Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất phenolics và khả năng chống oxy hóa từ rễ cây an xoa (helicteres hirsuta lour )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TỐI ƯU HĨA ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SÓNG CHO HỢP CHẤT PHENOLICS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG ƠXY-HĨA TỪ RỄ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trang Sĩ Trung TS Nguyễn Văn Tặng Sinh viên thực : Phạm Thị Quí Mã số sinh viên : 56136364 Khánh Hòa - 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SĨNG CHO HỢP CHẤT PHENOLICS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG ƠXY-HĨA TỪ RỄ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) GVHD: PGS TS Trang Sĩ Trung TS Nguyễn Văn Tặng SVTH: Phạm Thị Quí MSSV: 56136364 Khánh Hòa, tháng 7/2018 i LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan kết đề tài “Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất phenolics khả chống ơxy-hóa từ rễ An xoa” cơng trình nghiên cứu em thực chưa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Mọi giúp đỡ cho việc thực đồ án cảm ơn thơng tin trích dẫn đồ án ghi rõ nguồn gốc Nha Trang, ngày…tháng…năm 2018 Sinh viên thực Phạm Thị Quí ii LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy cô giáo Khoa Công nghệ Thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, trang bị vốn kiến thức quý báu cho em suốt khóa học Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Nguyễn Văn Tặng thầy PGS.TS Trang Sĩ Trung trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em kiến thức quý báu tận tình giúp đỡ để em hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn q thầy thuộc Trung tâm thí nghiệm Thực hành tạo điều kiện tốt cho em q trình hồn thành đồ án Cuối cùng, em gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè động viên, tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực đề tài Nha Trang, ngày…tháng…năm 2018 Sinh viên thực Phạm Thị Q iii TĨM TẮT Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) biết đến loại thuốc chữa ung nhọt, dịu đau, tiêu độc, khắc chế bệnh gan viêm gan, ung thư gan,…Trong Y học cổ truyền [1] gần có nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng dược lý Nghiên cứu thiết kế để tối ưu hóa thơng số chiết phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng (MAE) để thu hàm lượng phenolics tổng số (TPC), hiệu suất trích ly phenolics (PEE), hàm lượng saponins (SC) khả quét gốc tự DPPH cao (DRSC) từ rễ An xoa phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Một thiết kế Box-Behnken cho yếu tố thực thông qua việc bố trí 27 thí nghiệm để làm rõ ảnh hưởng cơng suất vi sóng (X1), thời gian chiếu xạ (X2), thời gian chiết (X3), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (X4) TPC, PEE, SC, DRSC Kết xây dựng phương trình mơ tả ảnh hưởng thông số MAE đến hàm mục tiêu hàm lượng phenolics tổng số (YTPC) khả quét gốc tự DPPH (YDRSC) từ rễ An xoa sau: YTPC = 15.927 – 0.244X1 + 0.93X2 + 0.178X3 + 0.869X4 - 0.16X1X2 -0.318X1X3 – 0.243X2X3 + 0.33X1X4 + 0.358X2X4 – 0.095X3X4 – 2.306X12 – 2.2 X22 – 0.872X32 – 2.503X42 YDRSC = 128.463 – 0.054X1 + 0.895X2 + 4.084X3 + 13.615X4 – 1.988X1X2 – 10.488X1X3 + 1.198X2X3 + 0.528X1X4 + 5.14X2X4 – 4.398X3X4 – 16.924X12 – 23.69X22 – 16.182X32 – 23.448X42 Kết nghiên cứu đưa thông số MAE