thực HPLC 30 Hình 3.10 Khả bắt gốc tự nồng độ khác mẫu cao chè dây hợp chất CD1 32 vi DANH SÁCH CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT SKLM: Sắc ký lớp mỏng DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl SC: scavenging activity HPLC: High – performance liquid chromatography UV-VIS: Ultraviolet- visible CD : Công đoạn DL: Dược liệu DC: Dược cao vii Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu khả chiết tách chè dây nồng độ cồn khác Các mẫu chè nồng độ cồn: 96, 70, 50, 25 thu khối lượng cao chè sau: Bảng 3.1 Khối lượng cao chè dây nồng độ cồn Dung môi mDL (g) mDC1 (g) nDC2 (g) mDC3 (g) mTB (g) %tách chiết Cồn 25 30,00 9,01 9,25 8,75 9,01 30,03% Cồn 50 30,00 11,16 11,34 10,85 11,12 37,06% Cồn70 30,00 14,88 14,54 15,01 14.81 49,37% Cồn 96 30,00 16,62 16,48 16,35 16,48 54.93% 0 o Tại nồng độ cồn 960 thu khối lượng cao chè nhiều 16,48g Khối lượng cao thu nồng độ cồn 700 thấp không nhiều so với khối lượng ethanol 960 Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng nồng độ cồn 700 với mục đích thu hợp chất tan cồn hợp chất tan nước, bên cạnh đó, vừa đảm bảo tính kinh tế giảm nguy cháy nổ 3.2 Kết chiết thu phân đoạn chè dây qua dung mơi có độ phân cực khác Mẫu chè dây ngâm chiết qua dung môi có độ phân cực khác thu khối lượng bảng sau: Bảng 3.2 Khối lượng cao chiết phân đoạn chè dây Bột khô Cao cồn Cao hexan Cao etyl ecatae Khối lương (g) 1000 155,77 26,32 40,21 Phần trăm tách chiết (%) - 15,58% 2,63% 4,02% Cao mẫu thô ban đầu chứa hầu hết hợp chất hữu từ phân cực đến khơng phân cực khó lập riêng hợp chất tinh khiết Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng áp dụng để phân chia cao cồn thô ban đầu thành phân đoạn có tính phân cực khác 23 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam Hình 3.1 Cao chiết etyl acetate Hình 3.2 Cao chiết hexan Các hợp chất có tính khơng phân cực cỏ ( triglyceris, alcol béo, ester béo, dầu…) tan dung môi không phân cực, nhiên chúng hịa tan dung mơi phân cực, sử dụng ethanol để chiết hợp chất có chiết ln chất béo nên cần phải sử dụng dung môi không phân cực n-hexan để loại bỏ chúng khỏi hỗn hợp mẫu trước thực việc chiết dung môi khác chúng thường làm cản trở trình tinh chế hợp chất cần khảo sát [2] Khối lượng hợp chất không phân cực cao hexan tương đối thấp chiếm tỉ lệ 2,643% 1kg chè khô Dung mơi etyl acetate dung mơi có độ phân cực tương đối mạnh chất chứa nhóm chức ete –O- , aldehyd –CH=O, nhóm –OH, - COOH… Dung mơi etyl acetate hòa tan hợp chất cần khảo sát, loại bỏ nhóm chất cịn sót lại q trình chiết n-hexan, tạo điều kiện thuận lợi cho trình tách chiết hợp chất Số lượng hợp chất phân cực tan etylacetate lớn thu chiếm tỷ lệ 4,02% 1kg chè dây khô 3.3 Định tính flavonoid tổng thơ cao cồn tổng số phương pháp hóa học SKLM với mỏng silica gel 60 F254 (MERCK) 3.3.1 Bằng phương pháp hóa học Để nhận biết có mặt flavonoid cao cồn tổng số chè dây, số phản ứng hóa học định tính đặc thực ống nghiệm Bảng 3.3 Kết định tính flavonoid Phản ứng Kết Ghi Cyanidin Đỏ nâu/ đỏ hồng Đun nóng NaOH 10% Vàng cam  vàng lục - Hơi NH3 Vàng cam Hơ giấy lọc FeCl3 1% Kết tủa xanh đen - 24 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam Từ kết bảng 3.3 cho thấy mẫu cao cồn tổng số có mặt hợp chất flavonoid, với nhóm flavon, flavanon, flavonol… nhận biết hiển thị màu phản ứng cyanidin Phản ứng cho màu vàng sáng với amoniac khẳng định tồn nhóm flavol flavanol… Trong phản ứng NaOH 10%, dung dịch có màu vàng cam chứng tỏ có mặt flavanol Những hợp chất