xây dựng một quy trình ly trích và định lượng vitamin E trên mẫu cây rau ngót phù hợp với tình hình thực tế Việt Nam

TÓM TẮT Vitamin E là một chất có vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ và phòng ngừa bệnh tật cho cơ thể.Trong đó, α-tocopherol có hoạt tính sinh học cao nhất trong các dạng cấu t

Ngành họ Sinh viên Niên khó

BỘ GIÁO HỌC NÔNG

ẬN TỐ

P PHÂN T CAO ÁP

opus andr

: CÔN : NGU : 2009

Tháng 7/20

ĐÀO TẠO HÀNH PHỐ

SINH HỌC

LỆ HẰNG

MINH

ỆP OCOPHE

U NGÓT T EROL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ALPHA-TOCOPHEROL

BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP TRÊN CÂY RAU NGÓT

Xin được gửi lời tri ân sâu sắc tới Thạc sĩ Lê Văn Huy và Thạc sĩ Nguyễn Thanh Điền đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt lại cho em nhiều kiến thức, kỹ năng, thao tác thực hành và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành tốt đề tài này

Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, anh chị đang làm việc tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Xin cám ơn các bạn bè cùng tập thể DH09SH đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Con thành kính ghi ơn ba mẹ và những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện, động viên trong suốt quá trình con học tập tại trường

Sau một thời gian thực tập Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường,

em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp này Do kinh nghiệm phòng thí nghiệm còn non yếu, kiến thức khoa học còn hạn hẹp nên không thể tránh khỏi sai sót trong bài luận văn này Kính mong nhận được sự góp ý chân thành từ phía các thầy cô, Hội đồng tốt nghiệp và các bạn

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013

Nguyễn Thị Lệ Hằng

TÓM TẮT

Vitamin E là một chất có vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ và phòng ngừa bệnh tật cho cơ thể.Trong đó, α-tocopherol có hoạt tính sinh học cao nhất trong các dạng cấu trúc của vitamin E nên rất được quan tâm nghiên cứu.Song song đó, rau ngót là loại thực phẩm có hàm lượng α-tocopherol cao nhất trong 62 loài thực vật ăn được thuộc khí hậu nhiệt đới với hàm lượng là 426,8 mg/kg rau (Mohamed và Ching, 2001).Chính vì vậy, đề tài được tiến hành nhằm xây dựng một quy trình ly trích và định lượng vitamin E trên mẫu cây rau ngót phù hợp với tình hình thực tế Việt Nam

Kết quả đã tối ưu được quy trình ly trích mẫu phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam dựa trên quy trình của Koning và ctv công bố năm 1996 là ly trích vitamin E trên rau ngót trong điều kiện có sục khí N2 với áp suất 1 atm, nồng độ KOH trong Ethanol sử dụng

là 0,375 mol/l, xà phòng hóa ở 80°C trong 40 phút cho kết quả ổn định dựa trên hình ảnh sắc ký đồ Trong đó điều kiện về khí N2 là hết sức quan trọng trong việc đảm bảo hiệu quả

ly trích Hàm lượng vitamin E có trong rau ngót ở Việt Nam đã được khảo sát trên hai loại mẫu là mẫu lá và mẫu ngọn bằng HPLC phát hiện ở phút thứ 7 của quá trình chạy máy với điều kiện sắc ký lỏng cao áp pha đảo, sử dụng pha động là dung dịch KH2PO4 20 mM

và ACN 3,5 % với tốc độ dòng 0,5 ml/phút, đầu dò UV với bước sóng 254 nm và hiệu suất thu hồi là 110,66% Đây là quy trình đã được tối ưu Kết quả cho thấy hàm lượng của vitamin E có trong mẫu lá và ngọn lần lượt là 1238,99 và 446,99 mg/kg mẫu

SUMMARY

Nguyen Thi Le Hang, Nong Lam University- Ho Chi Minh City, June 2013 “The

development of the analytical methodto determine vitaminE in Sauropus androgynous

was conducted by usinghigh pressure liquidchromatography”

Instructors: MSc Le Van Huy - MSc Nguyen Thanh Dien - Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University - Ho Chi Minh city

The thesis was carried out from December 2012 to June 2013 at Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University, Ho Chi Minh city

This thesis was conducted in order to setup an analytical method to determine

vitamin E on Sauropus androgynous by employing high pressure liquid chromatography

The opitmized extraction procedure of α-tocopherol in Sauropus androgynous,

demonstrated by chromatographic profile, was determined at the concentration 0.375 mol

of KOH in ethanol, saponification at 80°C for 40 minutes under the neccesary present of

N2 at 1 atm

Optimized conditions of HPLCanalysis was built up by running the mobile phaseof 20mMphosphatebuffersystem consisting 20 mM KH2PO4, and 3.5% ACN inreversed phasechromatographicconditions atflowrateof 0.5ml/ min, UV at 254 nm The retention time was record at7th minute, and the coresponding recovery yieldis110.66%

