tối ưu hóa quy trinh chiết xuất và xây dựng phương pháp đinh lượng carthamin trong hoa hồng hoa (flos carthami tinctorii)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - U TỐI U VÀ XÂY DỰ G P Ố QUY TRÌ C IẾT XUẤT Ơ G P ÁP ĐỊ ỢNG CARTHAMIN TRONG HOA HỒNG HOA (Flos Carthami tinctorii) U V T CS ỢC C THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - U TỐI U OÁ QUY TRÌ VÀ XÂY DỰ G P C IẾT XUẤT Ơ G P ÁP ĐỊ ỢNG CARTHAMIN TRONG HOA HỒNG HOA (Flos Carthami tinctorii) Ngành: K M ố Độ ố: 8720210 U V T CS ỢC C NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS GUY PGS TS U GUY THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 CT Y Đ C TUẤ IC ĐO T C ố ế ậ ố L L K T T T L ậ TỐI –K 2017 – 2019 N :K ố Độ – M ố: 8720210 U QUY TRÌ C IẾT UẤT V Y Ự GP Ơ G P ÁP ĐỊ Ợ G C RT I TRO G O Ồ G O (Flos Carthami tinctorii) L L K N ẫ : TS N H L T PGS TS N Đ T Đ Hoa (Flos Carthami tinctorii) Hồng hoa (Carthamus tinctorius L., A ộ ều trị b nh m ch vành, uyết áp ố b ến kinh nguy Carthamin ộ quinochalcon C-glycosid, ắ ố ỏ c ch ng minh có ề tác d ng sinh học M c tiêu ề ố ế ằ ề JMP ề B – Behnken; xây d ị ng carthamin bằ ắc ký lỏng hi – góp ph n nâng cao tiêu chuẩn ki m nghi Hồ Đố : carthamin nhóm sắc tố ỏ Mẫu thử: hoa Hồng hoa (Flos Carthami tinctorii) t tiêu chuẩ DĐVN V : quy ị ằ ắ ỏ ; k ế ố ế ế carthamin, ế ố quy trình ế ề JMP ề B – Behnken; kết qu c a thử nghi c ng d ế carthamin t hoa Hồng hoa Kết x :q , với kho ng tuyến tính 1,0 – 20,0 ppm (R = 0,9996 ; ộ xác cao (RSD = 1,02 %); ộ ú ới tỷ l thu hồi 100,07 % (RSD  0,93 %) Kết khảo sát t ó ết xuất carthamin: 100 mg hoa Hồng hoa, ều ki n chiết xu t tố ộ dung dịch ế natri carbonat 3,0 %; th tích acid citric 40 % 2,0 ml dung môi gi i h p aceton – ớc (4 : 1) ế ấ v ế ộ ế 98,0 %) ết xu t carthamin t hoa Hồng hoa Xây d ng ị ng carthamin bằ HPLC Quy trình có tính chọn lọc, kho ng tuyến tính rộ ộ ộ ú c áp d ị ng carthamin Hồ Tố ABSTRACT M ’ – Academic course: 2017 – 2019 Speciality: Drug quality control and toxicology Code: 8720210 OPTIMISATION OF THE EXTRACTION CONDITIONS AND DETERMINATION OF CARTHAMIN FROM FLOWER OF SAFFLOWER (Flos Carthami tinctorii) Luu Le Khanh Supervisors: Ph.D Nguyen Huu Lac Thuy Assoc Prof Nguyen Duc Tuan Introduction The florets of Carthamus tinctorius is a valuable herbal In the pharmaceutical industry, this herbal are used in the treatment of cardiovascular effects, blood circulation, blood pressure, antioxidant effects, protecting the liver, menstruation and menorrhagia Carthamin is a quinochalcon C–glycoside, it represents the red pigments which have the biological effects This study was carried out to find the most effective to optimize the process of carthamin extraction by using JMP software with the Box – Behnken surface response model and determination of carthamin from florets of safflower by HPLC Marterials and Methods Marterials: carthamin and red pigment from the Flos Carthami tinctorii Methods: development and validation of quantitative procedure carthamin from florets of Carthamus tinctorius is conducted by HPLC method The process of extraction of red pigment was optimized by employing JMP 10.0 software, in which the conditions were established following the Box – Behnken