Tối ưu hóa quy trình chiết xuất và định lượng đồng thời 3 ginsenosid rb1, re, rg1 trong dịch chiết sâm hoa kỳ (panax quinquefolius l ), dùng làm nguyên liệu điều chế xà phòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ T ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THANH TUYỀN TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID Rb1, Re, Rg1 TRONG DỊCH CHIẾT SÂM HOA KỲ (Panax quinquefolius L.), DÙNG LÀM NGUYÊN LIỆU ĐIỀU CHẾ XÀ PHÒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THANH TUYỀN TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID Rb1, Re, Rg1 TRONG DỊCH CHIẾT SÂM HOA KỲ (Panax quinquefolius L.), DÙNG LÀM NGUYÊN LIỆU ĐIỀU CHẾ XÀ PHÒNG Ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS DS NGÔ KIẾN ĐỨC Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan dây cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019 Nguyễn Thanh Tuyền Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2017 – 2019 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất – Mã số: 8720210 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID Rb1, Re, Rg1 TRONG DỊCH CHIẾT SÂM HOA KỲ (Panax quinquefolius L.), DÙNG LÀM NGUYÊN LIỆU ĐIỀU CHẾ XÀ PHÒNG Nguyễn Thanh Tuyền Thầy hướng dẫn: TS Ngơ Kiến Đức Từ khóa: Sâm Hoa Kỳ, ginsenosid, Panax quinquefolius L., xà phòng sâm Hoa Kỳ Mở đầu: Với mong muốn kiểm soát hàm lượng ginsenosid chế phẩm từ sâm Hoa Kỳ đảm bảo chất lượng hiệu sản phẩm này, tạo thành phẩm xà phịng có chứa sâm Hoa Kỳ để hỗ trợ bảo vệ, phòng bệnh làm đẹp cho người, đề tài “Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất định lượng đồng thời ginsenosid Rb1, Re Rg1 dịch chiết sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.), dùng làm nguyên liệu điều chế xà phòng” thực Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Sâm Hoa Kỳ Wisconsin (Panax quinquefolius L.) Phương pháp nghiên cứu: Xác định điều kiện phân tích thẩm định quy trình định lượng đồng thời ginsenosid Rb1, Re Rg1 dịch chiết sâm Hoa Kỳ phương pháp HPLC với đầu dị PDA Khảo sát tìm điều kiện chiết xuất tối ưu ginsenosid sâm Hoa Kỳ Xây dựng quy trình điều chế xà phịng sâm Hoa Kỳ Xây dựng tiêu chuẩn xà phòng theo TCVN 2224 : 1991 Kết quả: Đã thẩm định phương pháp định lượng đồng thời ginsenosid Re, Rg1 Rb1 sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.) phương pháp HPLC/ PDA Đã tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid sâm Hoa Kỳ với hàm lượng cao 74,68 mg/g chiết ethanol 69,43% với tỉ lệ dung môi/ dược liệu 51,44:1 6,10 Xây dựng tiêu chuẩn sở cao lỏng sâm Hoa Kỳ phục vụ cho hướng nghiên cứu điều chế chế sẩn phẩm khác Xây dựng quy trình điều chế tiêu chuẩn sở cho xà phòng bánh lỏng chứa sâm Hoa Kỳ Kết luận: Kết nghiên cứu ứng dụng kiểm nghiệm để định lượng đồng thời ginsenosid Rb1, Re Rg1 Xây dựng bán thành phẩm cao lỏng sâm Hoa Kỳ làm tiền đề cho hướng nghiên cứu điều chế chế phẩm Đề tài cịn ứng dụng việc điều chế xà phịng có sâm Hoa Kỳ góp phần đưa thêm chế phẩm phục vụ cho nhu cầu mỹ phẩm người tiêu dùng Master’s thesis – Academic course: 2017 – 2019 Specialty: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210 OPTIMIZING THE EXTRACTION CONDITIONS AND QUANTIFYING SIMULTANEOUSLY GINSENOSID Rb1, Re AND Rg1 IN AMERICAN GINSENG EXTRACT (Panax quinquefolius L.), USED AS AN INGREDIENT SOAP MAKING Nguyen Thanh Tuyen Supervisor: Dr Ngo Kien Duc Keywords: American ginseng, ginsenosides, Panax quinquefolius L., American ginseng soap Introduction: With the desire to control the content of ginsenosides in US ginseng products to ensure the quality and effectiveness of these products, as well as create a soap product containing US ginseng to support protection, prevention and beauty for everyone, the topic "Optimizing the extraction conditions and quantifying simultaneously ginsenosid Rb1, Re and Rg1 in American ginseng