Content of vitaminE in leaves and eatable stem of Sauropus androgynous was

1238.99and446.99mg/kg ofthe vegetable samples, respectively

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các hình viii

Danh sách các bảng ix

Chương 1  MỞ ĐẦU 1 

1.1  Đặt vấn đề 1 

1.2  Yêu cầu đề tài 1 

1.3  Nội dung thực hiện 1 

Chương 2  TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 

2.1  Giới thiệu về cây rau ngót 2 

2.1.1  Phân loại khoa học 2 

2.1.2  Đặc điểm của cây rau ngót 3 

2.1.2.1  Phân bố 3 

2.1.2.2  Đặc điểm hình thái 3 

2.1.3  Thành phần hóa học 3 

2.1.4  Các ứng dụng truyền thống và trong các nghiên cứu gần đây 3 

2.2  Vitamin E 5 

2.2.1  Khái niệm vitamin E 6 

2.2.2  Lịch sử phát hiện của vitamin E 6 

2.2.3  Đặc điểm cấu trúc 6 

2.2.4  Tính chất lý - hóa 8 

2.2.5  Hoạt tính sinh học 8 

2.2.6  Các hướng ứng dụng 9 

2.2.6.1  Vitamin E trong điều trị bệnh 9 

2.2.6.2  Vitamin E trong bảo vệ cơ thể dưới tác động của tia UV 10 

2.2.7  Các nghiên cứu đã tiến hành về tác dụng của vitamin E 10 

2.3  Phương pháp phân tích vitamin E 11 

2.3.1  Nguyên tắc 12 

2.3.1.1  Giới thiệu về HPLC 12 

2.3.1.2  Nguyên tắc 12 

2.3.2  Hệ thống HPLC 12 

2.3.3  Giới thiệu về pha tĩnh 13 

2.3.4  Giới thiệu về pha động 14 

2.3.5  Các công việc cần tiến hành để tối ưu hóa HPLC 14 

Chương 3  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 

3.1  Thời gian, địa điểm và phương pháp tiến hành 15 

3.1.1  Thời gian 15 

3.1.2  Địa điểm 15 

3.2  Vật liệu 15 

3.2.1  Thu thập mẫu rau ngót 15 

3.2.2  Hóa chất 15 

3.2.3  Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 16 

3.2.3.1  Dụng cụ 16 

3.2.3.2  Thiết bị 16 

3.3  Phương pháp 16 

3.3.1  Pha dung dịch chuẩn 16 

3.3.1.1  Chuẩn bị dung dịch stock 16 

3.3.1.2  Pha các dung dịch chuẩn 17 

3.3.2  Phương pháp chiết tách 17 

3.3.2.1  Quy trình chiết tách 17 

3.3.2.2  Tối ưu quy trình chiết tách 18 

3.3.3  Tối ưu điều kiện chạy HPLC 18 

3.3.4  Hiệu suất thu hồi của quy trình 19 

3.3.4.2  Phương pháp đánh giá độ thu hồi 20 

Chương 4  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 

4.1  Định tính vitamin E 21 

4.2  Xây dựng đường chuẩn vitamin E 22 

4.3  Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích 23 

4.4  Xây dựng quy trình ly trích vitamin E 24 

4.4.1  Điều kiện tối ưu 24 

4.4.2  Quy trình đề nghị 26 

4.5  Điều kiện chạy HPLC 27 

4.5.1  Khảo sát điều kiện chạy HPLC 27 

4.5.2  Điều kiện chạy HPLC 28 

4.6  Vitamin E trên cây rau ngót 29 

4.6.1  Khảo sát sự phân bố của vitamin E trên cây rau ngót 29 

4.6.2  So sánh kết quả với các nghiên cứu trước đây 30 

Chương 5  KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 

5.1  Kết luận 32 

5.2  Đề nghị 32 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây rau ngót (Sauropus androginus) 2

Hình 2.2 Một số nguồn vitamin E 5

Hình 2.3 Các dạng cấu trúc của vitamin E 7

Hình 2.4 Sơ đồ minh họa hệ thống HPLC 12

Hình 3.1 Vật liệu nghiên cứu 15

Hình 3.2 Hệ thống HPLC 16

Hình 3.3 Quy trình chuẩn bị mẫu để đánh giá hiệu suất thu hồi 19

Hình 4.1 Sắc ký đồ khi chạy HPLC mẫu rau ngót 21

Hình 4.2 Sắc ký đồ khi chạy HPLC mẫu rau ngót có thêm chuẩn 1191 μg/ml 22

Hình 4.3 Đường chuẩn α-tocopherolvới 4 điểm chuẩn 23

Hình 4.4 Sắc ký đồ của mẫu rau ngót trong điều kiện ly trích không có khí N2 24

Hình 4.5 Sắc ký đồ mẫu rau ngót trong điều kiện ly trích có khí N2 25

Hình 4.6 Sắc ký đồ mẫu rau ngót trong điều kiện ly trích với nồng độ 26

Hình 4.7 Sắc ký đồ của mẫu rau trong điều kiện chạy HPLC với pha động 27

Hình 4.8 Sắc ký đồ mẫu rau trong điều kiện chạy HPLC với pha động là 28

Hình 4.9 Đồ thị so sánh hàm lượng vitamin E giữa mẫu lá và ngọn rau ngót 30

Hình 4.10Đồ thị so sánh kết quả hàm lượng vitamin E trên mẫu lá và ngọn 30

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Quy trình pha các dung dịch α-Tocopherol chuẩn 17

