Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất phenolics và khả năng chống oxy hóa từ rễ cây an xoa (helicteres hirsuta lour )

LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan mọi kết quả của đề tài “Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất phenolics và khả năng chống ôxy-hóa từ rễ cây An xoa” là công trình nghiê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SÓNG CHO HỢP CHẤT PHENOLICS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG ÔXY-HÓA

TỪ RỄ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.)

Giảng viên hướng dẫn: 1 PGS TS Trang Sĩ Trung

2 TS Nguyễn Văn Tặng Sinh viên thực hiện : Phạm Thị Quí

Mã số sinh viên : 56136364

Khánh Hòa - 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SÓNG CHO HỢP CHẤT PHENOLICS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG ÔXY-HÓA

TỪ RỄ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.)

GVHD: 1 PGS TS Trang Sĩ Trung

2 TS Nguyễn Văn Tặng SVTH: Phạm Thị Quí

MSSV: 56136364

Khánh Hòa, tháng 7/2018

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan mọi kết quả của đề tài “Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi

sóng cho hợp chất phenolics và khả năng chống ôxy-hóa từ rễ cây An xoa” là công

trình nghiên cứu do em thực hiện và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đồ án này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đồ án này đã được ghi rõ nguồn gốc

Nha Trang, ngày…tháng…năm 2018

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Quí

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, trang bị vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt khóa học

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy TS Nguyễn Văn Tặng và thầy PGS.TS Trang Sĩ Trung đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và tận tình giúp đỡ để em có thể hoàn thành được đồ án tốt nghiệp này

Em xin cảm ơn quý thầy cô thuộc Trung tâm thí nghiệm Thực hành đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình hoàn thành đồ án

Cuối cùng, em gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, tạo điều kiện và giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Nha Trang, ngày…tháng…năm 2018

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Quí

TÓM TẮT

Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) được biết đến như một loại thuốc chữa

ung nhọt, dịu đau, tiêu độc, khắc chế các bệnh về gan như viêm gan, ung thư gan,…Trong Y học cổ truyền [1] và gần đây cũng đã có nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng dược lý này Nghiên cứu này được thiết kế để tối ưu hóa các thông

số chiết bằng phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng (MAE) để thu được hàm lượng phenolics tổng số (TPC), hiệu suất trích ly phenolics (PEE), hàm lượng saponins (SC)

và khả năng quét gốc tự do DPPH cao nhất (DRSC) từ rễ cây An xoa bằng phương pháp

bề mặt đáp ứng (RSM) Một thiết kế Box-Behnken cho 4 yếu tố được thực hiện thông qua việc bố trí 27 thí nghiệm để làm rõ ảnh hưởng của công suất vi sóng (X1), thời gian chiếu xạ (X2), thời gian chiết (X3), và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (X4) đối với TPC, PEE,

SC, DRSC Kết quả là đã xây dựng được phương trình mô tả ảnh hưởng của các thông

số MAE đến hàm mục tiêu là hàm lượng phenolics tổng số (YTPC) và khả năng quét gốc

tự do DPPH (YDRSC) từ rễ cây An xoa như sau:

YTPC = 15.927 – 0.244X 1 + 0.93X 2 + 0.178X 3 + 0.869X 4 - 0.16X 1 X 2 -0.318X 1 X 3 – 0.243X 2 X 3 + 0.33X 1 X 4 + 0.358X 2 X 4 – 0.095X 3 X 4 – 2.306X 1 – 2.2 X 2 – 0.872X 3 – 2.503X 4

YDRSC = 128.463 – 0.054X 1 + 0.895X 2 + 4.084X 3 + 13.615X 4 – 1.988X 1 X 2 – 10.488X 1 X 3 + 1.198X 2 X 3 + 0.528X 1 X 4 + 5.14X 2 X 4 – 4.398X 3 X 4 – 16.924X 1 – 23.69X 2 – 16.182X 3 – 23.448X 4 2

Kết quả nghiên cứu cũng đã đưa ra các thông số MAE tối ưu để đạt được TPC, PEE, SC cao nhất và khả năng chống ôxy hóa tốt nhất là công suất vi sóng 800W, thời gian chiếu xạ 16 giây/phút, thời gian chiết 16 phút và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 32 mL/g mẫu Tại các thông số MAE tối ưu này, các giá trị thực nghiệm của TPC, PEE,

SC, DRSC của rễ cây An xoa lần lượt là 18.32 mg GAE/g mẫu, 85%, 21.09 mg EE/g mẫu và 146.82 mg DPPH/g mẫu Những kết quả thực nghiệm này đều cao hơn so với các giá trị dự đoán từ mô hình (16.1 mg GAE/g mẫu, 74.7%, 15.41 mg EE/g mẫu và 129.73 mg DPPH/g mẫu), điều này chứng tỏ mô hình tối ưu tương thích tốt với thực nghiệm Như vậy, các thông số MAE tối ưu 800W, 16 giây/phút, 16 phút và 32 mL/g mẫu được chọn để tối ưu hóa cho hợp chất phenolics và khả năng quét gốc tự do DPPH

từ rễ cây An xoa cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Danh mục các từ viết tắt vii

Danh mục hình viii

Danh mục bảng x

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về cây An xoa 4

1.1.1 Đặc điểm và phân bố sinh thái của cây An xoa 4

1.1.2 Thành phần hóa học của cây An xoa 5

1.1.3 Công dụng của cây An xoa 7

1.1.4 Một số bài thuốc dân gian của cây An xoa [42] 8

1.2 Giới thiệu về hoạt chất sinh học 9

1.2.1 Hợp chất phenolics [27] 9

1.2.2 Hợp chất saponins [34] 11

1.3 Quá trình ôxy-hóa và chống ôxy-hóa 12

1.3.1 Quá trình ôxy-hóa 12

1.3.2 Chất chống ôxy-hóa 15

1.3.3 Một số phương pháp phân tích đánh giá hoạt tính chống ôxy-hóa 16

1.4 Các phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học 19

1.4.1 Phương pháp truyền thống 19

1.4.2 Phương pháp hiện đại 22

1.5 Phương pháp tối ưu hóa quá trình trích ly 26

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Đối tượng nghiên cứu, thiết bị dụng cụ và hóa chất phân tích 29

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 29

2.1.3 Hóa chất phân tích 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 30

2.2.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết 30

2.3 Phương pháp xử lí số liệu 36

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Độ ẩm dư của nguyên liệu 37

3.2 Ảnh hưởng của các thông số trích ly hỗ trợ vi sóng đến hàm lượng phenolics tổng số, hiệu suất thu hồi phenolics, hàm lượng saponins và khả năng quét gốc tự do DPPH của dịch chiết từ rễ cây An xoa 37

3.2.1 Hàm lượng phenolics tổng số (TPC) 41

3.2.2 Hiệu suất trích ly phenolics (PEE) 46

3.2.3 Hàm lượng saponins (SC) 49

3.2.4 Khả năng quét gốc tự do DPPH của dịch chiết từ rễ cây An xoa (DRSC) 52 3.3 Kiểm chứng sự phù hợp của mô hình so với thực nghiệm 56

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 57

4.1 Kết luận 57

4.2 Đề xuất ý kiến 58

Tài liệu tham khảo 59

Phụ lục 65

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PAL: Phenylalanine ammonia lyase