tối ưu để đạt TPC, PEE, SC cao khả chống ơxy hóa tốt cơng suất vi sóng 800W, thời gian chiếu xạ 16 giây/phút, thời gian chiết 16 phút tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 32 mL/g mẫu Tại thông số MAE tối ưu này, giá trị thực nghiệm TPC, PEE, SC, DRSC rễ An xoa 18.32 mg GAE/g mẫu, 85%, 21.09 mg EE/g mẫu 146.82 mg DPPH/g mẫu Những kết thực nghiệm cao so với giá trị dự đốn từ mơ hình (16.1 mg GAE/g mẫu, 74.7%, 15.41 mg EE/g mẫu 129.73 mg DPPH/g mẫu), điều chứng tỏ mơ hình tối ưu tương thích tốt với thực nghiệm Như vậy, thông số MAE tối ưu 800W, 16 giây/phút, 16 phút 32 mL/g mẫu chọn để tối ưu hóa cho hợp chất phenolics khả quét gốc tự DPPH từ rễ An xoa cho nghiên cứu ứng dụng iv MỤC LỤC Đề mục Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Danh mục từ viết tắt vii Danh mục hình viii Danh mục bảng x LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu An xoa 1.1.1 Đặc điểm phân bố sinh thái An xoa 1.1.2 Thành phần hóa học An xoa 1.1.3 Công dụng An xoa 1.1.4 Một số thuốc dân gian An xoa [42] 1.2 Giới thiệu hoạt chất sinh học 1.2.1 Hợp chất phenolics [27] 1.2.2 Hợp chất saponins [34] 11 1.3 Q trình ơxy-hóa chống ơxy-hóa 12 1.3.1 Q trình ơxy-hóa 12 1.3.2 Chất chống ơxy-hóa 15 1.3.3 Một số phương pháp phân tích đánh giá hoạt tính chống ơxy-hóa 16 1.4 Các phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học 19 1.4.1 Phương pháp truyền thống 19 1.4.2 Phương pháp đại 22 v 1.5 Phương pháp tối ưu hóa q trình trích ly 26 CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Đối tượng nghiên cứu, thiết bị dụng cụ hóa chất phân tích 29 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 29 2.1.3 Hóa chất phân tích 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 30 2.2.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết 30 2.3 Phương pháp xử lí số liệu 36 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Độ ẩm dư nguyên liệu 37 3.2 Ảnh hưởng thơng số trích ly hỗ trợ vi sóng đến hàm lượng phenolics tổng số, hiệu suất thu hồi phenolics, hàm lượng saponins khả quét gốc tự DPPH dịch chiết từ rễ An xoa 37 3.2.1 Hàm lượng phenolics tổng số (TPC) 41 3.2.2 Hiệu suất trích ly phenolics (PEE) 46 3.2.3 Hàm lượng saponins (SC) 49 3.2.4 Khả quét gốc tự DPPH dịch chiết từ rễ An xoa (DRSC) 52 3.3 Kiểm chứng phù hợp mơ hình so với thực nghiệm 56 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 57 4.1 Kết luận 57 4.2 Đề xuất ý kiến 58 Tài liệu tham khảo 59 Phụ lục 65 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PAL: Phenylalanine ammonia lyase UV: Ultraviolet MAE: Microwave-assisted extraction UAE Ultrasound-assisted extraction SFE Supercritical fluid extraction RSM: Response surface methodology UV-Vis: Ultraviolet-visible spectroscopy 3D: Three-dimensional SD: Standard deviation TPC: Total phenolic content GAE: Gallic acid equivalent PEE: Phenolic extraction efficiency SC: Saponin content EE: Escin equivalent DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DRSC: DPPH radical-scavenging capacity vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây An xoa [nguồn: tác giả] Hình 1.2: Hoa An xoa [41] Hình 3: Cơng thức hóa học (±) ‐pinoresinol, (±) ‐medioresinol, (±) ‐ syringaresinol, (-) - boehmenan , (-) - boehmenan H (±) - trans ‐dihydrodiconiferyl alcohol [20] Hình 4: Cơng thức hóa học