extract (Panax quinquefolius L.), used as an ingredient soap making” is done Materials and methods Materials: Wisconsin American ginseng (Panax quinquefolius L.) Methods: Determining conditions for analyzing and verifying the simultaneous quantitative process of ginsenosides Rb1, Re and Rg1 in American ginseng extract by HPLC method with PDA probe Survey to find the optimal extraction conditions for ginsenosides in American ginseng Building process of preparing American ginseng soap Testing the soap according to TCVN 2224: 1991 Results: Simultaneous quantitative determination of ginsenosid Re, Rg1 and Rb1 in American ginseng (Panax quinquefolius L.) by HPLC / PDA method Optimized conditions for ginsenoside extract in American ginseng with the highest content of 74.68 mg/g when extracted with ethanol 69.43% with solvent/medicinal ratio 51.44: in 6.10 hours Building standards of American ginseng liquid base for researching and preparing different products Formulated a standardized process and foundation standard for US ginseng liquid soap and bakery soap Conclusion: Research results can be applied in tests to simultaneously quantify the ginsenosides Rb1, Re and Rg1 Constructing semi-finished liquid product of American ginseng liquid is a prerequisite for researching and preparing the next preparations The project can also be applied in the preparation of American ginseng soap, contributing to adding a preparation to serve the cosmetic needs of consumers i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VI T TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ vii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 SÂM HOA KỲ 1.1.1 Phân loại thực vật 1.1.2 Mô tả thực vật phân bố 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Công dụng 1.2 TỐI ƯU HÓA 1.2.1 Khái niệm tối ưu hóa 1.2.2 Mơ hình tối ưu hóa với phần mềm MODDE 5.0 1.3 PHƯƠNG PHÁP CHI T XUẤT GINSENOSID 1.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GINSENOSID TRONG CÁC CH PHẨM CÓ CHỨA SÂM HOA KỲ 1.5 TỔNG QUAN VỀ CAO THUỐC 10 1.5.1 Định nghĩa .10 1.5.2 Phương pháp điều chế .10 1.5.3 Yêu cầu chất lượng 10 1.6 TỔNG QUAN VỀ XÀ PHÒNG 11 1.6.1 Khái niệm xà phòng 11 1.6.2 Các phương pháp nấu xà phòng 11 1.6.3 Nguyên liệu điều chế xà phòng .14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .16 ii 2.1.1 Nguyên liệu .16 2.1.2 Trang thiết bị 17 2.1.3 Nơi thực 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Định danh nguyên liệu sâm Hoa Kỳ phương pháp gen 17 2.2.2 Định lượng đồng thời ginsenosid Rb1, Re Rg1 phương pháp HPLC/PDA .18 2.2.3 Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid sâm Hoa Kỳ 22 2.2.4 Điều chế xây dựng tiêu chuẩn cao lỏng sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.) .25 2.2.5 Xây dựng quy trình điều chế xà phòng chứa cao lỏng sâm Hoa Kỳ .27 CHƯƠNG K T QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Định danh nguyên liệu sâm Hoa Kỳ 36 3.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời ginsenosid Rb1, Re Rg1 phương pháp HLC/PDA 36 3.2.1 Tính phù hợp hệ thống 36 3.2.2 Tính đặc hiệu 37 3.2.3 Tính tuyến tính 40 3.2.4 Độ 42 3.2.5 Độ xác 43 3.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất ginsenosid sâm Hoa Kỳ .45 3.3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất ginsenosid Rb1, Re Rg1 sâm Hoa Kỳ .45 3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid sâm Hoa Kỳ 46 3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cao lỏng sâm Hoa Kỳ 50 3.4.1 Cảm quan 50 3.4.2 Xác định pH 51 3.4.3 Xác định hàm lượng kim loại nặng 51 3.4.4 Giới hạn nhiễm khuẩn .51 iii 3.4.5 Xác định tro toàn phần 54 3.4.6 Xác định tro tan nước 54 3.4.7 Xác định tro không tan acid 54 3.4.8 Định lượng ba ginsenosid Rb1, Re Rg1 cao lỏng sâm Hoa Kỳ phương pháp HPLC/PDA .54 3.5 Xây dựng quy trình điều chế xà phòng chứa cao lỏng sâm Hoa Kỳ 55 3.5.1 Xây dựng quy trình điều chế xà phịng chứa cao lỏng sâm Hoa Kỳ .55 3.5.