Bảng 4.1 Thời gian lưu và diện tích peak của các nồng độ chuẩn 22

Bảng 4.2 Kết quả sau khi chạy HPLC đánh giá hiệu suất thu hồi 24

Bảng 4.3 Các điều kiện trong quy trình chạy HPLC phân tích 28

Bảng 4.4Hàm lượng vitamin E có trong các mẫu rau 29

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Vitamin E từ lâu được đánh giá là một loại chất dinh dưỡng có vai trò hết sức quan trọng với sức khỏe của con người Tác dụng rõ nét nhất là chất chống oxy hóa và được xem như là hàng rào đầu tiên chống lại những tác động có hại của gốc tự do đối với tế bào (FAO, 2002), phòng ngừa ung thư (Jihyeung và ctv, 2010), bảo vệ cơ thể trước tác động của tia UV (Dreher và ctv, 1998; Thiele và ctv,1998; Lin và ctv, 2003) Mà cơ thể người lại không có khả năng tự tổng hợp nên vitamin E (Drouin và ctv, 2011) nên cơ thể chỉ có thể thu nhận vitamin E từ nguồn thực phẩm tiêu thụ hàng ngày, chủ yếu từ mỡ thực vật

(vegetable fats) và các loại dầu và những sản phẩm từ dầu(Ryynänen và ctv, 2004) Đáng

chú ý, cơ thể người lại ưu tiên hấp thu vitamin E có nguồn gốc tự nhiên tocopherol) hơn các α-tocopherol tổng hợp (Traber và ctv, 1992) Đặc biệt, trong nghiên cứu đánh giá hàm lượng α-tocopherol của Ching và Mohamed (2001) cho biết trong rau ngót chứa hàm lượng vitamin E cao nhất trong 62 loài thực vật ăn được thuộc vùng khí hậu nhiệt đới đã được khảo sát (426,8 mg/kg) Đây là loại thực phẩm rất phổ biến ở Việt Nam và các nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới bỡi hàm lượng dinh dưỡng cao Do đó đề tài “Xây dựng phương pháp phân tích α-tocopherol bằng sắc ký lỏng cao áp trên cây rau

(RRR-alpha-ngót (Sauropus androgynous)” đã được tiến hành nhằm cung cấp thêm cơ sở dữ liệu về

vitamin E trên rau ngót ở Việt Nam, cũng như phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về phương pháp phân tích hàm lượng vitamin E và cây rau ngót

1.2 Yêu cầu đề tài

Xây dựng phương pháp định lượng vitamin E trên rau ngót bằng HPLC

1.3 Nội dung thực hiện

- Xây dựng được phương pháp ly trích vitamin E từ cây rau ngót phù hợp với điều kiện thực tế

- Xây dựng quy trình HPLC trong định lượng vitamin E trên cây rau ngót

- Xác định được hàm lượng của vitamin E trên mẫu cây rau ngót ở Việt Nam

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây rau ngót

Rau ngót, bù ngót, rau tuốt hay bồ ngót (Sauropus androgynus) là một loài cây bụi

mọc hoang ở vùng nhiệt đới châu Á nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số nước, trong đó có Việt Nam(http://en.wikipedia.org/wiki/Sauropus_androgynus)

2.1.1 Phân loại khoa học

Danh pháp 2 phần: Sauropus androgynous

Hình 2.1 Cây rau ngót(Sauropus androginus)

(http://en.wikipedia.org/wiki/Sauropus_androgynus)

2.1.2 Đặc điểm của cây rau ngót

2.1.2.1 Phân bố

Rau ngót phân bố ở một số vùng thuộc khí hậu nhiệt đới của châu Á như: Ấn Độ, nam Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia và Indonesia Ở Việt Nam, cây này mọc hoang và cũng được trồng ở nhiều nơi

(http://coinguonthucpham.com/node/26)

2.1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cây bồ ngót thuộc dạng cây thân gỗ, mọc thẳng đứng, phân nhiều cành.Vỏ thân xanh, lục rồi nâu nhạt Cây cao khoảng 1,5 m đến 2 m Lá mọc so le, dài 4 – 5 cm, cuống ngắn có 2 lá kèm nhỏ Phiến lá nguyên hình trứng dài hoặc hình bầu dục, mép nguyên, màu xanh đậm Hoa rau ngót đơn tính, mọc thành xim ở nách lá, có cả hoa đực lẫn hoa cái hoặc chỉ có hoa cái Hoa đực có đài màu vàng điểm chấm đỏ, hoa cái có đài màu vàng hoặc đỏ thẫm.Quả dạng nang hình cầu dẹp màu trắng, hạt hình tam giác có vân nhỏ