đóng vai trị quan trọng tính chất chống viêm loét dày chè dây 3.3.2 Bằng sắc ký lớp mỏng Các hợp chất flavonoid bắt màu thuốc thử tùy thuộc vào số lượng, vị trí nhóm -OH cấu tạo dị vịng Nhóm flavonol có nhóm –OH liền kề tác dụng với thuốc thử AlCl3 1% tạo phức chất có màu vàng đặc trưng Dung dịch thuốc thử acid oxalic 10% - boric 10% NH3 nhận biết nhóm flavon, flavonol với màu vàng sáng màu vàng sậm Kết định tính nhóm chất có cao cồn tổng số ghi bảng 3.4 Hình 3.3 Định tính sắc ký lớp mỏng với thuốc thứ a) Thuốc thứ AlCl3 3% b) Dung dịch acid oxalic 10% - boric 10% c) Hơi NH3 Từ kết định tính sắc ký lớp mỏng cho thấy vị trí hợp chất cao chè dây diện thuốc thử Dựa vào vị trí, độ lớn độ đậm nhạt vết đưa đánh giá sơ hợp chất có mẫu 25 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam Bảng 3.4 Vị trí màu sắc vết sắc ký lớp mỏng 14 + Vàng nhạt Dung dịch acid boric oxalic Vàng 45 ++ Vàng nâu Vàng Vàng 55 +++ Vàng nâu đậm Vàng cam Vàng cam Vết Rf (x100) Độ đậm Hơi NH3 AlCl3 3% Vàng Trong vết sắc ký lớp mỏng có vết (Rf : 0,55) chất có tính phân cực vết, màu sậm thuộc nhóm flavonol; sau vết số (Rf : 0,45) có vết lớn nhất, màu nhạt phân cực so vết Tuy nhiên hệ dung môi khai triển chọn, vết vết có khoảng cách gần nên trình tách cột, chất rời khỏi cột lúc 3.4 Phân lập chất chè dây sắc kí cột với chất nhồi silicagel 60 Tổng số bình penicillin hứng 131 bình Gộp bình có chung vết, thu bảng 3.5: Hình 3.4 Các bình penicilin thu nhận Các bình penicillin sau thu nhận để bay qua đêm để tránh dung dịch chấm lỗng khơng nhìn thấy vết chấm mỏng Tiến hành chấm sắc ký mỏng để theo dõi trình phân tách, nhận định phân đoạn chứa hay nhiều chất dựa sở để gộp bình hứng có vết giống tạo thành phân đoạn Cần phải dung môi bay hơi, nồng độ hợp chất dung dịch tăng lên Nồng độ dung dịch hợp chất đạt tới dung dịch q bão hóa xảy q trình kết tinh 26 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam Bảng 3.5 Các công đoạn thu gộp Tên công đoạn Thứ tự bình Vết màu SKLM CD1 111 vết CD2 1224 vết CD3 25 35 vết CD4 36 79 vết CD5 80  103 vết CD6 103 131 vết Hệ dung môi Ghi Không xuất chất kết tinh, dung dịch có màu xanh Dung dịch màu vàng nâu Toluen : Etyl actate : Có chất kết tinh Acid fomic Dung dịch màu vàng đậm = : :1 Có chất kết tinh Dung dịch màu vàng Có chất kết tinh dần Toluen : Etyl actate : Dung dịch màu vàng Kết Acid fomic tinh xuất = : : 1,5 Toluen : Etyl actate : Dung dịch màu vàng nhạt Acid fomic Khơng có kết tinh xuất =5:6:2 Dựa vào bảng 3.5 tiếp tục gộp CD2, CD3 CD4 thành phân đoạn gọi CD4RT/Et chất kết tinh CD4RT/H20 có màu vàng sau kết tinh lại nhiều lần, kết trình bày hình 3.7 Hình 3.5 Chất kết tinh thu từ CD2  CD5 27 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam Hình 3.6 Vị trí CD4RT/H20 sắc ký lớp mỏng soi đèn UV 254nm nhuộm màu thuốc thử Vanilla với hệ dung môi triển khai toluen: etylacetate: acid fomic = 5:6:1 Chất kết tinh tan methanol, không tan ethylacetate Chất kết tinh hoà tan methanol chấm lên bảng mỏng để kiểm tra độ tinh Từ sắc ký mỏng, chất kết tinh tương đối tinh sạch, vết trịn, rõ, có Rf =0,55 Tuy nhiên cịn lẫn chất bẩn tạo vết mờ, phát soi đèn UV với bước sóng  = 254nm Hình 3.7 Vị trí CD4RT/H20 so với CD4RT/Et sắc kí lớp mỏng 1/ CD4RT/H20 2/ CD4RT/Et 3/ Cao tổng Để kiểm tra độ tinh khiết định danh chất, chất kết tinh CD 4RT/H20 đem phân tích HPLC với chất chuẩn myricetin Kết cụ thể trình bày hình 3.9 28 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam Hình 3.8 Kết chất chuẩn Myricetin thực HPLC