design The extracted and purified carthamin with high purity (> 98,0 %) Results This procedure was developed and validated, to meet all requirements of system suitability, selectivity, linearity range are 1.0 – 20.0 ppm (R2 = 0.9996), high precision (RSD = 1,02 %) and accuracy (the recoveries in the range of 98.0% – 102.0% of the expected values) With 100 mg florets of safflower, the optimal extraction process include 3.0% sodium bicarbonate, 2.0 ml of 40% citric acid and acetone - water (4: 1) solvent as the desorption solvent The extraction process is of high purity carthamin (> 98,0 %) Conclusion The optimization extraction procedure and the simple HPLC method for carthamin quantitation in safflower were successfully developed and validated The process is selective, wide linear range, high precision and accuracy could be applied for routine analysis and contribute to enhance specification of Carthamus tinctorius in Viet Nam C IC T C ĐO i T T ii ABSTRACT iii C C iv C CÁC I U C C CÁC C CÁC VIẾT T T vi G vii Ì viii C CÁC SƠ ĐỒ ix C CÁC I U ĐỒ ix Đ U C Ơ G TỔNG QUAN TÀI LI U 1 TỔNG QUAN VỀ HỒNG HOA MỘT SỐ PHƯ NG PHÁP Đ NH TÍNH VÀ Đ NH LƯỢNG HOẠT CH T TRONG HOA HỒNG HOA 12 Mộ ố ị 12 2 Mộ ố u ị t ch t Hồng hoa 12 MỘT SỐ NGHI N C U VỀ CHIẾT XU T PH N LẬP CH T TINH KHIẾT T HỒNG HOA 14 1.3.1 Phân lậ ắ ố 14 1.3.2 Phân lậ ắ ố ỏ 14 TỔNG QUAN VỀ TỐI ƯU HOA QUY TR NH CHIẾT XU T 15 1.4.1 Xây d ng quy ho ch th c nghi m d ng bề m t 15 142 ố 17 C Ơ G ĐỐI T Ợ G V P Ơ G P ÁP G I C U 19 ĐỐI TƯỢNG NGHI N C U – NGUY N VẬT LI U 19 1 Đố 19 212 N 19 213 D t 20 2.1.4 D ng c , trang thiết bị 20 2 PHƯ NG PHÁP NGHI N C U 21 2.2.1 Xây d ng thẩ ị ị ng carthamin hoa Hồng hoa bằ ắc ký lỏng hi 21 2 Tố ế hoa Hồng hoa 23 2.2.3 Chiế 26 224 Đ 28 225 ị Hồ 29 C Ơ G ẾT QU G I C U 31 X Y D NG VÀ TH M Đ NH QUY TR NH Đ NH LƯỢNG CARTHAMIN BẰNG PHƯ NG PHÁP SẮC K LỎNG HI U NĂNG CAO 31 3.1.1 Kết qu kh ều ki n sắc ký 31 3.1.2 Thẩ ịnh quy trình phân tích 36 3.2 TỐI ƯU H A QUY TR NH CHIẾT CARTHAMIN 41 Kế ộ ị ế 41 2 Kế ế 42 3 Kế ị ế 42 Kế H ị ế 43 Kế ố 43 Kế ỷ 44 Kế 45 328 C ọ ế ố ộ ố 45 329 T ế B –B ằ ề JMP 46 3 CHIẾT XU T PH N LẬP CARTHAMIN TRONG HOA HỒNG HOA 51 331 C ế 51 3.3.2 Phân lập 51 3.3.3 Xác ị ộ ế a tinh th X 53 3 Kế ị X 55 ĐÁNH GIÁ CARTHAMIN 56 NG DỤNG QUY TR NH Đ NH LƯỢNG SẮC TỐ ĐỎ CARTHAMIN TRONG HOA HỒNG HOA 57 C Ơ G U 60 ẾT U V Đ T I I UT P C G Ị 64 O C CÁC C Abs ACN As Box Behnken DĐVN V DOE HPLC HSYA ICH IR JMP ’ LCESI/MSMS LOD LOQ MS N NMR PDA Rs RSD S SKĐ SKLM STĐ tR UV - Vis I U C T Absorbance Acetonitril Asymmetry Response Surface Design Box Behnken Design of Experiment High performance liquid chromatography Hydroxysafflor yellow A International Conference on Harmonisation Infrared Spectroscopy JMP of SAS Institute Capacity factor Liquid Chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry Limit of detection Limit of quantification Mass spectrometry Theoretical Plates Nuclear Magnetic Resonance Photodiode array Resolution Relative standard deviation Peak area Retention Time Ultraviolet - Visible VIẾT T T V Độ H ố M ố D C Sắ V N ế ế H ề ỏ ộ ố ế Quang ổ P ề ế H ố Sắ Gớ Gớ K ố Số Cộ D Độ Độ D Sắ Sắ Sắ ố T Tử V ố ế ổ ị ổ ế ế ẩ ỏ ỏ –K ế ố i C CÁC ố .26 B ng 3.2 Kết qu kh