(https://sites.google.com/site/raurungvietnam/rau-than-go-nho/bo-ngot)

2.1.3 Thành phần hóa học

Đánh giá về thành phần rau ngótcó chứa papaverine, protein chiếm 34% đến 49%, chất xơ chiếm 14 – 18%, các vitamin A, B, C, … và các muối khoáng:K chiếm tỷ lệ 2,77%, Ca là 2,77%, P chiếm 0,61%, Mg là 0,55%, Fe là 0,0199%; hàm lượng dinh dưỡng có trong mỗi 100 g rau ngót là khoảng 74 Kcal năng lượng, 7,6 g protein, 1,8 g chất béo, 6,9 g carbohydrate (http://herbsarespecial.com.au/articles/sweet_leaf.pdf)

Chính vì vậy rau ngót được xem như là một loại thực phẩm bổ dưỡng, chống oxy hóa, giải nhiệt và kháng sinh.Đáng chú ý,Ching và Mohamed (2001),rau ngótđã được phát hiện chứa lượng α-tocopherol cao nhất trong 62 loại thực vật ăn được thuộc vùng khí hậu nhiệt đới được khảo sát với 79,65 mg α-tocopherol trên 100 g rau

2.1.4 Các ứng dụng truyền thống và trong các nghiên cứu gần đây

Rau ngót là một loại thực phẩm được người dân ở các nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới sử dụng rất phổ biến.Ở Việt Nam, rau ngót thường được chế biến thành các món canh vừa bổ dưỡng vừa có tác dụng chữa bệnh.Cụ thể rau ngót nấu canh với hến có tính mát, là một món canh giải nhiệt vào mùa hè.Rau ngót nấu với xương lợn thì có tác dụng

chữa nhức xương.Rau ngót nấu với nấm rơm góp phần trị chứng nước tiểu vàng đục và đau phần thắt lung Còn canh rau ngót nấu với thịt lợn nạc hoặc giò sống (hoặc trứng tôm, trứng cáy, cá rô, cá quả, …) lại là một món canh rất bổ dưỡng, dùng để bồi bổ sức khỏe cho người mới ốm dậy, người già yếu hay phụ nữ sau sinh Rau ngót nấu canh cùng với bầu đất và quả bầu dục lợn có tác dụng trị chứng đổ mồ hôi trộm,táo bón ở trẻ em, đây

cũng là một vị thuốc giúp trẻ ăn ngon miệng

Nghiên cứu của Narumon và ctvvề xác định khả năng chống oxy hóa và giá trị dinh dưỡng của rau ngót vào 2008 cho biết hàm lượng đạm trong rau ngót là 4,8 g trong

100 g rau gồm nhiều loại acid amin cần thiết cho cơ thể nên có thể dùng rau ngót thay thế đạm động vật mà ít gây hại cho cơ thể đối với các bệnh nhân bị bệnh gout, sỏi thận Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy khả năng xóa vết nám, ngăn ngừa các bệnh về mắt, tăng cường hệ miễn dịch và sinh sản nhờ hàm lượng cao vitamin A, C, E, và nhiều loại muối khoáng tốt cho cơ thểcó trong rau ngót Rau ngót là một trong những loại thực phẩm hiếm hoi có chứa vitamin K – một chất làm giảm nguy cơ gãy xương ở người già

Có một vài nghiên cứu cho thấy trong rau ngót có chứa nhiều hợp chất phytochemical nên có tác dụng như dược liệu nên rau ngót cũng được sử dụng để làm thuốc (Narumon và ctv, 2008).Người ta thường chọn những cây rau ngót hai năm tuổi trở lên để làm thuốc

Theo Đông y thì rau ngót có tính mát, vị ngọt nên được dùng làm thuốc thanh nhiệt, giải độc, tăng tiết nước bọt, hoạt huyết, tiêu ứ, bổ huyết, cầm máu, nhuận tràng, sát khuẩn, tiêu viêm, sinh cơ Rau ngót còn có khả năng làm tăng sự hấp thụ của hệ tiêu hóa, chữa các chứng mụn nhọt, viêm loét, tăng thị lực, ngừa các bệnh mãn tính của mạch máu, giảm cholesterol, hạ huyết áp, hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường và được xem là thực phẩm tốt cho nam giới vì làm gia tăng chất lượng cũng như số lượng tinh trùng.Còn theo kinh nghiệm dân gian thì lá rau ngót được dùng làm thuốc để trị một số bệnh: tưa lưỡi, thanh nhiệt, hạ sốt, các chứng ho do phế nhiệt,chảy máu cam, trị chứng sót nhau thai, giúp làm sạch máu và bồi bổ cơ thể cho phụ nữ sau sinh Rau ngót cũng có tác dụng phòng chứng táo bón và bệnh trĩ cũng như phòng chống lão hóa

