Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột nghệ vàng (curcuma longa l , zingiberaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ ĐOÀN XUÂN TUYỀN XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID TỪ DƯ PHẨM BỘT NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L., Zingiberaceae) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS VĨNH ĐỊNH Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn Đoàn Xuân Tuyền LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn đến Thầy PGS.TS Vĩnh Định Cô TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy ln tận tâm bảo, góp ý dành thời gian chỉnh sửa để em hoàn chỉnh luận văn Kính gửi lời cảm ơn chân thành đến tồn thể quý Thầy Cô khoa Dược – Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, q Thầy Cơ mơn Phân Tích – Kiểm Nghiệm dành trọn tâm huyết để truyền đạt kiến thức; hướng dẫn, giúp đỡ suốt khóa học thực đề tài Trân trọng cảm ơn quý Thầy Cô phản biện, quý Thầy Cơ Hội đồng dành thời gian tìm hiểu nhận xét giúp em hoàn thiện luận văn Trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm tỉnh Bình Dương tạo điều kiện, giúp đỡ, hỗ trợ cho tơi hồn thành khóa học Chân thành cảm ơn DS.CK1 Nguyễn Khắc Sơn – công ty TNHH THƯƠNG MẠI VÀ DỊCH VỤ KHANG MINH (TP Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk) tài trợ thực nghiên cứu Xin cảm ơn Thầy TS Phan Văn Hồ Nam tạo điều kiện thuận lợi dụng cụ, giúp đỡ em bạn chủ động thời gian suốt trình thực đề tài phịng thí nghiệm Cảm ơn anh chị kỹ thuật viên môn, bạn DCQ2014 đồng hành Cảm ơn tập thể lớp CH Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất (2017 – 2019); anh chị em Khoa Dược phẩm – Mỹ phẩm, Khoa Vi sinh – Đông Dược Trung tâm Kiểm nghiệm Bình Dương ln gắn bó, giúp đỡ suốt thời gian qua Và tất yêu thương, xin cảm ơn gia đình động viên đồng hành đặc biệt giai đoạn khó khăn q trình thực luận văn Mặc dù cố gắng để thực hiện, song luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót, mong góp ý Thầy để luận văn hoàn chỉnh Một lần nữa, xin trân trọng cảm ơn! i TÓM TẮT Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2017 – 2019 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID TỪ DƯ PHẨM BỘT NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L., Zingiberaceae) Đoàn Xuân Tuyền Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Vĩnh Định Đặt vấn đề Thân rễ Nghệ vàng tươi (Rhizoma Curcumae longae) sau thu lấy tinh bột, phần bã (dư phẩm) chứa nhiều curcuminoid Để tận thu nguồn dư phẩm việc chiết xuất curcuminoid, đề tài thực nhằm đánh giá hàm lượng; khảo sát yếu tố tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm hỗ trợ phần mềm JMP 10.0 Quy trình ứng dụng để chiết xuất, tinh chế thu curcuminoid có hàm lượng cao phân lập thành phần tinh khiết Đối tượng - phương pháp nghiên cứu Đối tượng: curcuminoid dư phẩm Nghệ vàng Phương pháp: đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm, khảo sát yếu tố ảnh hưởng tối ưu hóa quy trình chiết curcuminoid xuất hỗ trợ phần mềm JMP 10.0, mơ hình đáp ứng bề mặt Box-Behnken Sản phẩm sau chiết xuất tinh chế đạt hàm lượng ≥ 95 % phân lập thành phần tinh khiết Kết Điều kiện tối ưu thu để chiết curcuminoid từ dư phẩm: thời gian chiết môi trường kiềm 30 phút, nồng độ dung dịch natri hydroxyd 0,05 M dịch kiềm acid hóa đến pH Kết chiết xuất đánh giá tính lặp lại quy trình thu hàm lượng curcuminoid 7,26 ± 0,099 % phù hợp với giá trị dự đoán 7,31 % Sản phẩm tinh chế methanol – nước (5:1) chứa hàm lượng curcuminoid 95,1 %, phân lập hợp chất tinh khiết định tính xác định hàm lượng CUR (98,1 %), DMC (99,1 %) BDMC (98,5 %) Kết luận Việc chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột Nghệ vàng với quy trình chiết xuất đơn giản góp phần tăng giá trị kinh tế cho người nông dân trồng nghệ Từ khóa: curcuminoid, Curcuma longa L., tối ưu hóa, Box-Behnken, JMP 10.0 ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2017 – 2019 Speciality: Drug quality control and toxicology Code: 8720210 DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION OF CURCUMINOIDS EXTRACTION FROM TURMERIC POWDER RESIDUES (Curcuma longa L., Zingiberaceae) Doan Xuan Tuyen Supervisors: Assoc Prof Vinh Dinh Background Fresh turmeric root (Rhizoma Curcumae longae), after separating the starch, the residue (residues) contain a lot of curcuminoid In order to utilize this source of curcuminoids extract, the study was conducted to evaluate the content; to