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng quy trình điều chế xà phịng chứa cao lỏng sâm Hoa Kỳ .57 3.5.3 Xây dựng tiêu chuẩn cở sở xà phòng chứa cao lỏng sâm Hoa Kỳ 61 CHƯƠNG BÀN LUẬN 64 4.1 Định danh nguyên liệu sâm Hoa Kỳ 64 4.2 Phương pháp chiết xuất dung môi chiết xuất ginsenosid 64 4.3 Phương pháp định lượng ginsenosid sâm Hoa Kỳ 64 4.4 Các yếu tố ảnh hưởng quy trình chiết xuất ginsenosid 65 4.5 Tiêu chuẩn sở cao lỏng sâm Hoa Kỳ .66 4.6 Ứng dụng xà phòng chứa cao lỏng sâm Hoa Kỳ .66 K T LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt BLAST Chữ nguyên EtOH Ethanol Ethanol HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao ICP/MS Inductively-Coupled Plasma /Mass spectrometry Hệ thống phổ khối nguyên tử plasma MeOH Methanol Methanol PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PDA Photodiode array detector Đầu dò dãy diod quang PPD Protopanaxadiol Protopanaxadiol PPT Protopanaxatriol Protopanaxatriol Rf Retention factor Hệ số lưu giữ RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn Basic Local Alignment Search Tool SKLM SLS Tiếng Việt Sắc kí lớp mỏng Natri lauryl sulfat TB Trung bình TCCS Tiêu chuẩn sở TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TNHH MTV Trách nhiệm hữu hạn thành viên v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh thành phần ginsenosid P.quinquefolius P.ginseng Bảng 1.2 Tác dụng dược lý ginsenosid sâm Hoa Kỳ Bảng 1.3 Các phương pháp chiết xuất ginsenosid từ dược liệu sâm Bảng 1.4 Một số nghiên cứu phương pháp phân tích sâm chế phẩm từ sâm Hoa Kỳ giới Bảng 1.5 Thành phần acid béo dầu dừa 14 Bảng 1.6 Thành phần acid béo có dầu ô liu 14 Bảng 1.7 Thành phần acid béo dầu đậu nành 15 Bảng 1.8 Bộ tiêu chuẩn dầu mù u 15 Bảng 2.9 Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.10 Các trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.11 Các bước định danh mẫu nguyên liệu sâm Hoa Kỳ 18 Bảng 2.12 Điều kiện sắc ký theo nghiên cứu Dionex 18 Bảng 2.13 Điều kiện sắc ký điều chỉnh 19 Bảng 2.14 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol 23 Bảng 2.15 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết 23 Bảng 2.16 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ dược liệu 23 Bảng 17 Các yếu tố mức độ bố trí theo mơ hình Box-Behnken 24 Bảng 2.18 Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken 24 Bảng 2.19 Tiêu chuẩn sở cao lỏng sâm Hoa Kỳ 25 Bảng 2.20 Khảo sát ảnh hưởng NaOH đến chất lượng bánh xà phòng 29 Bảng 2.21 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến chất lượng bánh xà phòng 29 Bảng 2.22 Khảo sát ảnh hưởng lượng nước đến chất lượng xà phòng lỏng 29 Bảng 2.23 Khảo sát ảnh hưởng glycerol đến chất lượng xà phòng lỏng 30 Bảng 2.24 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến chất lượng xà phòng lỏng 30 Bảng 2.25 Khảo sát ảnh hưởng SLS đến chất lượng xà phòng 30 Bảng 2.26 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm xà phòng chứa cao lỏng sâm Hoa Kỳ 31 Bảng 3.27 Kết tính phù hợp hệ thống 36 Bảng 3.28 Kết diện tích pic theo nồng độ ba ginsenosid Rb1, Re Rg1 40 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 54 PHỤ LỤC 13 TIÊU CHUẨN CƠ SỞ XÀ PHÒNG BÁNH VÀ LỎNG CHỨA CAO LỎNG SÂM HOA KỲ Cảm quan Xà phịng bánh Bánh xà phịng đục, khơng rạn nứt, khơng phân lớp, khơng có mùi hơi, chua dầu mỡ bị phân hủy, khơng có xám, đen Xà phịng lỏng Dung dịch xà phòng trong, đồng nhất, dễ dàng chảy khỏi bình, có hương thơm dịch chiết tinh dầu tương ứng thêm vào trình điều chế pH Yêu cầu: ≤ 11 (đối với xà phòng bánh xà phòng lỏng) Tiến hành Cân g mẫu xà phòng bánh 1,5 ml mẫu xà phòng lỏng cho vào cốc thủy tinh, thêm nước vào cốc vừa đủ 70 ml Trộn không tạo bọt Đo pH sau 30 phút để ổn định Hàm lượng acid béo Yêu cầu: ≥ 62,90% (đối với xà