lupeol, stigmasterol, apigenin tiliroside [3] Hình 1.5: Các sản phẩm phenylalanin nhờ emzyme PAL xúc tác [27] 10 Hình 1.6: Các phenylpropanoid tạo thành từ phenylalanine tyrosine [27] 11 Hình 1.7: Sơ đồ tổng qt cho q trình ơxy-hóa chất béo có chứa acid khơng bão hòa (RH) hậu [28] 13 Hình 1.8: Tác động gốc tự lên tế bào [49] 14 Hình 9: Cơ chế hoạt động chất chống ơxy-hóa [44] 15 Hình 10: Sơ đồ phản ứng chất chống ơxy-hóa gốc tự DPPH [46] 17 Hình 11: Cơ chế khử Cu2+ thành Cu + chất chống ơxy-hóa [32] 18 Hình 1.12: Thiết bị Soxhlet [48] 21 Hình 1.13: Hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng [nguồn: tác giả] 22 Hình 1: Rễ An xoa xay [nguồn: tác giả] 29 Hình 2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 Hình 3: Sơ đồ q trình trích ly 31 Hình 1: Mơ hình bề mặt đáp ứng ảnh hưởng yếu tố công nghệ tới hàm lượng phenolics tổng số (TPC), hiệu suất trích ly phenolics (PEE), hàm lượng saponins (SC) khả quét gốc tự DPPH dịch chiết điều kiện tối ưu 40 Hình 2: Ảnh hưởng điều kiện trích ly khác đến hàm lượng phenolics Chữ khác cột khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 41 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Văn Chi Từ điển thuốc Việt Nam, tập (bộ mới): Nhà xuất Y học; 2013 trang 1011 p Nguyễn Mạnh Cường, Ninh Thế Sơn, Đồn Thị Vân, Nguyễn Cơng Thùy Trâm, Đỗ Thị Thảo, Phạm Quốc Sự, et al Chiết tách số chất thuộc nhóm phenolic từ dứa dại pandanus odoratissimus l F Tạp chí Hóa học 8/2015;53(4):432-5 Nguyễn Hữu Duyên, Lê Thanh Phước Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào HEP-G2 An Xoa (Helicteres hirsuta Lour) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2016;47a:93-7 Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Mai Hữu Phương Khả quét gốc tự dpph lực khử nam sâm bò cần giờ, hồ chí minh Tạp chí Khoa học ĐHSP TpHCM 2016;Số 12 (90) Phạm Thị Mỹ Hiền Nghiên cứu khả chống ơxy hóa dịch chiết rong mơ sargassum mcclurei in vitro ứng dụng để hạn chế ôxy hóa lipid thịt cá thu [Đồ án Tốt nghiệp Đại học] Khánh Hòa: Trường Đại học Nha Trang; 2014 Vũ Thị Minh Hiền, Nguyễn Thị Thanh Hà, NHQvcc Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan chống ôxy hóa cao lỏng An Xoa (Helicteres hirsuta Lour.) thực nghiệm Báo cáo đề tài NCKH cấp sở 2015-2016 2016 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Phân lập hợp chất phenolic từ số thực vật Việt Nam 2012 Nguyễn Thị Ngọc Hồi, Ngơ Thị Hồi Dương, Ngơ Đăng Nghĩa Tối ưu hóa q trình thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei) alcalase theo phương pháp mặt đáp ứng Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản 2013;Số 2/2013 Nguyễn Thúy Hương, Mai Thục Di Tối ưu hóa sinh tổng hợp lactase từ Aspergillus oryzae sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt- phương án cấu trúc Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 2013;Tập 29, Số 3:8-16 59 10 Nguyễn Thị Huyền, Phạm Thị Kim Quyên, Nguyễn Thế Hân Khả chống ôxy hóa in vitro dịch chiết ca cao (Theobroma cacao) thử nghiệm hạn chế ơxy hóa lipid thịt cá bớp Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt nam, 2017;tập 15, số 2:214-24 11 PGS.TS Từ minh Koong Kỹ thuật sản xuất dược phẩm Hà Nội: Nhà xuất Y học; 2007 12 Phạm Thành Lộc, Lê Ngọc Thạch Nghiên cứu sử dụng thiết bị soxhlet-vi sóng ly trích số hợp chất thiên nhiên Tạp chí phát triển