investigate the factors and to optimize the curcuminoids extraction from the residue under the support of JMP 10.0 software The process is applied to extract, refine curcuminoid with high content and isolate the pure ingredients Materials – Methods Materials: curcuminoids in yellow turmeric powder residues Methods: evaluation of curcuminoids content in yellow turmeric powder residues, investigating the factors affecting curcuminoids extraction and optimization of extraction under the support of JMP 10.0 software, Box-Behnken surface response model The product is purified with content ≥ 95% and isolated the pure ingredients Result The optimal conditions for curcuminoids extraction from residues: alkaline extraction time: 30 minutes, sodium hydroxyde solution concentration: 0.05 M and acidification pH: The extracted results evaluate the repeatability of the proces to obtain a curcuminoid content of 7.26 ± 0.099% consistent with the predicted value of 7.31% The product is refined by methanol – water (5:1) with curcuminoids content 95.1%, isolate pure compounds that are qualitative and determine CUR (98.1%), DMC (99.1%) and BDMC (98.5%) Conclusion The extract of curcuminoids from the yellow powder residues which simple process will contribute to increasing economic value for turmeric farmers Keywords: Curcuminoid, Curcuma longa L., Optimization, Box-Behnken, JMP 10.0 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NGHỆ VÀNG 1.2 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT CURCUMINOID 1.3 TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CURCUMINOID 10 1.3.1 Phương pháp chiết xuất thường quy 10 1.3.2 Phương pháp chiết xuất kết hợp sử dụng tối ưu hóa phần mềm 12 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CURCUMIN VÀ TINH CHẾ CURCUMINOID 16 1.4.1 Một số phương pháp phân lập curcumin 16 1.4.2 Một số phương pháp tinh chế curcuminoid 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU THỬ NGHIỆM 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1 Thu thập xử lý mẫu 19 2.3.2 Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm bột nghệ vàng 20 2.3.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid 22 2.3.4 Ứng dụng chiết xuất, phân lập curcuminoid từ dư phẩm 25 i Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DƯ PHẨM BỘT NGHỆ VÀNG 29 3.2 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID 32 3.2.1 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình 32 3.2.2 Kết tối ưu hóa quy trình chiết xuất phần mềm JMP 10.0 36 3.2.3 Đánh giá quy trình chiết xuất tối ưu hóa 40 3.3 ỨNG DỤNG CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CURCUMINOID 42 3.3.1 Chiết xuất curcuminoid 42 3.3.2 Tinh chế sản phẩm 43 3.3.3 Phân lập thành phần tinh khiết hỗn hợp curcuminoid 46 3.3.4 Đánh giá chất phân lập 48 3.4 BÀN LUẬN 58 3.4.1 Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm bột nghệ vàng 58 3.4.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất phần mềm JMP 10.0 59 3.4.3 Ứng dụng chiết xuất phân lập curcuminoid 61 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 KẾT LUẬN 64 ĐỀ NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên Tiếng việt BDMC Bisdemethoxycurcumin Curcumin III CTPT Công thức phân tử CUR Curcumin Curcumin DMC Demethoxycurcumin Curcumin II DSC Differential scanning calorimetry Phân tích nhiệt quét vi sai Hàm lượng nguyên trạng HL NT HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IR Infrared Spectra Quang phổ hồng ngoại Khối lượng phân tử KLPT LC_MS Liquid chromatography-mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ Rf Retention factor Thừa số chậm (Hệ số di chuyển) SKLM Sắc ký lớp mỏng SKĐ Sắc ký đồ TB Trung bình TLTK Tài liệu tham khảo tt : tt thể tích : thể tích UV - Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến USP The United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Trang Hình 2.1 Cấu trúc hóa học hợp chất curcuminoid .7 Hình 2.2 Cấu trúc số thành phần khác hỗn hợp curcuminoid Hình 2.3 Cấu trúc dạng ceton (A) enol (B) curcuminoid .9 Hình 3.4 Một số phận Nghệ vàng mẫu thử .19 Hình 3.5 Mơ hình tương quan yếu tố với hàm lượng curcuminoid 37 Hình 3.6 Mức độ ảnh hưởng yếu tố hàm lượng curcuminoid 37 Hình 3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng curcuminoid .38 Hình 3.8 Mơ hình đáp ứng bề mặt thể yếu tố 39 Hình 3.9 Sự tương tác yếu tố 39 Hình 3.10 Các điều kiện tối ưu quy trình 40 Hình 3.11 Sản phẩm kết