Phát chất chuẩn mẫu thí nghiệm bước sóng: 254, 290 350 nm Chất chuẩn Myricetin có thời gian lưu xuất retention time: 12.246 29 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam Hình 3.9 Kết mẫu thử thực HPLC Mẫu thí nghiệm có peak lớn với RT 11.003 12.271 Trong đó, peak thứ myricetin Nhưng mẫu bị lẫn chất khác với RT = 11.003 Kết luận: Từ kết hình 3.8 ta thấy Hợp chất dạng kết tinh, màu vàng CD4RT/H20, có Rf =0,55 kết luận myricetin 3.5 Thử hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập phương pháp bắt gốc tự DPPH Tính chống oxy hóa chè dây hoạt tính hợp chất polyphenol Để khảo sát hoạt tính mạnh yếu polyphenol chất kết tinh thu có chè dây phương pháp bắt gốc tự DPPH với chất chuẩn vitamin C 30 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam Kết đo OD 517nm kết thử hoạt tính chống oxy hóa cao chè dây tổng số chất kết tinh Bảng 3.6 Kết đo OD517nm mẫu thử vitamin C OD517nm Nồng độ Control Mẫu 10 µM/ml 25 µM/ml 50 µM/ml 100 µM/ml Vitamin C 0,5113 0,272 0,1518 0,013 0,5217 Cao chè 0,4978 0,2591 0,1011 0,017 0,5225 Hợp chất CD1 0,4793 0,2842 0,1134 0,039 0,5203 (nm) Control trung bình 0,5215 Các mẫu đo lặp lại hai lần, riêng mẫu control lặp lại lần, kết giá trị trung bình sau lần đo lặp lại Độ hấp thụ DPPH giảm từ 0,5215 xuống 0,013 cho trường hợp chất chuẩn vitamin C; cho cao chè 0,017 cho hợp chất CD1 0,039 Điều chứng tỏ chè dây có số hợp chất chống oxy hóa điển hình chất hợp chất CD phân lập từ cao chè có khả chống oxy hóa tác dụng với DPPH làm giảm độ hấp thụ Cơ chế phản ứng gốc tự chất chống oxy hóa: DPPH + AH  DPPH-H +A Từ kết đo OD 517nm, tính số SC50 mẫu cao chè, chất kết tinh vitamin C Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính kháng oxy hóa cao chè dây, hợp chất SC% Nồng độ Mẫu cao 10 µM/ml Vitamin C 1,95 47,84 70,89 97,59 29,91 Cao chè 4,55 50,31 80,63 96,68 27,45 Hợp chất CD1 8,09 45,5 78,24 92,49 28,45 25 µM/ml 50 µM/ml 100 µM/ml SC50 µM/ml Dựa vào kết bảng 3.7, ta vẽ đồ thị hình 3.10 31 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam % chống oxy mẫu 120 SC% 100 80 Vitamin C 60 Cao chè Hợp chất CD 40 20 0 20 40 60 80 100 120 µM/ml Hình 3.10 Khả bắt gốc tự nồng độ khác mẫu cao chè dây hợp chất CD1 Từ bảng 3.6 xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính đơn giản thể mối tương quan tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự DPPH nồng độ cao chiết, vitamin C, hợp chất CD1 xây dựng dựa vào phần mềm thống kê SPSS 16.0 với Pvalue phương trình tham số ≤ 0,05 (với độ tin cậy 95%) Các phương trình hồi quy xác định: - Vitamin C: 𝑦 = −89,474 + 41,041ln (𝑋) - Chè Đông Giang: 𝑦 = −84,869 + 40,719ln (𝑋) - Hợp chất CD1: 𝑦 = −76,647 + 37,818ln (𝑋) Với phương trình hồi quy trên, giá trị SC50 hoạt tính bắt gốc tự DPPH mẫu xác định Kết thu cho thấy, chè Đông Giang hợp chất CD1 có hoạt tính chống oxy hóa mạnh với giá trị SC50 tương ứng 27,21 µM/ml 28,45 µM/ml thơng qua so sánh với chất chuẩn vitamin C 29,91 µM/ml SC50 giá trị nồng độ mẫu mà bắt 50% gốc tự do, giá trị SC50 thấp chứng tỏ mẫu có hoạt tính mạnh Cao chè dây Đơng Giang hợp chất CD1 có khả chống oxy hóa lớn vitamin C Dựa vào giá trị SC50 , khả chống oxy cao chiết chè mạnh hợp chất CD1 có mặt nhiều hợp chất phenol hợp chất chống oxy hóa khác 32 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài “Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy chúng từ cao chè dây Quảng Nam”, tiến hành khảo sát chiết cao chè nồng độ cồn, tách chiết hợp chất hóa học từ cao etyl acetate sắc ký cột