Tuy nhiên, trong nhiều tài liệu cũng cảnh báo việc uống nhiều nước rau ngót tươi

có thể dẫn đến một số phản ứng phụ:gây ra bệnh nghẽn phổi (Yu và ctv, 2007), co thắt cơ trơn tử cung gây sẩy thai, tiêu chảy, co thắt mạch máu gây đau nhức cơ, mất ngủ, nhức đầu, cao huyết áp hoặc thiếu máu não ở người lớn tuổi Nguyên nhân của các hiện tượng này là vì trong rau ngót tươi có chứa một hàm lượng papaverin cao (580 mg/100 g rau) (một loại alkaloid có trong á phiện) (Bender vàIsmail, 1973) Dượcthư Việt Nam 2002 ghi

rõ khuyến cáo: “Không dùng papaverin cho người có thai” Ngoài ra, glucocorticoid có trong lá rau ngót có thể gây cản trở cho quá trình hấp thụ Ca và P.Chính vì vậy, khi sử dụng rau ngót, tốt nhất là ta nên nấu chín vì quá trình đun sôi giúp loại bỏ phần nào các yếu tố có thể là nguyên nhân gây phân hủy hoạt chất trong lá và quá trình phát sinh các chất gây hại (Ger và ctv, 1997)

2.2.1 Khái niệm vitamin E

Vitamin E là tên gọi chung để chỉ hai lớp các phân tử (bao gồm các tocopherol và các tocotrienol) có hoạt tính vitamin E (α-tocopherol) trong dinh dưỡng Vitamin E không phải là tên gọi cho một chất hóa học cụ thể, mà chính xác hơn là cho bất kỳ chất nào có trong tự nhiên mà có tính năng vitamin E trong dinh dưỡng.Chức năng chính của α-tocopherol trong cơ thể người là một chất chống ôxi hóa.Các dạng phân tử được đề cập ở trên có thể chuyển hóa lẫn nhau trong cơ thể

2.2.2 Lịch sử phát hiện của vitamin E

Vào năm 1922, Herbert M Evans và Bishop K.S đã phát hiện ra một yếu tốkhông xác địnhtrong dầu thực vậtcần thiết chosinh sản ởchuột cái.Đầu tiên yếu tố này được gọi là“yếu tốX” hay“yếu tố chống vô sinh” Đến năm 1925 thì nó đượcđổitênthànhvitamin E.Evans và Emerson đã phân lập được vitamin E từ một số nguồn như dầu mầm lúa mì, dầu bắp, dầu hạt bông vào năm 1936.Bởi vìhợp chất nàyliên quan đến khả năng cócon của động vật, nhóm nghiên cứuđã đặttênlà tocopherol vìtừ‘tocos’theo tiếng Hy Lạpcó nghĩa làsinh convà ‘ferein’(mang lại), liên quan đếnsự thiết yếucủa nóđểchuộtcó thể mang thai Sau đó đuôi‘ol’cũng đã được thêm vào.Cấu trúc chính xác của vitamin E được công bố vàonăm 1938 Cũng trong năm này, Paul Karrer lần đầu tiên tổng hợp được vitamin E Đến năm 1968, vitamin E chính thức được hội đồng Thực phẩm và Dinh dưỡng của học viện Khoa học Quốc gia của Hoa Kỳ(National Academy of Sciences) công nhận là một chất dinh dưỡng thiết yếu

(http://historyofsciences.blogspot.com/2011/03/discovery-of-vitamin-e.html)

2.2.3 Đặc điểm cấu trúc

Vitamin E được sử dụng được chia thành 2 loại dựa theo nguồn gốc tạo ra: vitamin

E tự nhiên (thu nhận từ các nguồn chứa vitamin E từ tự nhiên) và vitamin E tổng hợp (sản phẩm của quy trình tổng hợp vitamin E theo con đường hóa học)

Xét về mặt cấu trúc, vitamin E trong thiên nhiên gồm 8 dạng khác nhau của 2 loại hợp chất: tocopherol và tocotrienol Mỗi hợp chất có 4 dạng cấu trúc khác nhau dựa theo những khác biệt về vị trí nhóm methyl và cấu trúc không gian của phân tử:α-, β-, γ- và δ-

ên nhiên củaDạng tổng

g tự nhiên lkhác nhau vbao gồm ph

n gốc tự nhiêloawap.net/

ân biệt với

ng thiên nhicấu trúc nh

a vitamin Ehợp của vi

ẫn dạng tổn

về cấu trúchổi, gan, tế

ên hơn so v/thuvien-cuobằng đơn v

hư trong hìn

E, dưới tên gitamin E là

ng hợp của

c không giabào hồng cvới vitamin ocsong/xem

vị là đươngR-α-tocoph

úc của vitam

fits-of-vitam

ở dạng tocovitamin E

n biệt bằng

l nhờ chuỗiợng quan tâ

g lượng RRherol Mỗi

min E

min-e.html).