UV: Ultraviolet

MAE: Microwave-assisted extraction

UAE Ultrasound-assisted extraction

SFE Supercritical fluid extraction

RSM: Response surface methodology

UV-Vis: Ultraviolet-visible spectroscopy

3D: Three-dimensional

SD: Standard deviation

TPC: Total phenolic content

GAE: Gallic acid equivalent

PEE: Phenolic extraction efficiency

SC: Saponin content

EE: Escin equivalent

DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

DRSC: DPPH radical-scavenging capacity

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây An xoa [nguồn: tác giả] 4

Hình 1.2: Hoa và quả cây An xoa [41] 5

Hình 1 3: Công thức hóa học của (±) ‐pinoresinol, (±) ‐medioresinol, (±) ‐ syringaresinol, (-) - boehmenan , (-) - boehmenan H và (±) - trans ‐dihydrodiconiferyl alcohol [20] 6

Hình 1 4: Công thức hóa học của lupeol, stigmasterol, apigenin và tiliroside [3] 6

Hình 1.5: Các sản phẩm của phenylalanin nhờ emzyme PAL xúc tác [27] 10

Hình 1.6: Các phenylpropanoid được tạo thành từ phenylalanine và tyrosine [27] 11

Hình 1.7: Sơ đồ tổng quát cho quá trình ôxy-hóa chất béo có chứa acid không bão hòa (RH) và hậu quả của nó [28] 13

Hình 1.8: Tác động của gốc tự do lên tế bào [49] 14

Hình 1 9: Cơ chế hoạt động của chất chống ôxy-hóa [44] 15

Hình 1 10: Sơ đồ phản ứng giữa chất chống ôxy-hóa và gốc tự do DPPH [46] 17

Hình 1 11: Cơ chế khử Cu2+ thành Cu + của các chất chống ôxy-hóa [32] 18

Hình 1.12: Thiết bị Soxhlet [48] 21

Hình 1.13: Hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng [nguồn: tác giả] 22

Hình 2 1: Rễ cây An xoa đã xay [nguồn: tác giả] 29

Hình 2 2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30

Hình 2 3: Sơ đồ quá trình trích ly 31

Hình 3 1: Mô hình bề mặt đáp ứng sự ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ tới hàm lượng phenolics tổng số (TPC), hiệu suất trích ly phenolics (PEE), hàm lượng saponins (SC) và khả năng quét gốc tự do DPPH của dịch chiết ở điều kiện tối ưu 40

Hình 3 2: Ảnh hưởng của điều kiện trích ly khác nhau đến hàm lượng phenolics Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 41

Hình 3 3: Ảnh hưởng của công suất và thời gian chiếu xạ đến hàm lượng phenolics tổng số trên mô hình 3D 42 Hình 3 4: Mối quan hệ giữa TPC dự đoán và TPC đo được từ thiết kế Box-Behnken42 Hình 3 5: Ảnh hưởng của các điều kiện trích ly khác nhau đến hiệu suất trích ly

phenolics Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 46 Hình 3 6: Ảnh hưởng của công suất và thời gian chiếu xạ đến hiệu suất trích ly

phenolics trên mô hình 3D 47 Hình 3 7: Mối quan hệ giữa PEE dự đoán và PEE đo được từ thiết kế Box-Behnken47 Hình 3 8: Ảnh hưởng của các điều kiện trích ly khác nhau đến hàm lượng saponins Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 49 Hình 3 9: Ảnh hưởng của công suất và thời gian chiếu xạ đến hàm lượng saponins trên mô hình 3D 50 Hình 3 10: Mối quan hệ giữa SC dự đoán và SC đo được từ thiết kế Box-Behnken 50 Hình 3 11: Ảnh hưởng của các điều kiện trích ly khác nhau đến khả năng quét gốc tự

do DPPH của dịch chiết phenolics từ rễ cây An xoa Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra

sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 52 Hình 3 12: Ảnh hưởng của công suất và thời gian chiếu xạ đến khả năng quét gốc tự

do DPPH trên mô hình 3D 53 Hình 3 13: Mối quan hệ giữa khả năng quét gốc tự do DPPH dự đoán và đo được từ thiết kế Box-Behnken 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các yếu tố độc lập và mức độ của chúng cho thiết kế Box-Behnken 32 Bảng 2 2: Thiết kế Box-Behnken về ảnh hưởng của các thông số trích ly hỗ trợ vi sóng đối với hàm lượng phenolics, hiệu suất trích ly phenolics, hàm lượng saponins,

và khả năng chống ôxy hoá của rễ cây An xoa 33 Bảng 3.1: Hàm lượng ẩm dư, hàm lượng chất khô của rễ cây An xoa 37 Bảng 3.2: Giá trị đo được (Mea.) của hàm lượng phenolics tổng số (TPC), hiệu suất trích ly phenolics (PEE), hàm lượng saponins (SC) và khả năng quét gốc tự do DPPH (quét gốc tự do DPPH) của dịch chiết rễ cây An xoa từ thiết kế Box-Behnken và ở điều kiện MAE tối ưu (validation) 37 Bảng 3.3: Bảng hệ số của mô hình hồi qui 39

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay xã hội ngày càng phát triển, cuộc sống con người ngày càng được cải thiện và nâng cao Song song với đó là việc con người phải làm việc nhiều hơn, áp lực hơn dẫn tới bị stress, hơn nữa xã hội phát triển đi đôi với nhiều vấn đề nảy sinh như ô nhiễm môi trường, ô nhiễm không khí, thực phẩm bẩn, thuốc lá, rượu bia,…là những tác nhân sinh ra các gốc tự do Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể, là nguyên nhân chính gây ra các bệnh nguy hiểm như ung thư, xơ cứng động mạch, suy giảm hệ miễn dịch, teo cơ và não,…Để hạn chế tác dụng xấu của các gốc tự do, biện pháp hiệu quả và khả thi nhất là tăng cường hoạt động của hệ thống bảo vệ chống ôxy-hóa của cơ thể bằng những chất chống ôxy-hóa Ngoài những chất chống ôxy-hóa nội sinh còn cần

hỗ trợ ngoại sinh những chất chống ôxy-hóa từ thực phẩm trong chế độ ăn uống [28] Một số hợp chất chống ôxy-hóa tổng hợp như butylated hydrôxyl anisole (BHA) và butylated hydrôxyl toluene (BHT) đã được sử dụng trong bảo quản thực phẩm Tuy nhiên những hợp chất tổng hợp này có thể gây ra những tác dụng không mong muốn, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng [31] Do đó việc nghiên cứu những hợp chất chống ôxy-hóa có nguồn gốc tự nhiên có lợi cho sức khỏe con người là cần thiết và là hướng đi có tiềm năng trong tương lai

Những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ thực vật đã không ngừng phát triển và bước đầu đạt được những thành tựu đáng

kể, trong đó không thể không nhắc đến hợp chất phenolics Phenolics là hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật [10] Chúng có đặc tính chống ôxy-hóa mạnh, kháng viêm, kháng khuẩn, giảm các nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ngăn ngừa được bệnh ung thư

và các bệnh khác cho con người Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật - nguồn nguyên liệu tiềm năng để thu nhận dịch chiết giàu phenolics [10]