cổ điển thử hoạt tính chống oxy chất kết tinh thu Dựa vào kết rút số kết luận sau: 1/ Khối lượng cao thu cao nồng độ cồn 96 Khối lượng cao nồng độ cồn 70 cho khối lượng xấp xỉ, chênh lệch khơng nhiều Có thể tiến hành tách chiết cao ethanol 70 với ưu điểm lợi mặt kinh tế, thu nhận hợp chất tan nước 2/ Thơng qua định tính, xác định có mặt nhóm flavonoid chè dây xác định sơ tính chất mẫu chè dây để chuẩn bị cho việc sắc ký cột tinh 3/ Sau trình sắc ký cột, thu nhận chất kết tinh xác định phương pháp HPLC với chất chuẩn myricetin, chất kết tinh màu vàng xanh, có Rf =0,55 sắc ký lớp mỏng myricetin 4/ Thử hoạt tính chống oxy chất kết tinh thu được, kết luận chất kết tinh có khả chống oxy hóa mạnh 4.2 Kiến nghị Vì thời gian nghiên cứu tơi có hạn, đề tài nghiên cứu thêm, kiến nghị hướng nghiên cứu thêm: 1/ Định lượng nhóm hợp chất cụ thể 2/ Khảo sát hệ dung môi tối ưu để tiến hành tách myricetin chất tạp lẫn 3/ Tiến hành thêm lần sắc ký cột để tách myricetin chất lẫn tạp mẫu chất kết tinh 4/ Đánh giá khả chống oxy hóa lực khử cao thân, rễ chè dây 5/ Thử khả ức chế tế bào ung thư hợp chất chuột 33 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam PHỤ LỤC Hình Chất nhồi silicagel 60 F254(0,04-0,063µm Hình Sắc ký lớp mỏng silicagel 60 F254 Hình Đèn UV soi sắc ký mỏng WFH-203B 34 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1] Phạm Thanh Kỳ, Nghiên cứu quy trình sản xuất thuốc AMPELOP từ chè Dây (Ampelopsis cantoniensis Planch, Vitaceae) để điều trị loét dày, hành tá tràng tiếp tục đánh giá tác dụng lâm sàng thuốc, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học, 2001 [2] Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, trường Đại học Khoa học Tự nhiên NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, năm 2007 [3] Vương Thị Hồng Vân (2002), Nghiên chè Dây Sa Pa (Ampelopsis cantoniensis, Vitaceae), Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội [4] Phùng Thị Vinh (1995), Nghiên thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học chè dây Ampelopsis cantoniensis Planch Luận án Phó Tiến sĩ, Khoa Y Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội [5] Phạm Thanh Kỳ (1995) , Nghiên cứu chè dây làm thuốc điều trị bệnh loét dày – hành tá tràng, Bộ Y tế, trường Đại học Dược Hà Nội [6] Nguyễn Khánh Trạch, Mai Minh Huệ, Nguyễn Trường Sơn (2001), báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Bộ, “Nghiên cứu qui trình sản xuất thuốc AMPELOP từ chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch, Vitaceae) điều trị loét dày – hành tá tràng tiếp tục đánh giá lâm sàng thuốc”, chủ nhiệm đề tài : GS.TS Phạm Thanh Kỳ [7] Phạm Thanh Kỳ, Phùng Thị Vinh, Nông Hữu Đức, Nguyễn Duy Khang (1993), Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn flavonoid chè dây số vi khuẩn, Tạp chí Dược học,(6), trang 14-15 [8] Vũ Nam (1995), Nghiên cứu tác dụng chè dây viêm loét hành tá tràng, Luận án Phó Tiến sĩ Y học khoa học, trường Đại học Y Hà Nội [9] Nguyễn Quốc Tuấn (2012), Xây dựng phương pháp định tính định lượng flavonoid nụ vối, Luận văn Thạc sĩ, trường Đại học Khoa học Tự nhiên [10] Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Mai Hữu Phương, Khả bắt gốc tự DPPH lực khử nam sâm bò Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh, Tạp chí khoa học- Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh, số 12(90), năm 2016, trang 112- 122 Tài liệu tham khảo tiếng Anh 35 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam [11]Akira INADA, Yachiyo NAKAMURA, Mari