KH & CN 2009;Tập 12, Số 07 13 Nguyễn Cơng Minh, Nguyễn Văn Ân Hóa sinh thực phẩm: Khánh Hòa Trường Đại học Nha Trang; 2012 14 Hồ Thị Ánh Như Nghiên cứu tách chiết khảo sát hoạt tính chống ơxy hóa dịch chiết từ hạt tiêu [Đồ án Tốt nghiệp Đại học] Khánh Hòa: Trường Đại Học Nha Trang; 2014 15 Trần Thị Oanh Tổng quan chiết xuất dược liệu Báo cáo chuyên đề:"Kỹ thuật chiết xuất dược liệu" 2015 16 Trần Văn Tiến, Võ Thị Mai Hương Nghiên cứu khả kháng khuẩn hoạt tính chống ơxy-hố dịch chiết an xoa (Helicteres hirsuta Lour.) Hội nghị Khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 2017:1496-501 17 Hoàng Thị Yến, Trịnh Thị Thùy Linh, Mai Chí Thành cộng Tối ưu hóa điều kiện tách chiết hợp chất polyphenol có tính chống ôxy-hóa cao từ sim (Rhodomyrtus tomentosa (ait.) hassk.) thu thập vùng đồi núi Chí Linh, Hải Dương Tạp chí sinh học 2015;37(4):509-19 18 Lê Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Nga, Tạ Văn Bình, Thái Thị Hoàng Oanh Nghiên cứu tác dụng chống viêm, giảm đau cao lỏng chiết từ An Xoa (Helicteres hirsuta Lour.) chuột nhắt thực nghiệm Tạp chí Dược học 8/2017;Số 496 năm 57:56-9 19 Lê Thị Hải Yến cộng Sơ nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng ức chế số dòng tế bào ung thư An Xoa (Helicteres hirsuta Loureiro) Báo cáo đề tài NCKH cấp sở 2015-2016 2016 60 Tiếng Anh 20 Chin YW, Jones WP, Rachman I, Riswan S, Kardono LB, Chai HB, et al Cytotoxic lignans from the stems of Helicteres hirsuta collected in Indonesia Phytotherapy research : PTR 2006;20(1):62-5 21 Bhuyan DJ, Van Vuong Q, Chalmers AC, van Altena IA, Bowyer MC, Scarlett CJ Microwave-assisted extraction of Eucalyptus robusta leaf for the optimal yield of total phenolic compounds Industrial Crops and Products 2015;69:290-9 22 Bouras M, Chadni M, Barba FJ, Grimi N, Bals O, Vorobiev E Optimization of microwave-assisted extraction of polyphenols from Quercus bark Industrial Crops and Products 2015;77:590-601 23 Carlos L Céspedes, Diego A Sampietro, David S Seigler, Mahendra Rai Natural Antioxidants and Biocides from Wild Medicinal Plants: CAB International; 2013 24 Chew KK, Khoo MZ, Ng SY, Thoo YY, Aida, Wan W M Effect of ethanol concentration, extraction time and extraction temperature on the recovery of phenolic compounds and antioxidant capacity of Orthosiphon stamineus extracts International Food Research Journal 2011;18(4):1427-35 25 Dahmoune F, Nayak B, Moussi K, Remini H, Madani K Optimization of microwave-assisted extraction of polyphenols from Myrtus communis L leaves Food chemistry 2015;166:585-95 26 Dent M, Verica D-U, Penić M, Brncic M, Bosiljkov T, Levaj B The Effect of Extraction Solvents, Temperature and Time on the Composition and Mass Fraction of Polyphenols in Dalmatian Wild Sage (Salvia officinalis L.) Extracts Food Technology Biotechnology 2013;51(1):81-94 27 Fereidoon Shahidi, Marian Naczk Phenolics in food and nutraceuticals Nhà xuất CRC2004a 28 Fereidoon Shahidi, Marian Naczk Phenolics in food and nutraceuticals Nhà xuất CRC 2004b:398-404 61 29 Hong Ngoc Thuy Pham, Van Tang Nguyen, Quan Van Vuong, Michael C Bowyer1, Christopher J Scarlett Bioactive Compound Yield and Antioxidant Capacity of Helicteres hirsuta Lour Stem as Affected by Various Solvents and Drying Methods Journal of Food Processing and Preservation 2016 30 