opherol, tronTocophero

số và vị trí

i bên cạnh

âm của chún

pha-tocophhợp gồm 8

E đều có cù.Đặc biệt, ctương và nã

ốc tổng hợpVitamin%20RR-alpha-to

mg vitamin

ng đó α-toc

ol có cấu trú

í nhóm metbất bão hò

ng ta trong

herol được t đồng phânùng một côcác cơ quan

ão ưu tiên th

tương đương với 1,49 IU và mỗi mg vitamin E dạng tổng hợp tương đương với 1 IU(Gąsior và ctv,2009)

Các nghiên cứu đã khẳng định ở người dạng tự nhiên của vitamin E có hoạt tính sinh học lớn hơn dạng tổng hợp, dạng tự nhiên của vitamin E được lưu giữ lại tốt hơn 2 đến 3 lần so với dạng tổng hợp (Traber và ctv, 1992)

2.2.4 Tính chất lý - hóa

Khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, vitamin E có dạng dịch dầu, nhớt, màu vàng, không tan trong nước nhưng tan tốt trong mỡ và các dung môi của mỡ (ether, acetone, chloroform, methanol, …)

Ở dạng tự do, vitamin E là chất chống oxy hóa: chúng bị phá hủy bỡi oxy và các chất oxy hóa Khi thiếu oxy, chúng ổn định ở nhiệt độ phòng (khi chế biến thức ăn, vitamin E trong đó sẽ bị mất khoảng 20%(Joy và ctv, 2007)) và môi trường acid, nhưng chúng nhạy cảm với ánh sáng Vì vậy cần bảo quản vitamin E trong các lọ tối màu được đậy nắp kín

2.2.5 Hoạt tính sinh học

Theo FAO, 2002 đã công bố thì chức năng chính của vitamin E trong cơ thể là tác động như là chất chống oxy hóa Nó được xem là hàng phòng thủ trước tiên chống lại quá trình peroxyd hóa lipid Vitamin E tác động ở mức độ tế bào để bảo vệ màng tế bào khỏi

sự tấn công của gốc tự do làm tổn hại đến màng tế bào Trong vai trò là một chất thu dọn gốc tự do, vitamin E bảo vệ các acid béo không bão hòa (PUFA) và cholesterol trong màng tế bào Vitamin E có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào hồng cầu (có hàm lượng PUFA cao) khỏi bị tán huyết.Không chỉ vậy, vitamin E còn có chức năng giống như là một chất chống oxy hóa nội tế bào, giúp tiết kiệm Selenium, chất này chứa trong enzym Glutathion peroxydase Đây là thành phần khác của hệ thống phòng thủ chống oxy hóa của cơ thể và bảo vệ những chất tương tự chất béo khác như vitamin A khỏi bị phân hủy.(http://coloawap.net/thuvien-cuocsong/xem.html?tr=Vitamin%20E) Vitamin E có khả năng ngăn chặn phản ứng của gốc tự do lipoperoxyd (LOO•) rất hoạt động (sinh ra từ

sự oxyd hóa của acid béo màng tế bào) bằng cách nhường 1 hydro của gốc phenol cho

Bên cạnh đó, vitamin E có tác dụng bảo vệ những chất tạo nên tế bào như protein, acid nucleic, …Vitamin E cũng có những tác động khác trong cơ thể bao gồm sự chuyển hóa nucleic và protein, chức năng phân bào và sản xuất hormone và vitamin E cũng cần thiết cho sự sinh sản bình thường

2.2.6.1 Vitamin E trong điều trị bệnh

Với chức năng như chất chống oxy hóa, vitamin E có thể tác dụng lên các gốc tự

do sinh ra từ các quá trình trao đổi chất trong cơ thể nên chúng có tác dụng:phòng chống lão hóa, bảo vệ não, làm giảm bệnh Alzheimer,bảo vệ mắt, phòng và trị bệnh cườm mắt, phòng và điều trị bệnh tiểu đường, (Bourne và Clement, 1991)

Bên cạnh đó, vitamin E còn được biết đến với tác dụng tích cực đối với sự sinh sản

vì nó không những có tác dụng tốt đối với quá trình thai nghén mà còn có những tác động tốt với cơ quan sinh sản: Vitamin E làm giảm nhẹ các triệu chứng chuột rút, đau các bắp

cơ hoặc đau bụng khi hành kinh Nếu các bạn nữ được sử dụng vitamin E ngay từ đầu chu

kì sẽ giảm được 36% đau khi hành kinh.Qua nghiên cứu thực nghiệm, các nhà khoa học nhận thấy, vitamin E có thể ức chế quá trình oxy hóa của DNA nên có thể ức chế hoạt động của chuỗi tế bào ung thư vú, làm giảm 95% sự gia tăng tế bào ung thư ở những người có sử dụng alpha-tocopherol Nghĩa là, vitamin E có thể gây độc có tính chọn lọc đối với các tế bào ung thư vú Cùng lúc đó, các nghiên cứu khác lại cho thấy những phụ

nữ được bổ sung vitamin E thì có tỷ lệ bị ung thư buồng trứng thấp hơn 67% so với nhóm không được sử dụng Ngoài ra, vitamin E còn góp phần cải thiện tình dục, giúp noãn và