KONISHI, Hiroko MURATA, Fusako KITAMURA, Harumasa TOYA, Tsutomo NAKANISHI (1991), A new ionone glucoside and a new phenyl – propanoid rhamnosid from sterms of Ampelopsis brevipedunculata (Maxim) Trautv, Chemical and Pharm, Bulletin Vol 39(9), trang 2437 - 2439 [12] Oshima Y, Ueno Y (1990) Ampelopsin A, B, C new oligostilbenes of Ampelopsis brevipedunculata, Tetrahedron 46(15) 2141 [13] Yoshitama K., Ishicura N., Effect of authocyanin, flavonol copigmentation and pH on the color of the berries of Ampelopsis brevipedunculata, Journal of plant physiology 1395(5), trang 513 [14] Xu, Zhihong, Zhang, Yan (2000) , Analysis and evaluation of nutritional component and flavone of Ampelopsis cantoniensis Planch leaf, Academic of Agiricultural Science, 21(12), trang 113-114 [15] Lai, Li, Zhang (1995), New extraction method of Ampelopsin Marter, Med 7(1), trang 88-89 [16] Qizhen Du, Ping Chen, Gerold Jerz, Peter Winterhalter, Preparative separation of flavonoid glycosides in leaves extract of Ampelopsis grossedentata using high-speed counter – current chromatography, Journal of Chromatography, 2013 [17] Zhang Xiuqiao, Shen Wei, Chen Shuhe, Liu Yanwen, Study the chemical constituents from Ampelopsis megalophylla, Đại học Y học cổ truyền Hồ Bắc, Vũ Hán, 2004 [18] Xu Z, Liu X, Xu G, Chemical constituents of roots of Ampelopsis brepedunculata (Maxim) Trautv, Journal of Chinese Medicinal Material, 8/1995, Số 20 (8), trang 484 – 486 [19] Chen Zuanguang, Wang Meixing, Cai Peixiang, Chen Xiaojun , Determination of Ampelopsin and Myricetin in Ampelopsis cantoniensis, Journal of Chinese Medicinal Material, 1997 [20] Do Thi Ha, Phuong Thien Thuong, Nguyen Duy Thuan, Protective action of Ampelopsis cantonniensis and its major constituent myricetin against LDL oxidation, Vietnam Journal of Chemistry, Vol 45(6)/2007, trang 768-771 [21] Tae Kyung Hyun, Seung Hee Eom, Chang Yeon Yu, Thomas Roitsch, Hovenia dulcis – An Asian Traditional Herb, Planta Medical, 2010, 76(10), trang 943949 [22] Shihui Chan, Xiaolan Zhao, Jing Wang cộng Dihydromyricetin improves glucose and lipid metabolism and exert anti-inflammatory effects in 36 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam nonalcoholic fatty liver disease: A randomized controlled trial, Pharmacological Research, Vol 99, 2015, trang 74-81 [23] Jiang Zhenyi (1989), Chemical constituents from the roof of Ampelopsis brevipedunculata var henci, Structure of crystal II – Academic Journal of the second military Medical College 10(6) 535 [24]Shen Y, Lindemeyer AK, Gonzalez C, Shao XM, Spigelman I, Olsen RW, Liang J, Dihydromyricetin as a novel anti-alcohol intoxication medication, Journal Neurosci, 2012, Vol 32(1), trang 309-401 [25]Luo GQ, Zeng S, Liu DY, Inhibitory effects of ampelopsin on angiogenesis, Journal of Chinese Medicinal Material, 2006, Vol 29(2), trang 146-150 37 SVTH: Đặng Thị Thúy An GVHD :TS Đặng Đức Long GVHD :NCS Nguyễn Thị Xuân Thu ... hành nghiên cứu đề tài : ? ?Nghiên cứu tách chiết thành phần hóa học khả chống oxy hóa hợp chất từ cao chè dây Quảng Nam? ?? với nội dung sau: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cồn chiết đến khả tách chiết cao. .. Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu khả chiết tách chè dây nồng độ cồn khác Các mẫu chè. .. Thu Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa học khả chống oxy hóa chúng từ cao chè dây Quảng Nam CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài ? ?Nghiên cứu tách chiết hợp chất hóa