Joachim Müller, Albert Heindl Chapter 17: Drying of medicinal plants © 2006 Springer Printed in the Netherland 2006:237-52 31 Kahl R, Kappus H Toxicology of the synthetic antioxidants BHA and BHT in comparison with the natural antioxidant vitamin E Zeitschrift fur LebensmittelUntersuchung und -Forschung 1993;196(4):329-38 32 Mustafa Ozyurek, Kubilay Guclu, Esma Tutem, Kevser Sozgen Basxkan, Erc¸ E A comprehensive review of CUPRAC methodology 2011 33 Pinelo M, Rubilar M, Jerez M, Sineiro J, Nunez M Effect of solvent, temperature, and solvent-to-solid ratio on the total phenolic content and antiradical activity of extracts from different components of grape pomace Journal of agricultural and food chemistry 2005;53:2111-7 34 Rensheng Xu, Yang Ye, Weimin Zhao Introduction to natural products chemistry: CRC; 2010 35 Tang NV, V VQ, C BM, A VAI, J SC Microwave-Assisted Extraction for Saponins and Antioxidant Capacity from Xao Tam Phan (Paramignya trimera) Root Journal of Food Processing and Preservation 2015;41(2):e12851 36 Van T Nguyen, Michael C Bowyer, Ian A van Altena, Christopher J Scarlet Optimisation of microwave-assisted extraction from Phyllanthus amarus for phenolic compounds-enriched extracts and antioxidant capacit 2016 37 Van Tang Nguyen, Hong Ngoc Thuy Pham, Quan Van Vuong, Michael C Bowyer and Christopher J Scarlett Effect of Extraction Solvents and Drying Methods on the Physicochemical and Antioxidant Properties of Helicteres hirsuta Lour Leaves Technologies 2015;3:285-301 38 Van Tang Nguyen, Michael C Bowyer a, Quan Van Vuonga, Ian A.Van Altenaa, Christopher J Scarlett Phytochemicals and antioxidant capacity of Xao tam 62 phan (Paramignya trimera) root as affected by various solvents and extraction methods 2015 39 Van Tang Nguyen, Hong Ngoc Thuy Pham, Michael C Bowyer, Ian A van Altena, Christopher J Scarlet Influence of solvents and novel extraction methods on bioactive compounds and antioxidant capacity of Phyllanthus amarus 2016:556-66 Website 40 Các mẫu bề mặt đáp ứng [Online] [27/6/2018] Available from: http://s8360dfeaf0507106.jimcontent.com/download/version/1350884985/module/682 1242386/name/bai15_m%E1%BA%ABu%20b%E1%BB%81%20m%E1%BA%B7t% 20%C4%91%C3%A1p%20%E1%BB%A9ng.pdf 41 Cây An xoa [Online] [25/06/2018] Available from: https://www.google.com.vn/search?biw=1366&bih=586&tbm=isch&sa=1&ei=o88vW 7OlAorb9QOuzqOgAg&q=c%C3%A2y+an+xoa&oq=c%C3%A2y+an+xoa&gs_l=im g.3 0i67k1j0l9.383807.383807.0.384626.1.1.0.0.0.0.170.170.0j1.1.0 1c.1.64.img .0.1.168 0.8xFMeSkc-BA#imgrc=Hp-N5Q78iXkV_M: 42 Cây an xoa có tác dụng gì? Cách dùng an xoa chữa bệnh gan [Online] [07/05/2018] Available from: http://namlimxanh.vn/cay-xoa-xoa-co-tac-dung-gicach-dung-cay-an-xoa-chua-benh-gan.html 43 Chapter 24 - The CUPRAC Methods of Antioxidant Measurement for Beverages [Online] 2014 [03/06/2018] Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124047389000246 44 Vũ Thị Hồng Chất chống ơxy hóa có nguồn gốc tự nhiên –Cơ chế tác dụng [Online] 2017 [27/6/2018] Available from: http://hoathucpham.saodo.edu.vn/nghiencuu-trao-doi/chat-chong-ôxy-hoa-co-nguon-goc-tu-nhien-co-che-tac-dung-53.html 45 Gốc tự – tác nhân gây bệnh tật lão hóa [Online] [27/6/2018] Available from: http://fnc.vn/goc-chuyen-nganh/goc-tu-tac-nhan-gay-ra-benh-tat-valao-hoa.html 46 