tinh trùng phát triển tốt hơn, nâng cao kết quả điều trị vô sinh

Hơn thế nữa, vitamin E còn giúp nâng đỡ hệ miễn dịch như làm gia tăng chức năng của thực bào, kích hoạt các sát bào đối vớicác mầm ung thư và tế bào đã nhiễm virus nên

có thể góp phần đẩy lùi bệnh tật và giúp tăng sức đề kháng của cơ thể

2.2.6.2 Vitamin E trong bảo vệ cơ thể dưới tác động của tiaUV

Vitamin E có khả năng hấp thu tia UVB nên có thể bảo vệ cơ thể trước những tác hại của tia UV Vitamin E giúp bảo vệ tế bào da: khi không có vitamin E, 85% tế bào da sau khi bị bức xạ còn sống sót trong khi nếu có vitamin E thì gần như tất cả mọi tế bào bị bức xạ đều sống Ngoài ra, vitamin E cũng có tác dụng trong điều trị các chứng ban đỏ, dày biểu bì và tróc da sau khi da bị chịu tác động của tia bức xạ.Ngoài ra, vitamin E cũng bảo vệ cơ thể trước những nguy hại về gen từ tia UV vì nó tác động trực tiếp lên sự tấn công của tia UV trên DNA làm Thymidine gắn kết trở lại vào DNA

2.2.7 Các nghiên cứu đã tiến hành về tác dụng của vitamin E

Một số nghiên cứu về tác dụng của vitamin E đã tiến hành:

- α-tocopherol có tác dụng tích cực đến khả năng sinh sản của giun tròn sống tự do

Turbatrix aceti: giai đoạn sinh sản đến sớm hơn và kéo dài lâu hơn (Monica và

2.3 Phương pháp phân tích vitamin E

Vitamin E có ứng dụng hết sức quan trọng Đặc biệt là vitamin E tự nhiên vốn dễ hấp thu hơn dạng tổng hợp Điều này đòi hỏi chúng ta cần tìm ra quy trình ly trích vitamin

E hiệu quả nhất

Vì vitamin E thuộc nhóm các hợp chất phenol nên theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), khi tiến hành ly trích cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần: Benzene, Ethyl eter, Chloroform, Ethyl acetate, Ethanol, … Tương tự vậy, tác giả Koning vàctv (1996) đã đưa ra quy trình ly trích vitamin E sử dụng dung môi ly trích là hỗn hợp n-Hexane và Ethyl acetate có thêm Butylated hydroxytoluene (trong 1 lít dung môi có 900

ml n-Hexane, 100 ml Ethyl acetate cộng với 20 mg Butylated hydroxytoluene (BHT) dạng khan)

Trong đó, kết quả nghiên cứu của Ching và Mohamed tiến hành vào 2001 dựa trên việc áp dụng quy trình ly trích Koning và ctv đã công bố năm 1996 thì rau ngót có chứa hàm lượng vitamin E cao nhất trong 62 loài thực vật đã được tiến hành nghiên cứu (426,8 mg/kg phần ăn được)

Tiếp theo việc xác định loại dung môi ly trích vitamin E nói riêng và quy trình ly trích vitamin E nói chung đạt hiệu quả thì việc lựa chọn phương pháp phân tích vitamin E đảm bảo độ chính xác cũng rất quan trọng trong việc giúp vitamin E dạng thiên nhiên được ứng dụng rộng rãi hơn trong cuộc sống Các phương pháp phân tích vitamin E gồm

có phương pháp sinh hóa (cho phản ứng với HNO3 và FeCl3) và phương pháp sắc ký (phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao - HPLC) Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu vitamin E trên thực vật áp dụng phương pháp phân tích là HPLC: nghiên cứu về các vitamin có tác dụng chống oxy hóa có trong ớt đỏ (Daood và ctv, 1996), dùng phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng tocopherol và tocotrienol có trong các loại rau (Koning và ctv, 1996), phân tích vitamin E thu được từ tỏi (Mazhar và ctv, 1997), xác định hàm lượng α-tocopherol trong 62 loài thực vật ăn được thuộc vùng khí hậu nhiệt đới (Ching và Mohamed, 2001), … Cho thấy HPLC tỏ ra là phương pháp phân tích vitamin E hiệu quả và khả thi.Trên cơ sở đó, kỹ thuật HPLC được lựa chọn là phương pháp phân tích vitamin E trong nghiên cứu này

ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực phân tích

2.3.1.2 Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách mà trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ

2.3.2 Hệ thống HPLC

Hình 2.4 Sơ đồ minh họa hệ thống HPLC

(http://www.boomer.org/c/p3/c03/c0305.html)

Theo như sơ đồ trên hình 2.4, một hệ thống HPLC gồm có:

- Bình chứa dung môi giải ly cột với nút lọc bằng kim loại: nơi chứa và bảo quản dung môi giải ly cột (pha động) trong suốt quá trình chạy máy HPLC phân tích