ộng với cột sắc ký C8, C18, phenyl hexyl 31 B 21 M B 3 Kế B 34 C ậ G ộ ột phenyl hexyl 33 ửa gi i .35 B ng 3.5 Kết qu kh thống mẫ ố ế .35 B ng 3.6 Kết qu kh o sát kho ng tuyến tính c a carthamin 38 B ng 3.7 Kết qu kh ộ l p l i 39 B ng 3.8 Kết qu ki ộ xác trung gian 39 B ng 3.9 Kết qu kh ộ ú 40 ịnh quy trình 40 B ng 3.10 Tóm tắt kết qu thẩ B ng 3.11 Kết qu kh B ng 3.12 Kết qu kh ộ ịch chiết natri carbonat .41 ết .42 B ng 3.13 Kết qu kh o sát th tích dung môi chiết natri carbonat 42 B ng 3.14 Kết qu kh o sát th tích acid citric 40 % pH dịch chiết 43 B ng 3.15 Kết qu kh o sát khố ng cellulose 43 44 B ng 3.16 Kết qu kh o sát dung môi h B ng 3.17 Kết qu kh o sát th tích dung mơi chiết 45 B 18 M ộ ếu tố ố B 19 Kế B 20 Kế ố B 21 Đ B 22 Kế .45 46 ế ế ố ế ố 47 ố 48 .50 B ng 3.23 Kết qu ki m tra 50 B 24 D B 25 Kế ổ UV - V ị B ng 3.26 So sánh kết qu B ng 3.27 Kết qu ng d ị IR MS X 55 ị ằ HPLC 56 ng carthamin HPLC, UV – Vis 57 ị ng carthamin 57 i C CÁC Ì Hình 1.1 Hoa Hồng hoa .3 H 12 C ú ọ ộ ố ậ Hình 1.3 Các quinochalcon C - glycosid phân lậ Hồ c t Flos Carthami tintorii H 14 C ú ọ .6 H 15 C ú ọ H Mộ ố ế ẩ H Mộ ố ế ẩ Hồ ị Hồ Hình 1.8 Mộ ố ị ờ .11 11 c nghi m 16 H Mẫ Hồ H 10 SKĐ ẫ ộ ị ột C8) .32 H 11 SKĐ ẫ ộ ị ột C18) 32 H 12 SKĐ ẫ ộ ị phenyl hexyl) 33 H 13 SKĐ ộ 34 H 14 Sắ .19 ề ộ ộ 36 ố Hình 3.15 Phổ UV c H 16 Độ tinh khiết c H 17 Đồ thị bi u di H 18 M H 19 Đ H 20 M 36 ố ế 37 a di ế ố ơ ộ carthamin 38 47 ế ề Hình 3.21 Kết qu tố H ế ố 48 ế ố 49 ều ki n chiết xu t carthamin 50 22 K ố 52 Hình 3.23 Sắ ộ ế H ộ ế 24 Sắ a tinh th X 53 X ằ HPLC 54 P ụ ụ 11 S ế ị Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn HPLC UV – Vis) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn P ụ ụ Kế ị Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ộ ố ẫ ị Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn P ụ ụ D P ổ MS ổ ố ố ế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ế PL-47 P ổ IR ố ế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-48 P ổ 1H – NMR ố ế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-49 P ổ 13C – NMR ố ế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn P ổ DEPT ố ế P ổ COSY ố ế P ổ HMBC ố ế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn P ổ HSQC ố ế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn P ụ ụ SKĐ S Đ ị ộ r â Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ế ẫ ậ X P ổ UV P ổ UV Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn X ố ế PL-54 P ổ IR ủ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 55 P ổ S ủ T Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn X 56 P ụ ụ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn r ... tinh khiết ? ?Tối ưu hóa quy trình chiết xuất x y ổ ịnh, ề tài: n phư n ph p nh lượn carthamin hoa Hồn hoa (Flos Carthami tinctorii)? ?? sau: ị 1- Xây d ng thẩ hoa bằ ị ng carthamin hoa Hồng sắc ký...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - U TỐI U OÁ QUY TRÌ VÀ XÂY DỰ G P C IẾT XUẤT Ơ G P ÁP ĐỊ ỢNG CARTHAMIN TRONG HOA HỒNG HOA (Flos Carthami tinctorii). .. ũ ề xu t vi c xây d ị carthamin Hồng hoa, bổ sung thêm ch ị ng carthamin ng c li - Đ Kết qu r ị ng carthamin Hồng hoa bằ ị kê nhằ ắ ề xu ố ỏ ằ tiêu chuẩn ch ng Hồng hoa ro ơng pháp UV –Vis [4]