Cây An xoa có tên khoa học là Helicteres hirsuta Lour., là một loại cây mọc

hoang dã, phân bố rộng khắp từ Bắc đến Nam, đặc biệt ở các tỉnh Bình Phước, Lâm Đồng, Đăk Nông, ngoài ra còn có nhiều ở Lào, Campuchia, Thái Lan,…Đã có những nghiên cứu được thực hiện trên cây An xoa chứng minh tác dụng dược lý nổi trội của

nó như khả năng quét gốc tự do DPPH mạnh [16, 37], khả năng chống viêm, giảm đau [18], khả năng phòng ngừa các khối u, ức chế tế bào ung thư phổi, ung thư tuyến tiền

liệt và ung thư vú ở người [20], đặc biệt là ung thư gan [3] Tuy nhiên, những nghiên cứu này chỉ tiến hành trên đối tượng là thân và lá cây An xoa mà chưa có công trình nghiên cứu nào được thực hiện để thu nhận dịch chiết giàu phenolics từ rễ cây An xoa

Bên cạnh việc tìm kiếm các hợp chất mới thì việc đẩy mạnh nghiên cứu các phương pháp tách chiết các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cũng không kém phần quan trọng Cần thiết phải tìm ra phương pháp trích ly tối ưu nhất phù hợp với từng loại dược liệu để tạo điều kiện tốt nhất cho việc tách chiết được triệt để và dịch chiết đạt chất lượng cao, tránh hao phí nguồn dược liệu Trên cơ sở đó, hiện nay đã có nhiều phương pháp trích ly tiên tiến được phát triển và áp dụng cho việc trích ly các hợp chất hoạt tính sinh học như trích ly có sự hỗ trợ siêu âm (UAE), trích ly hỗ trợ vi sóng (MAE)

và các kỹ thuật sử dụng chất lỏng nén như trích ly chất lỏng siêu tới hạn (SFE), [38].Với những ưu điểm vượt trội của phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng như rút ngắn thời gian chiết; tiến hành trong thời gian ngắn nên hoạt chất ít bị phân hủy, nhờ đó hiệu suất thu hồi hợp chất có hoạt tính sinh học cao và đạt được chất lượng tốt; đồng thời tiết kiệm dung môi, tiết kiệm năng lượng, [38, 39] Do đó, phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng

đã được lựa chọn trong nghiên cứu này

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tối ưu

hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất phenolics và khả năng chống

ôxy-hóa từ rễ cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)”

Mục đích của đề tài: Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng để thu được

hàm lượng hợp chất phenolics có hoạt tính chống ôxy-hóa cao nhất từ rễ cây An xoa

Nội dung nghiên cứu:

1 Chuẩn bị mẫu khô từ rễ cây An xoa và xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu ban đầu: Độ ẩm dư, hàm lượng phenolics tổng số (TPC), hàm lượng saponins tổng số (SC)

2 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố chính đến khả năng trích ly hợp chất phenolics cũng như khả năng chống ôxy-hóa từ rễ cây An xoa

3 Xác định điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng tối ưu cho hợp chất phenolics từ

rễ cây An xoa

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Đề tài tìm ra được điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng tối ưu để thu được hàm lượng phenolics cao nhất từ rễ cây An xoa Dịch chiết thu được sẽ được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, y học, dược học…Đồng thời, kết quả của đề tài là dữ liệu khoa học tham khảo cho giảng viên, sinh viên, các nhà nghiên cứu và sản xuất quan tâm đến hợp chất phenolics từ các nguồn tự nhiên

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về cây An xoa

1.1.1 Đặc điểm và phân bố sinh thái của cây An xoa

Đặc điểm của cây An xoa

Cây An xoa còn có những tên gọi khác là Tổ Kén Cái hoặc cây Dó lông, nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau [50]:

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Bộ: Bông (Malvales) Họ: Trôm (Sterculiaceae)

Chi: Helicteres

Loài: Helicteres hirsuta

Tên khoa học: Helicteres hirsuta Lour

Cây An xoa (Hình 1.1) là loại cây bụi cao 1-3m, dạng cây gỗ nhỏ sống lâu năm, nhánh hình trụ, có lông Lá cây hình trái xoan dài 5-7 cm, rộng 2,5-7,5 cm, gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn, mép có răng không đều, mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao; cuống lá dài 0,8-4 cm; lá kèm hình dải, có lông, dễ rụng [1]

Hình 1.1: Cây An xoa [nguồn: tác giả]

Cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá Hoa màu hồng hay tím; cuống hoa có khớp và có lá bắc dễ rụng; đài hoa hình ống phủ lông hình sao, màu đo

đỏ, chia 5 răng Hoa gồm cánh hoa, cuống hoa, bộ nhị có vân đỏ, nhị; bầu hoa có nhiều gợn chứa 25-30 noãn trong mỗi lá noãn Quả dài và nhỏ như hình con sâu, hình trụ nhọn hạt nhiều, có lông xung quanh, trông như tổ kén [1] (Hình 1.2)

Phân bố sinh thái [1]

Cây An xoa phân bố ở khắp nơi từ Bắc đến Nam, đặc biệt ở tỉnh Bình Phước, Lâm Đồng, Đăk Nông, các tỉnh vùng núi phía Bắc Ngoài ra còn có ở Ấn Độ, Myanma, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philipin

Ở nước ta, cây mọc rất phổ biến, thường gặp trên các đồi cây bụi trãi nắng, trong rừng thưa, ven rừng, trên các bãi hoang đồi cỏ, ở độ cao từ thấp lên đến 1500m Ra hoa kết quả gần như quanh năm

1.1.2 Thành phần hóa học của cây An xoa

Năm 2006, Chin, Y.W và cộng sự đã nghiên cứu và cô lập được sáu lignans, cụ thể là, (±) ‐pinoresinol, (±) ‐medioresinol, (±) ‐syringaresinol, (-) - boehmenan , (-) -

boehmenan H và (±) - trans ‐dihydrodiconiferyl alcohol trên thân cây An xoa [20] (Hình 1.3)

Hình 1.2: Hoa và quả cây An xoa [41]

Năm 2016, Nguyễn Hữu Duyên và Lê Thanh Phước - Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ cũng đã tiến hành phân lập và định danh được 4 hợp chất từ cao chiết cây An xoa: lupeol, stigmasterol, apigenin và tiliroside [3] (Hình 1.4)

Hình 1 3: Công thức hóa học của (±) ‐pinoresinol, (±) ‐medioresinol, (±) ‐syringaresinol, (-) - boehmenan , (-) - boehmenan H và (±) - trans ‐dihydrodiconiferyl alcohol [20]

Hình 1 4: Công thức hóa học của lupeol, stigmasterol, apigenin và tiliroside [3]

1.1.3 Công dụng của cây An xoa

Theo Y học cổ truyền

Cây An xoa là thảo dược lành tính, không độc tố, có tác dụng mát gan, thanh nhiệt cơ thể rất tốt Đặc tính của nó có khả năng khắc chế các bệnh về gan, đặc biệt là men gan cao, xơ gan, viêm gan, ung thư gan, cây dùng làm thuốc chữa ung nhọt Rễ cây

An xoa dùng làm dịu đau, dùng để chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm và làm thuốc tiêu độc, chữa đái dắt,…[1]

Theo Đông Y, cây An xoa có tính mát giúp thanh lọc cơ thể, giải độc gan, có tác dụng với bệnh suy chức năng gan Với những người uống nhiều rượu bia, ăn thức ăn nhiều dầu mỡ thường xuyên khiến gan nóng, viêm gan Biểu hiện bệnh như: tiểu tiện

đỏ, có sắc mặt vàng, da nhợt nhạt, mệt mỏi xuất hiện mụn nhọt ở mặt, lưng Có thể sử dụng nước An xoa để thanh lọc gan, tăng cường chức năng gan.[42]