Hydrôxycinnamic acid antioxidants: an electrochemical overview [Online] [27/6/2018] Available from: 63 https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC3730368_BMRI2013251754.sch.001&req=4 47 Phương pháp DPPH [Online] [03/06/2018] Available from: https://vdocuments.site/phuong-phap-dpph.html 48 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6238-6:2015-An toàn đồ chơi [Online] 2015 [27/6/2018] Available from: https://vanbanphapluat.co/tcvn-6238-6-2015-an-toan-dochoi-tre-em-este-phtalat-trong-do-choi-san-pham 49 Thực hư chất chống ơxy hóa phòng trị ung thư [Online] [27/6/2018] Available from: http://suckhoedoisong.vn/thuc-hu-ve-chat-chong-ôxy-hoa-trongphong-tri-ung-thu-n81550.html 50 Trung tâm liệu Thực vật Việt Nam [Online] [24/06/2018] Available from: http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Helicteres%20hirsuta&list=species 64 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Xác định hàm lượng ẩm dư Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay mẫu, sau dựa vào hiệu số khối lượng mẫu trước sau sấy ta xác định hàm lượng ẩm dư mẫu Dụng cụ, hóa chất: Tủ sấy, cân phân tích, cốc sấy, bỉnh hút ẩm có chứa Silicagen Tiến hành: Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc sấy rửa sạch, để nước, sấy nhiệt độ 100-1050C khoảng giờ, lấy làm nguội bình hút ẩm đem cân cân phân tích Sấy đến khối lượng không đổi (giữa lần cân sai số khơng q 5.10-4g) Cân xác g mẫu cho vào cốc sấy khô đến khối lượng không đổi, cho cốc sấy vào tủ sấy Tiến hành sấy 100-105 0C khoảng 10-12 Sau lấy để nguội bình hút ẩm khoảng 30 phút đem cân cân phân tích Tiếp tục sấy đến khối lượng khơng đổi Tính kết quả: Từ hao hụt khối lượng mẫu, ta xác định độ ẩm dư mẫu theo công thức sau: W (%) = 𝐺1−𝐺2 𝐺1−𝐺 ∗ 100 Trong đó: W (%): Hàm lượng ẩm (độ ẩm dư) G1 (g): Khối lượng cốc sấy mẫu trước sấy G2 (g): Khối lượng cốc sấy mẫu sau sấy G (g): Khối lượng cốc sấy Xây dựng đường chuẩn acid galic Cân xác 0.01 g acid gallic, cho vào cốc thủy tinh cho thêm 100ml nước cất, hòa tan hồn tồn gallic acid ta nồng độ dung dịch gallic acid vừa pha 100 µg/ml Sau tiến hành pha lỗng dung dịch vừa pha thành nồng độ khác (80 µg/ml, 60 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml) sau:  ml acid gallic 100 µg/ml + ml nước cất acid gallic 80 µg/ml  ml acid gallic 100 µg/ml + ml nước cất acid gallic 60 µg/ml  ml acid gallic 100 µg/ml + ml nước cất acid gallic 40 µg/ml  ml acid gallic 100 µg/ml + ml nước cất acid gallic 20 µg/ml Tiến hành tương tự xác định hàm lượng phenolics tổng số, khác ta thay dịch chiết rễ An xoa acid galic nổng độ khác Tiến hành đo máy đo quang phổ bước sóng 765 nm, ta thu đường chuẩn sau: Xây dựng đường chuẩn DPPH  Pha dung dịch DPPH gốc nồng độ 24000 µg/ml cách cân 0.003g pha 12.5 ml metanol  Pha dung dịch DPPH phản ứng: 2ml DPPH 24000 µg/ml + ml metanol DPPH 4363.64 µg/ml  ml DPPH 4363.64 µg/ml + ml metanol DPPH 2181.82 µg/ml  ml DPPH 2181.82 µg/ml + ml metanol DPPH 1090.91 µg/ml  ml DPPH 1090.91 µg/ml + ml metanol DPPH 545.45 µg/ml  ml DPPH 545.45 µg/ml + ml metanol DPPH 272.73 µg/ml  ml DPPH 272.73 µg/ml + ml metanol DPPH 136.36 µg/ml Dung dịch DPPH nồng độ đo 515 nm máy quang phổ UV-Vis, ta đường chuẩn DPPH sau: Xây dựng đường chuẩn escin Hòa tan 0.02 g escin (tương ứng với viên thuốc Aescin-một loại chế phẩm escin chứa 