tinh (A): methanol – nước (5 : 1) (B): isopropanol – n-hexan (1 : 1,5) 45 Hình 3.12 Cột sắc ký rửa giải phân đoạn hỗn hợp curcuminoid 46 Hình 3.13 Tinh thể hình thành phân đoạn PĐ1, PĐ3, PĐ5 47 Hình 3.14 Tinh thể PĐ1, PĐ3, PĐ5 kính hiển vi 48 Hình 3.15 SKLM chất phân lập hệ dung môi ánh sáng thường 48 Hình 3.16 Phổ UV-Vis CUR đối chiếu PĐ1 49 Hình 3.17 Phổ UV-Vis DMC đối chiếu PĐ3 .49 Hình 3.18 Phổ UV-Vis BDMC đối chiếu PĐ5 50 Hình 3.19 Công thức cấu tạo CUR, DMC BDMC .54 Hình 3.20 Sắc ký đồ, đường bình đồ PĐ1 .55 Hình 3.21 Sắc ký đồ, dường bình đồ PĐ3 .56 Hình 3.22 Sắc ký đồ, đường bình đồ PĐ5 .57 Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng quát chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột nghệ vàng 22 Sơ đồ 3.2 Quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm .42 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tính chất vật lý đặc trưng curcuminoid .9 Bảng 3.2 Kết kiểm tra tính thích hợp hệ thống 29 Bảng 3.3 Kết xây dựng đường tuyến tính .30 Bảng 3.4 Tóm tắt kết định lượng curcuminoid mẫu T1, T2, T3 30 Bảng 3.5 Kết khảo sát dung dịch kiềm 32 Bảng 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ natri hydroxyd 32 Bảng 3.7 Kết khảo sát dung dịch acid để acid hóa 33 Bảng 3.8 Kết khảo sát ảnh hưởng pH dịch kiềm sau acid hóa 33 Bảng 3.9 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết môi trường kiềm 34 Bảng 3.10 Kết ảnh hưởng thời gian lắng tủa 34 Bảng 3.11 Kết định lượng curcuminoid theo mơ hình Box-Behnken 36 Bảng 3.12 Kết chiết xuất curcuminoid theo điều kiện tối ưu hóa 41 Bảng 3.13 Kết chiết xuất curcuminoid 42 Bảng 3.14 Kết khảo sát số dung mơi hịa tan loại tạp 43 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hàm lượng curcuminoid sản phẩm 44 Bảng 3.16 Hàm lượng curcuminoid sản phẩm kết tinh hỗn hợp methanol - nước (5 : 1) hỗn hợp isopropanol – n-hexan (1 : 1,5) 45 Bảng 3.17 Kết khai triển sắc ký 47 Bảng 3.18 Kết kiểm tra độ tinh khiết chất PĐ1, PĐ3, PĐ5 SKLM .49 Bảng 3.19 Các nhóm chức PĐ1, PĐ3 PĐ5 suy từ phổ IR 50 Bảng 3.20 Phổ 1H-NMR (DMSO – d6, 500 MHz) PĐ3 so với TLTK 51 Bảng 3.21 Phổ 13C-NMR (DMSO – d6, 125 MHz) PĐ3 so với TLTK 52 Bảng 3.22 Phổ 1H-NMR (DMSO – d6, 500 MHz) PĐ5 so với TLTK 53 Bảng 3.23 Phổ 13C-NMR (DMSO – d6, 125 MHz) PĐ5 so với TLTK 53 Bảng 3.24 Kết xác định hàm lượng PĐ1 56 Bảng 3.25 Kết xác định hàm lượng PĐ3 56 Bảng 3.26 Kết xác định hàm lượng PĐ5 57 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-48 Phụ lục 19 Phổ UV-Vis đối chiếu BDMC PĐ5 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-49 Phụ lục 20 Phổ IR chất phân lập Phổ IR PĐ1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-50 Phổ IR PĐ3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-51 Phổ IR PĐ5 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-52 Phụ lục 21 Phổ NMR chất phân lập Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) DMC theo TLTK [13] Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-53 Phổ 13C-NMR (DMSO, 500 MHz) DMC theo TLTK [13] Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-54 Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) BDMC theo TLTK [13] Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-55 Phổ 13C-NMR (DMSO, 500 MHz) BDMC theo TLTK [13] Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-56 Phổ 1H-NMR PĐ1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-57 Phổ 13C-NMR PĐ1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-58 Phổ 1H-NMR PĐ3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-59 Phổ 13C-NMR PĐ3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-60 Phổ 1H-NMR PĐ5 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-61 Phổ 13C-NMR PĐ5 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-62 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... [8] Từ đ? ?, đề xuất quy trình chiết xuất curcuminoid tối ưu 2.3.4 Ứng dụng chiết xuất, phân l? ??p curcuminoid từ dư phẩm 2.3.4.1 Chiết xuất curcuminoid: - Mục đích: chiết xuất curcuminoid từ mẫu dư. .. 2,7 4 2,6 7 2,3 8 2,2 2 2,0 2 1,5 9 DMC 1,4 3 1,4 5 1,3 2 1,3 5 1,3 1 1,1 6 BDMC 0,7 2 0,7 5 0,6 9 0,7 2 0,7 2 0,6 5 Tổng 4,8 9 4,8 6 4,3 9 4,2 9 4,0 5 3,4 0 Nhận xét: kết bảng 3.9 cho thấy mẫu chiết thời gian dài,... phụ l? ??c 4) Hàm l? ?ợng (%) NaOH 0,0 1 M NaOH 0,0 25 M NaOH 0,0 5 M NaOH 0,0 75 M NaOH 0,1 M CUR 0,1 4 1,3 2 1,5 8 1,9 1 1,5 8 DMC 0,4 0 0,7 6 0,8 1 0,9 6 0,7 2 BDMC 0,3 7 0,4 6 0,4 9 0,5 8 0,4 2 Tổng 0,9 1 2,5 4 2,8 7