Ngoài ra, cây An xoa có tác dụng đáng kể trong điều trị viêm đại tràng Nguyên nhân gây ra bệnh ở đại tràng như viêm đại tràng co thắt, viêm đại tràng mãn tính, ung thư đại tràng là do ăn uống không hợp vệ sinh, chế độ ăn uống không điều độ kéo dài hoặc uống nhiều rượu, bia làm tổn thương niêm mạc ruột Ngoài ra bị táo bón kéo dài

có thể gây tổn thương đại tràng Cây An xoa có thể tái tạo và phục hồi niêm mạc đại tràng bị tổn thương.[42]

Theo Y học hiện đại

Năm 2006, một số nhà khoa học người Mỹ đã tìm thấy trong cây An xoa mọc ở Indonesia có chứa các hợp chất Lignans có tác dụng gây độc với tế bào ung thư như (±)‐pinoresinol, (±)‐medioresinol, (±)‐syringaresinol, (−)‐boehmenan, (−)‐boehmenan H và (±)‐trans‐dihydrodiconiferyl alcohol Trong đó, (±)‐pinoresinol là một lignans có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh trên thực nghiệm [20] Hợp chất (+)-pinoresinol có tác dụng chống ôxy-hóa, giảm sự hình thành các chất trung gian gây viêm, do đó có tác dụng bảo vệ tế bào gan; (+)-syringaresinol với tác dụng kháng viêm và chống sốt rét và (+)- medioresinol bên cạnh tác dụng làm giảm nguy cơ về bệnh tim mạch còn có tác dụng kháng nấm rất tốt [2]

Lê Thị Hải Yến và cộng sự (năm 2016) cũng đã xác định được dịch chiết từ cây

An xoa có tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu bì miệng, ung thư gan, ung thư phổi trên

thực nghiệm [19] Một năm sau đó, Lê Thị Hải Yến và các cộng sự cũng đã tiến hành những nghiên cứu trên thực nghiệm về tác dụng giảm đau, chống viêm của cao lỏng từ dịch chiết cây An xoa Kết quả này phần nào chứng minh sự phù hợp giữa tác dụng giảm đau, chống viêm trên thực nghiệm với kinh nghiệm dân gian khi sử dụng An xoa

(Helicteres hirsuta Lour.) [18]

Có nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng bảo vệ gan và chống ôxy-hóa của cây An xoa Năm 2016, Vũ Thị Minh Hiền và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

và kết quả cho thấy tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng An xoa, hạn chế được tổn thương

cả cấu trúc đại thể và vi thể gan chuột nhắt; đồng thời cũng có tác dụng chống ôxy-hóa [6] Cũng thời gian đó, Nguyễn Hữu Duyên và Lê Thanh Phước- Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ cũng đã tiến hành khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên

dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan) từ cao chiết của cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu

tại Hòn Sơn thuộc xã Lại Sơn, huyện Kiên Hải, tỉnh Kiên Giang và đã cho ra kết quả dương tính Kết quả này phù hợp với khả năng trị bệnh gan của cây An xoa trong dân gian Nghiên cứu cũng đã phân lập và nhận danh được 4 hợp chất: lupeol, stigmasterol, apigenin và tiliroside Trong đó lupeol có thể tiêu diệt và ngăn chặn sự lan truyền của tế bào ung thư, hợp chất lupeol có khả năng gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2); stigmasterol được sử dụng trong phòng ngừa khối u và kháng ôxy-hóa, ngoài

ra còn có tiềm năng chữa viêm xương khớp; apigenin có khả năng chống viêm, chống ôxy-hóa và ngăn ngừa ung thư; tiliroside là hợp chất tự nhiên có khả năng kháng ôxy-hóa

và kháng viêm, đã được thử nghiệm in vitro và in vivo cho kết quả tốt [3]

Một số nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng dịch chiết từ cây An xoa có khả năng kháng khuẩn và chống ôxy-hóa khá mạnh [16, 37]

1.1.4 Một số bài thuốc dân gian của cây An xoa [42]

Dùng cây An xoa tốt nhất khi phơi khô, sao vàng hạ thổ Nếu dùng An xoa không sao vàng hạ thổ, bệnh nhân có hiện tượng đầy bụng, khó tiêu Khi sắc nước An xoa khô cần nhặt hết quả, hoa trước khi sử dụng bởi hoa và quả An xoa có nhiều lông, khi uống

sẽ gây ngứa và ho cho người sử dụng

Dùng độc vị An xoa cho bệnh nhân ung thư gan: Bộ phận dùng làm thuốc của

cây là cả lá và thân cây Cây thuốc chặt về đem tách lá và cành nhỏ riêng, thân riêng Lá cành nhỏ đem phơi khô, thân và cành lớn đem băm mỏng nhỏ sao vàng hạ thổ làm thuốc

An xoa (thân và lá phơi khô) 100g sắc với 1,5 lít nước Sắc còn 800ml uống trong ngày Nên uống vào thời điểm sau bữa ăn 20 phút

Dùng cây An xoa kết hợp với cây xạ đen để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư: Cây An xoa sử dụng kết hợp với cây xạ đen khô, mỗi loại 50g Hai vị trên sắc với 1,5 lít nước, sắc cạn còn 0,8 lít đến 1 lít nước uống trong ngày

Dùng cây An xoa cho bệnh nhân viêm gan B:

o Cây An xoa sao vàng hạ thổ: 30g (cả thân và lá)

o Cây cà gai leo: 30g

chuyển hóa thành p-coumaric nhờ sự hoạt động của enzyme tyrosine ammonia lyase

(TAL) Enzyme P450 monoôxydase xúc tác đưa một nhóm hydrôxyl vào vị trí para của

vòng phenyl của acid cinnamic, tạo thành acid p-coumaric Acid p-coumaric được tạo

thành có thể được hydrôxyl hóa ở vị trí 3 và 5 bằng enzyme hydrôxylase và có thể được methyl hóa qua enzyme O-methyl transferase, tạo thành các acid cafeic, ferulic và sinapic Những hợp chất này có 1 vòng phenyl (C6) và 1 chuỗi C3 bên cạnh, do đó được gọi chung là phenylpropanoid, đây là tiền chất cho quá trình tổng hợp lignins và nhiều hợp chất phenolics khác

Hình 1.5: Các sản phẩm của phenylalanin nhờ emzyme PAL xúc tác [27]

Hình 1.6: Các phenylpropanoid được tạo thành từ phenylalanine và tyrosine [27] Vai trò của phenolics [7, 27]: Nhiều nghiên cứu đã xác định các hợp chất

phenolics trong thực vật nói chung có hiệu quả cao trong hoạt động chống ôxy-hóa Ngoài khả năng ngăn chặn có hiệu quả các quá trình ôxy-hóa, đặc biệt là các quá trình ôxy-hóa lipid, các hợp chất phenolics còn có vai trò tích cực đối với sức khỏe con người như khả năng kháng khuẩn, ức chế sự phát triển của vi nấm, có khả năng chống và ức chế các tế bào ung thư và sự hấp thụ các tia UV, giúp ngăn ngừa ung thư

1.2.2 Hợp chất saponins [34]

Saponins là một glycosyd tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật Có thể được chia thành tritepenoid saponins và steroidal saponins Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn, saponins bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường Các đường phổ biến là D-glucoza, D-galactoza, L-arabinoza, axít galactunoic, axít D-glucuronic Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi hoặc sapogenintritecpen

dạng β-amirin (axít olenoic), dạng α-amirin (axít asiatic), dạng lupol (axit buletinie) hoặc tritecpen bốn vòng