20mg escin/viên) 50 ml methanol 100%, lọc qua giấy lọc, ta dung dịch escin 400 (µg/ml) Tiếp tục pha loãng nồng độ khác sau:  ml dung dịch escin 400 (µg/ml) + ml methanol 100%  dung dịch escin 350 (µg/ml)  ml dung dịch escin 400 (µg/ml) + ml methanol 100%  dung dịch escin 300 (µg/ml)  ml dung dịch escin 400 (µg/ml) + ml methanol 100%  dung dịch escin 250 (µg/ml)  ml dung dịch escin 400 (µg/ml) + ml methanol 100%  dung dịch escin 200 (µg/ml)  ml dung dịch escin 400 (µg/ml) + ml methanol 100%  dung dịch escin 150 (µg/ml)  ml dung dịch escin 400 (µg/ml) + ml methanol 100%  dung dịch escin 100 (µg/ml)  ml dung dịch escin 400 (µg/ml) + ml methanol 100%  dung dịch escin 50 (µg/ml) Tiến hành tương tự xác định hàm lượng saponins, khác ta thay dịch chiết rễ An xoa dung dịch escin nổng độ khác Tiến hành đo máy đo quang phổ bước sóng 560 nm, ta thu đường chuẩn sau: PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Bảng PL 2.1: Ảnh hưởng điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng đến hợp chất phenolics hiệu suất trích ly phenolics từ rễ An xoa Thí nghiệm Hàm lượng phenolics tổng số (mg GAE/g) Lần Lần Lần Trun gbình Hiệu suất trích ly phenolics (%) SD Lần Lần Lần Trun g bình SD 14.04 14.70 14.45 14.40 0.3308 63.7 69.2 67.7 66.9 2.8313 10.97 10.33 10.77 10.69 0.3286 49.8 48.6 50.4 49.6 0.9164 15.59 15.14 15.44 15.39 0.2296 70.7 71.3 72.3 71.5 0.8111 12.92 12.50 12.60 12.67 0.2196 58.6 58.8 59.0 58.8 0.2124 11.14 10.27 10.52 10.64 0.4501 50.5 48.3 49.3 49.4 1.1141 12.17 12.68 13.11 12.65 0.4674 55.2 59.7 61.4 58.8 3.1829 12.50 12.46 12.51 12.49 0.0291 56.7 58.6 58.6 58.0 1.0971 10.33 10.18 9.79 10.10 0.2799 46.9 47.9 45.9 46.9 1.0357 11.30 10.87 10.80 10.99 0.2717 51.3 51.2 50.6 51.0 0.3758 10 11.88 11.51 11.39 11.59 0.2581 53.9 54.2 53.3 53.8 0.4234 11 12.07 12.10 12.51 12.22 0.2487 54.7 56.9 58.6 56.8 1.9398 12 13.48 13.85 13.78 13.70 0.1938 61.2 65.2 64.6 63.6 2.1575 13 14.92 14.25 14.74 14.64 0.3452 67.7 67.1 69.0 67.9 0.9886 14 17.06 16.77 17.58 17.13 0.4110 77.4 78.9 82.3 79.6 2.5399 15 11.63 11.14 11.68 11.48 0.2961 52.8 52.5 54.7 53.3 1.2161 16 13.75 13.62 13.57 13.65 0.0918 62.4 64.1 63.6 63.4 0.8873 17 13.15 13.22 13.56 13.31 0.2200 59.7 62.2 63.5 61.8 1.9702 18 9.24 0.0809 41.9 43.7 44.0 43.2 1.1367 19 10.62 10.56 10.86 10.68 0.1609 48.2 49.7 50.9 49.6 1.3558 20 9.81 0.2330 44.5 45.2 43.8 44.5 0.7304 21 12.27 12.32 12.57 12.39 0.1602 55.7 58.0 58.9 57.5 1.6453 22 13.15 12.61 13.08 12.95 0.2902 59.6 59.4 61.3 60.1 1.0183 23 15.93 14.97 14.89 15.26 0.5801 72.3 70.5 69.7 70.8 1.3055 9.29 9.61 9.40 9.35 9.31 9.59 24 11.45 11.56 11.13 11.38 0.2239 51.9 54.4 52.1 52.8 1.3742 25 11.96 12.43 12.12 12.17 0.2422 54.2 58.5 56.8 56.5 2.1546 26 12.13 11.76 12.29 12.06 0.2752 55.0 55.3 57.6 56.0 1.3939 27 12.29 11.30 12.17 11.92 0.5403 55.7 53.2 57.0 55.3 1.9494 Control 22.04 21.24 21.35 21.54 0.4336 Validation 18.1 18.32 0.5027 82.1 84.6 88.5 85 3.2540 18.0 18.9 GAE: Gallic acid equivalents (tương đương với acid galic) Bảng PL 2: Ảnh hưởng điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng đến hợp chất saponins khả quét gốc tự DPPH từ rễ An xoa Thí nghiệm Hàm lượng saponins (mg EE/g) Lần Lần Lần Trun g bình SD 13.71 15.52 16.32 15.19 9.56 Khả quét gốc tự DPPH (mg DPPH/g) Lần Lần Trung bình SD 1.3379 121.95 124.95 125.03 