phòng bánh) ≥ 20,60% (đối với xà phòng lỏng) Tiến hành: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1557:1991, mục 3.2.3 Hàm lượng kali hydroxid tự Yêu cầu: ≤ 0,05% (đối với xà phòng bánh xà phòng lỏng) Tiến hành: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1557:1991, mục 3.2.4 Tổng hàm lượng chất hữu khơng bị xà phịng hóa chất béo chưa xà phịng hóa u cầu: ≤ 1,04% (đối với xà phòng bánh) ≤ 5% (đối với xà phòng lỏng) Tiến hành: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1557:1991, mục 3.2.7 Hàm lượng chất hữu không bị xà phịng hóa u cầu: ≤ 1,5% (đối với xà phòng bánh xà phòng lỏng) Tiến hành: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1557:1991, mục 3.2.8 Hàm lượng chất béo chưa bị xà phịng hóa Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 55 Yêu cầu: ≤ 1,0% (đối với xà phòng bánh) ≤ 3,4% (đối với xà phòng lỏng) Tiến hành: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1557:1991, mục 3.2.9 Thể tích bọt ban đầu Yêu cầu: ≥ 470 ml (đối với xà phòng bánh xà phòng lỏng) Tiến hành: Cân khoảng g xà phòng vào 1000 ml nước cất dùng đũa thủy tinh khuấy đều, tránh tạo bọt Dùng ống đong lấy 250 ml dung dịch xà phịng cho vào ống đong dung tích 1000 ml Cho chổi khuấy vào ống đong chứa dung dịch xà phòng, khuấy dung dịch xà phòng theo chiều lên xuống (chiều thẳng đứng) phút với tốc độ khoảng 80 lần/phút Định tính ginsenosid sắc ký lớp mỏng Yêu cầu: sắc ký mẫu thử có vết với màu sắc khoảng Rf tương tự mẫu đối chứng (đối với xà phòng bánh xà phòng lỏng) Ghi chú: C : Mẫu cao lỏng XP: Mẫu xà phòng Bảng chấm sắc ký Tiến hành Dung dịch thử: Cân khoảng 26 g xà phịng, hồ tan vào 30 ml nước cất becher 100 ml Cho vào bình lắng gạn, thêm 20 ml CHCl3 lắc vài phút để yên cho dịch tách lớp hoàn toàn Loại bỏ lớp dưới, làm tương tự lần Thêm 15 ml nbutanol bão hoà với nước vào becher, khuấy Cho toàn dịch thu dược vào Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 56 phễu chiết, lắc vài phút để yên cho dịch tách lớp hoàn toàn Lấy lớp cho vào chén sứ đem cô cạn bếp cách thuỷ đến cắn Cho ml MeOH vào lắc gạn lấy phần MeOH phía Dung dịch đối chứng: Cân 0,5 g cao lỏng cho vào chén sứ Cô đến cắn, cho ml MeOH vào cắn khuấy lọc qua giấy lọc thu dịch lọc Lượng nạp: 10 µl Dung mơi: CHCl3 – MeOH – H2O (70 – 30 – 9) (lớp dưới) Thuốc thử phun: Vanilin – sulfuric Chấm mẫu thử mẫu đối chứng SKLM Triển khai bình chứa dung mơi Sau đó, sấy khơ mỏng, nhúng thuốc thử Sấy 105 - 110 oC - phút 10 Độ nhớt Yêu cầu: khoảng 55,24 – 61,06 cP (đối với xà phòng lỏng) Tiến hành: hiệu chỉnh dụng cụ đo cân bằng, đổ đầy mẫu xà phòng vào cốc đo Din cup Mở chốt cho xà phòng chảy Đếm thời gian để lượng xà phịng cốc đo chảy hết Sau đối chiếu thời gian ghi nhận với bảng thông số độ nhớt kèm, ta xác định độ nhớt mẫu 11 Khối lượng bánh xà phòng Yêu cầu: 65 ± 3g (đối với xà phòng bánh) Tiến hành: Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1557:1991, mục 3.2.1 12 Độ cứng Yêu cầu: 90 ± 5N (đối với xà phòng bánh) Tiến hành: dùng máy đo độ cứng ER WEKA – German để xác định độ cứng bánh xà phịng Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... THANH TUYỀN TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH L? ?ỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID Rb1, Re, Rg1 TRONG DỊCH CHIẾT SÂM HOA KỲ (Panax quinquefolius L. ), DÙNG L? ?M NGUYÊN LIỆU ĐIỀU CHẾ XÀ PHÒNG Ngành:... kiện chiết xuất định l? ?ợng đồng thời ginsenosid Rb1, Re Rg1 dịch chiết sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L. ), dùng l? ?m nguyên liệu điều chế xà phòng? ?? với mục tiêu sau: (1) Xác định điều kiện phân... ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH L? ?ỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID Rb1, Re, Rg1 TRONG DỊCH CHIẾT SÂM HOA KỲ (Panax quinquefolius L. ), DÙNG L? ?M NGUYÊN LIỆU ĐIỀU CHẾ XÀ PHÒNG Nguyễn Thanh Tuyền Thầy