Saponins được phân bố chính ở nhóm cây cao trên mặt đất, chẳng hạn như steroidal saponins được tìm thấy ở họ Củ Nâu, họ Loa Kèn, họ Hoa Mõm Chó và tritepenoid saponins có trong họ Nhân Sâm, họ Bầu Bí, Ngoài ra, saponins cũng được tìm thấy trong một số sinh vật biển như sao biển, hải sâm,…

Hầu hết saponins là những chất hoạt động bề mặt tự nhiên do tính chất aglycone lipophilic và hiệu ứng drophilic phần đường Do đó, chúng có tạo hiệu ứng bọt xà phòng lâu dài sau khi dao động Một số chất trích ly giàu saponins được sử dụng để sản xuất chất nhũ hóa, chất tẩy rửa, chất tạo bọt Saponins cũng có khả năng phá hủy màng tế bào, có tính chất phá huyết, khả năng gây độc tế bào trong cá và ốc sên

Saponins là hợp chất có độ phân cực cao, do đó cần trích ly với alcohol, nước và hỗn hợp của nó Ngoài ra, để làm sạch saponins, người ta sử dụng phương pháp kết tủa bằng cách cho một lượng lớn acetone hoặc ethyl ete vào trong dung dịch metanol hoặc ethanol chứa saponins Tuy nhiên, ngày nay nhựa macroporous đã được sử dụng rộng rãi cho việc phân lập, nhận biết và sản xuất saponins trong công nghiệp

1.3 Quá trình ôxy-hóa và chống ôxy-hóa

1.3.1 Quá trình ôxy-hóa

Quá trình ôxy-hóa là một loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất ôxy-hóa, có khả năng tạo ra các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật [14]

Gốc tự do là phân tử thiếu đi một điện tử, điện tích luôn không cân bằng, có xu thế lấy điện tử từ phân tử khác và tạo ra gốc tự do mới gây ra sự rối loạn chức năng của

tế bào [14] Do chứa điện tích độc thân mà các electron này mang năng lượng rất lớn,

do đó gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, luôn sẵn sàng tham gia quá trình ôxy-hóa, nhận điện tử của các chất mà nó tiếp xúc và tạo ra những sản phẩm bất lợi cho cơ thể như aldehyde, rượu, cetone…gây ra những tổn thương cho tế bào [13, 14]

Gốc tự do không chỉ được sinh ra từ các quá trình chuyển hóa trong cơ thể mà còn được hình thành dưới tác động của các yếu tố bên ngoài như: môi trường ô nhiễm, tia tử ngoại, stress, độc tố trong thực phẩm, khói thuốc lá, rượu bia, [45]

Các gốc tự do được sinh ra hoạt động rất mạnh, không tồn tại lâu Nó kết hợp với nhau hoặc kết hợp với các acid béo khác bằng cách lấy đi H2 và tạo ra aldehyde, rượu, cetone [13] Màng tế bào giàu acid béo chưa bão hòa nên dễ dàng bị tấn công bởi các tác nhân ôxy-hóa, được gọi là quá trình ôxy-hóa lipid Đây là tiến trình mà các gốc tự

do lấy điện tử từ lipid trong màng tế bào và tạo ra một chuỗi phản ứng cực kì nguy hiểm [28] (Hình 1.7)

Hình 1.7: Sơ đồ tổng quát cho quá trình ôxy-hóa chất béo có chứa acid không bão hòa (RH)

và hậu quả của nó [28]

Quá trình ôxy-hóa gồm 3 giai đoạn [28]:

Ở giai đoạn lan truyền, gốc tự do lipit R• sẽ bắt đầu chuỗi chuyển hóa ôxy-hóa bằng cách tiếp tục phản ứng với ôxy trong cơ thể tạo ra perôxyde ROO• Gốc ROO• sẽ hình thành hợp chất hydroperôxyde ROOH bằng cách lấy đi một nguyên tử hydrogen từ một acid béo không no kế cận nó Từ hydroperôxyde sẽ phân mạch, dẫn tới tích tụ các gốc tự do như alcôxyl RO•, perôxyde ROO• và hydrôxyde •OH

ROOH RO• + •OH 2ROOHROO• + H2O + RO• ROOH + RHRO• + H2O + R•

Từ gốc alcôxyl sẽ tạo ra các sản phẩm thứ cấp như aldehyl, rượu, cetone,…gây mùi khó chịu cho thực phẩm và không có lợi cho sức khỏe

 GĐ 3 Kết thúc: R• + R•

R• + ROO• Sản phẩm phi tự do ROO• +ROO•

Giai đoạn kết thúc xảy ra khi hai gốc tự do kết hợp với nhau tạo thành phân tử trung hòa hoặc tác dụng với các chất chống ôxy-hóa để tiêu diệt các gốc tự do

Trong thực phẩm: Gốc tự do làm biến đổi các sắc tố, hương vị và vitamin; tạo mùi khó chịu, gây cảm quan không tốt cho thực phẩm; hơn thế nữa, nó còn tạo ra một số chất độc như aldehyde, cetone, rượu, hydroperôxyde và đặc biệt là perôxyde (rất độc) [13]

Trong cơ thể [28]: Gốc tự do làm đình chỉ hoạt động bình thường của tế bào (Hình 1.8), làm thay đổi chức năng và cấu trúc của protein; có liên quan đến một số bệnh

và tổn thương mô như phổi, hệ tim mạch, thận, gan, mắt, da, cơ và não cũng như các quá trình lão hóa Gốc tự do và các tác nhân ôxy-hóa được biết đến như là trung gian cho các rối loạn đó nhưng thường được trung hòa bởi những chất chống ôxy-hóa trong

Hình 1.8: Tác động của gốc tự do lên tế bào [49]

cơ thể Tuy nhiên, đối với tuổi tác và những cá nhân có bệnh nhất định thì ngoài những chất chống ôxy-hóa nội sinh có thể còn cần sự hỗ trợ của các chất chống ôxy-hóa ngoại sinh từ chế độ ăn uống, duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào

1.3.2 Chất chống ôxy-hóa

Chất chống ôxy-hóa là những chất làm chậm hoặc ngăn chặn quá trình ôxy-hóa nhờ có khả năng chuyển các gốc tự do thành phân tử ổn định, tác dụng tạo phức với ion kim loại làm ức chế xúc tác cho quá trình ôxy-hóa [27] Chất chống ôxy-hóa có electron

dư thừa để cung cấp cho các gốc tự do, các gốc tự do sẽ trở nên ổn định và không còn khả năng gây hại (Hình 1.9)

Hình 1 9: Cơ chế hoạt động của chất chống ôxy-hóa [44]

Các chất chống ôxy-hóa (AH) cản trở quá trình ôxy-hóa lipid bằng cách nhanh chóng điền một nguyên tử hydro vào các gốc tự do [27]:

ROO• + AHROOH + A• ROO• + A• ROOA

RO• + AH ROH + A• Những chất chống ôxy-hóa này có mang liên kết N-H, C-O, C-H mà năng lượng liên kết nhỏ hơn nhiều năng lượng trong liên kết C-H của acid béo, khi bị ôxy-hóa nó sẽ

bị đứt trước tạo ra các gốc tự do rất kém hoạt động, như vậy chuỗi bị ngắt, bảo vệ chất béo không bị ôxy-hóa [13]