123.98 1.7588 1.0785 82.41 81.79 84.89 83.03 1.6410 12.44 20.73 18.01 17.06 4.2251 134.99 115.36 120.90 123.75 10.1184 8.06 8.14 9.51 8.57 0.8169 94.39 101.22 108.86 101.49 7.2396 11.31 8.75 8.25 9.44 1.6408 70.53 68.78 71.80 70.37 1.5171 13.91 13.35 11.81 13.02 1.0870 96.29 99.09 89.33 94.91 5.0283 11.41 13.57 12.74 12.57 1.0896 107.90 101.94 97.26 102.37 5.3326 12.45 7.95 9.40 9.94 2.2969 78.85 62.04 100.75 80.54 19.4100 7.09 7.56 7.45 7.37 0.2485 77.86 85.75 94.51 86.04 8.3292 10 7.66 8.44 9.16 8.42 0.7532 106.76 97.20 93.37 99.11 6.8963 11 13.07 11.74 12.93 12.58 0.7288 104.83 110.91 97.85 104.53 6.5336 12 16.50 13.57 15.53 15.20 1.4932 92.81 90.89 113.04 98.91 12.2725 13 9.65 1.0024 94.48 89.25 74.83 86.19 10.1802 14 14.26 18.29 16.40 16.32 2.0182 158.27 136.16 118.83 137.75 19.7681 15 11.30 9.28 10.24 10.27 1.0081 70.89 69.91 73.08 71.29 1.6204 16 9.80 9.61 0.1090 91.49 112.18 116.03 106.57 13.1975 17 13.10 14.64 13.46 13.73 0.8076 119.18 99.32 110.50 109.66 9.9577 18 6.38 6.60 6.11 6.36 0.2436 73.92 73.60 72.92 73.48 0.5076 19 7.72 8.05 11.93 9.23 2.3431 96.06 72.76 72.68 80.50 13.4743 7.77 8.80 9.81 9.70 9.01 10.79 9.75 9.74 Lần 20 10.53 7.54 21 9.72 9.26 1.5478 68.73 69.70 70.24 69.56 0.7691 10.15 10.74 9.59 10.16 0.5742 104.66 95.64 94.37 98.22 5.6095 22 7.09 8.57 1.4566 54.15 64.19 64.28 60.87 5.8214 23 13.81 10.02 11.16 11.66 1.9418 123.41 119.47 128.80 123.89 4.6863 24 9.75 0.7403 75.47 75.47 76.22 75.72 0.4361 25 10.24 9.94 11.86 10.68 1.0329 74.24 73.44 75.48 74.39 1.0259 26 5.95 8.50 8.46 7.64 1.4595 75.10 70.55 77.24 74.29 3.4187 27 9.88 9.90 9.92 9.90 0.0195 94.08 87.26 101.16 94.17 6.9501 Validation 21.52 20.48 21.26 21.09 0.5417 146.02 147.46 146.98 146.82 0.7288 10.00 8.63 8.59 9.96 9.43 EE: Escin equivalents (tương đương với escin) PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình 1: Xác định hàm lượng phenolics tổng số Hình 1a: Mẫu trắng (bên trái) mẫu Hình 1b: Mẫu trắng (bên trái) thử (bên phải) thí nghiệm mẫu thử (bên phải) thí nghiệm validation trước phản ứng validation sau phản ứng Hình 2: Xác định hiệu suất trích ly phenolics Hình 2a: Kết thử nhanh thuốc thử Folin mẫu control sau lần chiết thứ thứ Hình 2b: Mẫu control (bên trái) mẫu trắng (bên phải) sau phản ứng Hình 3: Xác định hàm lượng saponins Hình 3a: Mẫu trắng (bên phải) mẫu thử (bên trái) thí nghiệm validation trước phản ứng Hình 3b: Mẫu trắng (bên phải) mẫu thử (bên trái) thí nghiệm validation sau phản ứng Hình 4: Xác định khả quét gốc tự DPPH Hình 4a: Mẫu trắng (bên phải) mẫu thử Hình 4b: Mẫu trắng (bên phải) mẫu thử (bên trái) mẫu validation trước phản (bên trái) mẫu validation sau phản ứng ... cứu: Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất phenolics khả chống ơxyhóa từ rễ An xoa (Helicteres hirsuta Lour. ) Mục đích đề tài: Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng. .. (TPC), hàm lượng saponins tổng số (SC) Xác định ảnh hưởng yếu tố đến khả trích ly hợp chất phenolics khả chống ơxy -hóa từ rễ An xoa Xác định điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng tối ưu cho hợp chất. .. TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TỐI ƯU HĨA ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SÓNG CHO HỢP CHẤT PHENOLICS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG ƠXY-HĨA TỪ RỄ CÂY AN XOA