* Vai trò của chất chống ôxy-hóa

Trong thực phẩm: Trong quá trình chế biến cũng như bảo quản, thực phẩm

thường xảy ra hàng loạt các phản ứng ôxy-hóa, đặc biệt là quá trình ôxy-hóa lipid, làm biến đổi màu sắc, giá trị dinh dưỡng cũng như cảm quan của thực phẩm, sinh ra các sản

phẩm thứ cấp gây mùi khó chịu cho sản phẩm Do vậy, chất chống ôxy-hóa có tác dụng ngăn chặn quá trình ôi hóa lipid, giúp giữ lại giá trị cũng như đặc trưng của sản phẩm thực phẩm Các phụ gia thực phẩm không chỉ tạo mùi vị cho sản phẩm mà còn đóng vai trò là chất chống ôxy-hóa giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình ôxy-hóa các chất trong thực phẩm như: acid citric, acid ascorbic, acid erythorbic, vitamin C, E, nitrit, phenolics,…[44]

Trong cơ thể người [27, 44]: Chất chống ôxy-hóa có vai trò quan trọng đối với

sức khỏe con người, có khả năng ngăn chặn sự tấn công của gốc tự do lên tế bào, ngăn chặn tế bào bị hủy hoại, từ đó ngăn chặn được nhiều căn bệnh nguy hiểm do gốc tự do gây ra như tim mạch, cơ và não, ung thư, lão hóa…

Cơ thể con người có thể tự sản xuất các chất chống ôxy-hóa (chất chống ôxy-hóa nội sinh) Tuy nhiên, khi tuổi tác càng cao hoặc trong điều kiện môi trường ô nhiễm, thức

ăn chứa nhiều độc tố hoặc ăn uống không đủ chất dinh dưỡng, khoáng chất, vitamin,… làm các gốc tự do xuất hiện quá nhiều nhưng cơ thể lại không sản xuất đủ chất chống ôxy-hóa Do đó, cần bổ sung chất chống ôxy-hóa từ các sản phẩm hoặc thực phẩm bên ngoài (chất chống ôxy-hóa ngoại sinh) như beta-caroten, chất khoáng, vitamin, phenolics…từ các nguồn tự nhiên như rau cải, trái cây tươi và một số loại dược thảo

1.3.3 Một số phương pháp phân tích đánh giá hoạt tính chống ôxy-hóa

1.3.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống ôxy-hóa dựa vào khả năng khử gốc tự

do DPPH

* Nguyên tắc của phương pháp [4]:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống ôxy-hóa, nó sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt (Hình 1.10) Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng quét gốc tự do DPPH càng cao

Hình 1 10: Sơ đồ phản ứng giữa chất chống ôxy-hóa và gốc tự do DPPH [46]

- Độ hấp thụ của DPPH trong metanol và aceton giảm dưới ánh sáng [47]

- Rất nhạy cảm với ôxy và ánh sáng nên trong quá trình thực hiện, thao tác phải thật chính xác để đảm bảo phép đo có hiệu quả, đồng thời chế độ bảo quản cũng phải khắt khe để tránh sai số

1.3.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống ôxy-hóa dựa vào khả năng khử đồng (CUPRAC) [23]

* Nguyên tắc của phương pháp:

Các chất chống ôxy-hóa có khả năng khử Cu2+ thành Cu+ (Hình 1.11) Hợp chất phức tạp được hình thành giữa neocuproine và Cu+ có thể được phát hiện bởi quang phổ

và nồng độ của nó tỉ lệ thuận với khả năng chống ôxy-hóa để chuyển electron sang đồng (copper)

Hình 1 11: Cơ chế khử Cu 2+ thành Cu + của các chất chống ôxy-hóa [32]

* Ưu điểm:

- Có thể được thực hiện trong môi trường pH sinh lý (pH=7.4) trong khi phương pháp FRAP thực hiện trong môi trường dưới pH sinh lý (pH=3.6) Trong điều kiện cao hơn pH sinh lý, khả năng khử có thể bị ức chế do sự proton hóa các hợp chất chống ôxy-hóa [43]

- Phương pháp CUPRAC có khả năng xác định tất cả các hợp chất chống ôxy-hóa của các protein chứa thiol mà không thể thực hiện được bằng phương pháp FRAP [32]

1.3.3.3 Khả năng chống ôxy-hóa bằng phương pháp khử sắt (FRAP) [14]

* Nguyên tắc của phương pháp:

Chất chống ôxy-hóa sẽ khử phức Fe3+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine] (màu xanh) ở pH thấp Khi đó, cường độ màu xanh tỉ lệ với hàm lượng chất chống ôxy-hóa có trong mẫu Mức độ tăng cường màu này được đo ở bước sóng 593 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là FeSO4 hay BHT (butyllated hydrôxyl toluene) Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào môi trường chứa chất chống ôxy-hóa, các chất chống ôxy-hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ Tác động chống ôxy-hóa được đánh giá bởi sự tăng cường

độ màu phức Fe2+-TPTZ Trolox carbôxylic acid] là chất chuẩn và kết quả được biểu diễn tương đương với số mg trolox trên một g chất khô (mg TE/g)

[6-hydrôxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-Hạn chế lớn nhất của phương pháp này là phản ứng được thực hiện trong môi trường dưới pH sinh lý (pH=3.6) Hơn nữa phương pháp này không thể xác định tất cả các hợp chất chống ôxy-hóa của các protein chứa thiol [23] Ngoài ra, một phân tử chất

chống ôxy-hóa có thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc, do đó độ chính xác chưa được cao bởi kết quả tính toán ra lớn cũng không thể chắc chắn rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện cao [14]

1.4 Các phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học

Trích ly (còn gọi là chiết) là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan

ra khỏi các mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình trích ly là một dung dịch chứa các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình chiết như bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ chiết, kích thước của nguyên liệu hay nói cách khác là bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi, thời gian chiết, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu,

và đặc biệt, hiệu quả của quá trình chiết phụ thuộc rất lớn vào phương pháp chiết, phương pháp chiết khác nhau sẽ cho ra hiệu suất, chất lượng dịch chiết khác nhau Căn

cứ vào nhiều yếu tố có nhiều phương pháp chiết khác nhau, chẳng hạn như [15]: căn cứ vào nhiệt độ chiết có chiết ở nhiệt độ thường (phương pháp ngâm và ngâm kiệt) và chiết nóng (chiết liên tục hoặc chiết hồi lưu); căn cứ vào chế độ làm việc có chiết gián đoạn, chiết liên tục, bán liên tục; căn cứ vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha có chiết ngược dòng, chiết xuôi dòng, chéo dòng; căn cứ vào những biện pháp đặc biệt rút ngắn thời gian chiết như chiết siêu âm, phương pháp tạo dòng xoáy, phương pháp hỗ trợ vi sóng,…Song, để đơn giản có thể chia thành thành hai phương pháp chính là phương pháp truyền thống và phương pháp chiết hiện đại

1.4.1 Phương pháp truyền thống

1.4.1.1 Phương pháp ngâm [15]

Đây là phương pháp đơn giản và lâu đời nhất Nguyên liệu được chia nhỏ tới độ mịn thích hợp, sau đó ngâm với dung môi trong một khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong nguyên liệu hòa tan vào dung môi Sau đó rút lấy dịch chiết bằng cách gạn, ép, lắng, lọc và tiến hành rửa nguyên liệu bằng một lượng dung môi nhất định Có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi đổ ngược lại lên trên nguyên liệu

để tăng hiệu quả trích ly Tùy theo nhiệt độ trích ly chia thành:

 Ngâm lạnh: ngâm ở nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, thường áp dụng với những nguyên liệu chứa hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt

 Hãm: cho dung môi vào nguyên liệu đã xay nhỏ trong một thời gian xác định, có thể khuấy trộn, thường dùng cho hợp chất dễ tan trong thời gian ngắn ở nhiệt độ cao

 Hầm: Ngâm nguyên liệu với dung môi trong một bình kín, giữ nhiệt độ ấm trong khoảng giữa nhiệt độ phòng và nhiệt độ sôi của dung môi, có khuấy trộn Thường áp dụng với những hợp chất ít tan ở nhiệt độ thường mà dễ phân hủy ở nhiệt độ cao

Ngoài ra, tùy theo số lần ngâm, có thể chia thành:

 Ngâm đơn giản: ngâm một lần với toàn bộ dung môi

 Ngâm phân đoạn: chia dung môi ra nhiều lần rồi ngâm làm nhiều lần Sau mỗi lần ngâm, gạn lấy dịch chiết, ép bã, lại cho dung môi mới vào ngâm và làm tiếp như vậy Cuối cùng tập trung các dịch chiết lại Cùng lượng dung môi, ngâm phân đoạn rút được nhiều hoạt chất hơn ngâm đơn giản [11]

* Ưu điểm:

- Đơn giản, dễ thực hiện; thiết bị đơn giản, rẻ tiền

* Nhược điểm:

- Năng suất thấp, thao tác thủ công

- Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong nguyên liệu, hiệu suất không cao

- Nếu chiết nhiều lần (phân đoạn) thì dịch chiết loãng, tốn dung môi và thời gian

1.4.1.2 Phương pháp ngâm kiệt

Nguyên liệu được ngâm ngập trong dung môi Sau một khoảng thời gian nhất định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở dưới, sau đó cho dung môi mới vào tiếp tục chiết hoặc cho dịch chiết loãng rút được quay ngược lại, bổ sung tiếp tục vào nguyên liệu cho đến khi thu được nhiều nhất hoạt chất trong nguyên liệu.[15]

* Ưu điểm:

- Nguyên liệu được chiết kiệt

- Đơn giản, dễ thực hiện

* Nhược điểm:

- Năng suất thấp, thao tác thủ công

- Tốn nhiều thời gian

1.4.1.3 Phương pháp chiết Soxhlet [15]

Nguyên liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào buồng chiết Dung môi mới được cho vào bình đun sôi Dung môi bay hơi lên, qua bộ phận ngưng tụ (còn gọi là ống sinh hàn) gặp nước lạnh sẽ ngưng tụ và xuống lại buồng chiết, tiếp xúc với nguyên liệu Khi tràn sẽ chảy từ buồng chiết xuống lại bình đun sôi bên dưới, đi qua lớp nguyên liệu, mang theo các chất hòa tan từ nguyên liệu Tại bình đun sôi, chất tan được giữ lại, dung môi tiếp tục bay hơi và ngưng tụ, xuống lại buồng chiết Cứ như vậy cho đến khi nguyên liệu được chiết kiệt (Hình 1.12)

* Ưu điểm:

- Quá trình trích ly liên tục

- Tốn ít dung môi nhờ sự hồi lưu dung môi qua ống sinh hàn

- Dịch chiết không cần phải lọc

- Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi trong thời gian dài nên các hợp chất không bền dễ bị phân hủy

- Không thực hiện được sự khuấy trộn

- Tốn nhiều năng lượng

1.4.2 Phương pháp hiện đại

tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hòa tan đơn giản.[15]

 Hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng (Hình 1.13)

Hình 1.13: Hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng [nguồn: tác giả]

Việc áp dụng năng lượng vi sóng hỗ trợ thực hiện các phản ứng hóa học và trích

ly các hợp chất thiên nhiên đang rất được quan tâm [12], trong khi đó việc đầu tư các thiết bị vi sóng chuyên dụng tại các phòng thí nghiệm Việt Nam tốn nhiều chi phí và chưa được áp dụng rộng rãi Bằng sự kết hợp hài hòa giữa lò vi sóng gia dụng và thiết

bị Soxhlet, hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng đã được nghiên cứu và áp dụng thành công

ở quy mô phòng thí nghiệm để trích ly các hợp chất hoạt tính sinh học cũng như đặc biệt thích hợp cho chưng cất tinh dầu

* Ưu điểm:

- Rút ngắn được thời gian chiết

- Thu kiệt các hợp chất hoạt tính sinh học với hiệu suất cao do thời gian thực hiện nhanh nên ít gây phân hủy hoạt chất, đặc biệt là rất an toàn đối với những chất dễ bị phân hủy, các hợp chất tinh dầu, tạo ra sản phẩm chất lượng tốt [12]

- Tiết kiệm dung môi nhờ vào hệ thống thu hồi dung môi

- Tiết kiệm năng lượng

- Có tác dụng đặc biệt đối với các phân tử phân cực [14]

* Nhược điểm:

- Thao tác thủ công, chưa tự động hóa được trong quá trình trích ly

- Lượng mẫu nạp vào giới hạn, khó áp dụng cho quy mô công nghiệp vì chi phí đầu tư cho thiết bị tạo vi sóng là không nhỏ để có đủ công suất

1.4.2.2 Trích ly với sự hỗ trợ của siêu âm [15]

* Nguyên lý của phương pháp:

Siêu âm là một dạng sóng điện từ cao tần (>20 KHz), mà tai người không nghe (1-16 KHz) Tần số 10000 KHZ dùng trong y học; 20-100 KHz sử dụng trong kỹ thuật định vị

Khi xuyên qua cơ thể, chỉ một lượng rất nhỏ sóng siêu âm bị các mô hấp thụ và chuyển thành nhiệt năng, tuy nhiên sự tỏa nhiệt này không kéo dài, không làm tăng bề mặt nhiệt độ tại chỗ mà phần lớn nó sẽ chuyển thành cơ năng, tạo cơ chế rung Sự rung kéo dài sẽ làm vỡ các bọt khí tại chỗ, gây tổn thương tại chỗ

Trong quá trình trích ly, dưới tác dụng của siêu âm, dung môi trong các hốc nguyên liệu bị sủi bọt, đẩy chất cần chiết ra khỏi nguyên liệu, chất tan vào trong dung môi Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết.[15]

* Ưu điểm:

- Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành đơn giản, không quá đắt tiền

- Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi chiết khá đa dạng

- Giảm được nhiệt độ và áp suất, ưu điểm này được ưu tiên áp dụng để chiết các hoạt chất không bền với nhiệt

- Tăng được lượng dịch chiết và rút ngắn thời gian chiết

* Nhược điểm:

- Thời gian lọc dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất một lượng dịch chiết hoặc dịch chiết có thể bị nhiễm bẩn

- Đầu dò thiết bị thoái hóa theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết

1.4.2.3 Chiết với áp suất cao [15]

* Nguyên lý của phương pháp:

Đây là phương pháp sử dụng các dung môi thông thường như các phương pháp trích ly truyền thống khác nhưng với nhiệt độ và áp suất tương đối cao Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng dẫn đến hiệu quả trích ly cao Vì thế, trong trích ly, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ, tuy nhiên khi tăng đến nhiệt độ sôi của dung môi, dung môi hóa hơi sẽ không còn khả năng hòa tan các chất nữa

Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao để nhiệt

độ dung môi được đưa lên cao gần vùng tới hạn Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi để cho việc chiết suất hiệu quả hơn Nhiệt độ

có thể thay đổi từ 80 – 200oC và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết

* Ưu điểm:

- Có thể chiết được nhiều loại dung môi

- Thời gian ngắn

- Có thể áp dụng được trên quy mô công nghiệp do thiết bị không cần áp suất quá nghiêm ngặt như phương pháp chiết siêu tới hạn

* Nhược điểm: Thiết bị chuyên dụng, chi phí đầu tư cao

1.4.2.4 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn [15]

* Nguyên lý của phương pháp:

Trong điều kiện nhất định, các chất tồn tại ở một trạng nào đó: rắn, lỏng, khí Tuy nhiên, khi nhiệt độ và áp suất của một chất được nâng lên trên giá trị tới hạn của nó, chất

đó sẽ rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn, khi đó người ta

sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng siêu tới hạn Chất lỏng này mang những đặc tính của cả chất khí và chất lỏng: linh động như chất khí, khả năng hòa tan các chất giống chất lỏng nhưng độ nhớt và sức căng bề mặt thấp hơn chất lỏng, Điểm

mà một chất chuyển từ trạng thái bình thường sang trạng thái lỏng siêu tới hạn này được gọi là điểm tới hạn của chất đó, gồm nhiệt độ tới hạn (Tc) và áp suất tới hạn (Pc):

Ví dụ Nước có Tc = 374,20C và Pc= 220,5 bar

CO2 có Tc = 31,10C và Pc = 73,8 bar Etanol có Tc = 243,40C và Pc = 72 bar Chất lỏng thông dụng nhất hiện nay là CO2 lỏng quá tới hạn vì có điểm tới hạn thấp nên dễ đạt, dễ duy trì, an toàn, không độc hại, bền về hóa học, có thể thu hồi, thân thiện với môi trường, không làm tăng hiệu ứng nhà kính [15]

* Ưu điểm:

- Khi trích ly hoạt chất từ nguyên liệu, CO2 lỏng quá tới hạn có lợi hơn các dung môi hữu cơ thông thường ở chỗ không độc hại, nâng cao hiệu suất chiết và không để lại

dư lượng dung môi trong cao chiết [15]

- Quá trình trích ly có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp nên không làm biến đổi những thành phần kém bền với nhiệt độ, đặc biệt là việc tách chiết tinh dầu, cho hiệu suất thu hồi và chất lượng cao

- Thời gian ngắn

- Dễ áp dụng ở quy mô công nghiệp

- An toàn, thân thiện với môi trường, đặc biệt có thể thu hồi dung môi nên tiết kiệm được nhiều chi phí

* Nhược điểm:

- Một trong những nhược điểm của phương pháp này là tính phân cực của CO2

lỏng quá tới hạn: Ở các điều kiện chiết thông thường, CO2 lỏng quá tới hạn là một dung môi kém phân cực, do đó chỉ có thể dùng để chiết các chất kém phân cực Để cải thiện khả năng hòa tan các chất phân cực hơn, trong quá trình trích ly, người ta thêm vào một lượng nhất định một dung môi phân cực để thay đổi tính phân cực của dung môi để chiết các chất phân cực hơn [15] Do đó, có thể trong cao chiết vẫn còn tồn dư một lượng nhỏ các dung môi phân cực đã bổ sung vào như metanol, ethanol,…

- Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền, khó trang bị được ở quy mô phòng thí nghiệm vừa và nhỏ

- Cần theo dõi và kiểm soát nhiều thông số, cần có nhiều nghiên cứu để tìm các thông số tối ưu

1.5 Phương pháp tối ưu hóa quá trình trích ly

Hiệu quả của quá trình tách chiết phenolics cũng như chất lượng, hoạt tính dược

lý của dịch chiết phụ thuộc trực tiếp vào các yếu tố như: loại dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, nhiệt độ chiết, thời gian chiết,…Để giảm chi phí, thời gian thực hiện nghiên cứu cũng như làm rõ sự ảnh hưởng các các yếu tố đến hiệu quả và chất lượng dịch chiết, việc tối ưu hóa các điều kiện chiết là rất cần thiết để từ đó xây dựng được mô hình chiết tối ưu nhất

Các nghiên cứu tối ưu hóa truyền thống được thực hiện bằng phương pháp tối ưu đơn yếu tố hay thí nghiệm ảnh hưởng của từng cặp yếu tố không phản ánh được sự tương tác lẫn nhau giữa các yếu tố [36], tiến hành quá nhiều thí nghiệm dẫn đến tốn thời gian, chi phí nghiên cứu

Để khắc phục vấn đề này, phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện chiết phenolics từ rễ cây An xoa Phương pháp này được đánh giá

là công cụ mạnh để tối ưu hóa giá trị các yếu tố, làm cho hàm đáp ứng cực đại [9] Việc

sử dụng phương pháp này kết hợp với phần mềm chuyên dụng JMP (Phiên bản 11, SAS Campus Drive, Cary, NC, USA) đã giảm được thời gian nghiên cứu, giảm đáng kể số lượng thí nghiệm hơn so với phương pháp truyền thống, đồng thời có thể lựa chọn được một điều kiện tối ưu dựa trên mô thu được [35]

* Khái niệm [8]: Phương pháp này đã được giới thiệu bởi Box và Wilson vào

năm 1951.Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm để xác định và giải thích phương trình nhiều biến

Người ta gọi là bề mặt đáp ứng vì là hàm mục tiêu của một quá trình vật lí không gian – thời gian Đặc tính được nghiên cứu hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự chuyển đổi bằng một chức năng đáp ứng (hay còn gọi là chức năng chuyển đổi) Sự thay đổi giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đổi chức năng của hàm mục tiêu Những mô hình thí nghiệm bề mặt đáp ứng lưu ý đến sự lựa chọn các biến độc lập, xác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai số Những biến đầu vào Xi (i=1,2…,n) được gọi là những biến cơ sở Trong trường hợp chung, những biến Xi là những biến thay đổi theo không gian – thời gian Việc điều chỉnh hàm mục tiêu phải dựa trên cơ sở của những thí nghiệm thực nghiệm và hệ tính toán các sai số, nó cho phép ta suy ra được các thông số

Xk (k=1,2,…) Sự biểu diễn hình học của chức năng đáp ứng dưới dạng một đường cong, một mặt phẳng gia tăng được gọi là bề mặt đáp ứng [8]

* Công dụng của RSM [40]

Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) được dùng để khảo sát mối quan hệ giữa một hay nhiều biến đáp ứng và một tập hợp các biến thực nghiệm Phương pháp này thường được áp dụng sau khi đã xác định một số yếu tố quan trọng có thể kiểm soát được và muốn tìm các giá trị của các yếu tố để có hàm đáp ứng tối ưu Phương pháp bề mặt đáp ứng có thể được dùng để:

 Tìm các giá trị của yếu tố (các điều kiện tiến hành) cho hàm đáp ứng tốt nhất

 Tìm các giá trị của yếu tố thỏa mãn các đặc điểm của quá trình

 Xác định những điều kiện tiến hành mới giúp cải thiện chất lượng sản phẩm so với những điều kiện hiện tại

 Mô hình hóa mối quan hệ giữa các yếu tố định lượng với hàm đáp ứng

* Ưu điểm:

- Rút ngắn thời gian nghiên cứu

- Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm, tiết kiệm mẫu, chi phí

- Đánh giá được tác động qua lại của các yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu

- Mang tính thực tế vì số liệu được lấy từ thực nghiệm Có thể áp dụng cho bất kì

hệ thống nào có biến đầu vào và mục tiêu đầu ra

- Thực hiện dễ dàng, nhanh chóng