- Van bơm mẫu vào máy: giúp đưa mẫu cần phân tích vào cột tách của máy HPLC

để tiến hành phân tích mẫu

- Cột sắc ký (pha tĩnh): nơi diễn ra hiện tượng bắt giữ các hợp chất trong hỗn hợp cần phân tích nhờ vào tương tác giữa hợp chất với hệ thống pha tĩnh, pha động và giữa pha động và pha tĩnh với nhau của máy HPLC Mỗi loại hợp chất khác nhau thì những lực tương tác cũng khác nhau, dẫn đến thời gian hợp chất bị giữ lại trong cột sẽ khác nhau

- Đầu dò: theo dõi dòng chảy của dung môi giải ly để biết khi nào thì hợp chất đi ra khỏi cột (thời gian lưu của hợp chất – tR) Trong phương pháp phân tích được sử dụng trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng loại đầu dò hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV

- Thiết bị ghi: ghi sắc ký đồ thể hiện được dòng chất đi ra khỏi cột sau khi mẫu phân tích được bơm vào cột

- Thiết bị lưu dữ liệu: lưu trữ và trích xuất dữ liệu sắc ký đồ

- Bình chứa chất thải: chứa các chất đã ra khỏi cột phân tách

Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) vì phương pháp có thể lựa chọn nhiều loại dung môi giải ly, có thể áp dụng kỹ thuật giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần, hệ thống đạt sự cân bằng nhanh và nhất là kỹ thuật này sử dụng dung môi giải ly chủ lực là nước kết hợp với những loại dung môi hữu cơ như Methanol, Acetonitrile là những dung môi dễ kiếm, giá cả hợp lý nên rất phù hợp với điều kiện thực tế

2.3.3 Giới thiệu về pha tĩnh

Với kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (hay còn được gọi là sắc ký lỏng pha tạo nối), pha tĩnh là dạng tạo nối hóa học trên giá mang silica.Người ta điều chế pha tạo nối bằng cách biến đổi các nhóm silanol bề mặt thành các nhóm dẫn xuất Có các loại pha tạo nối như sau:

- Các nhóm alkyl như: octadexyl (C18H37), ngoài ra còn có những nhóm khác với dây carbon ngắn hơn: C1, C2, C8 và aryl

- Các nhóm phân cực như amino, cyanopropyl, eter, diol

- Các nhóm trao đổi ion như acid sunfonic, amino, ammonium tứ cấp

Vì vậy, để phù hợp với điều kiện tiến hành phân tích, cần sử dụng pha tĩnh là pha tạo nối với nhóm dẫn xuất là nhóm alkyl Cụ thể là nhóm octadexyl (C18H37, C18) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.3.4 Giới thiệu về pha động

Các loại pha động thường được sử dụng trong phân tích vitamin E là sự kết hợp của nước cất với các dung môi hữu cơ như Methanol, Acetonitrile, Methyl alcohol nên rất đa dạng Ví dụ: hỗn hợp Methanol/nước cất (94/6) (Chingvà Mohamed, 2001); Methyl alcohol (Ubaldi và ctv,2005); hỗn hợp Acetonitrile trong nước cất (95 - 100% Acetonitrile trong hỗn hợp giải ly) (Korchazhkina và ctv,2006) Chính vì vậy, cần tiến hành tối ưu hóa pha động cho phù hợp với điều kiện thực tế để quá trình phân tích đạt hiệu quả cao nhất

2.3.5 Các công việc cần tiến hành để tối ưu hóa HPLC

Số lượng và loại công việc cần tiến hành để đánh giá độ tin cậy của một phương pháp HPLC khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng của phương pháp.Những công việc này cần được lên kế hoạch, sắp xếp thành những thí nghiệm bổ sung vào quá trình thực hiện phương pháp HPLC để thể hiện được độ tin cậy của phương pháp phân tích ta

đã sử dụng Một trong những công việc phổ biến thường được dùng là xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), xác định độ tuyến tính, độ đặc hiệu, độ thu hồi, độ lặp lại trên chất cần phân tích, độ chính xác của phương pháp phân tích (dựa trên độ thu hồi, độ lặp lại và độ chính xác trung gian của kết quả chạy HPLC đối với mẫu cần phân tích) , độ bền của chất cần phân tích của hệ thống HPLC khi phân tích những chất có mặt trong lượng mẫu đem đi phân tích Tuy nhiên, trong phân tích các thành phần hoạt động trong dược phẩm (Active Pharmaceutical Ingredient, API) thì không cần phải xác định LOD và LOQ vì thường nồng độ cần phân tích lớn hơn ngưỡng định lượng LOQ của phương pháp HPLC rất nhiều (Ashley, 2005)

Chính vì vậy, trong nghiên cứu này sẽ không tiến hành xác định LOD, LOQ mà tiến hành công việc xây dựng đường chuẩn (xác định độ tuyến tính) và đánh giá độ thu hồi để đánh giá về độ tin cậy của phương pháp HPLC được sử dụng

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian, địa điểm và phương pháp tiến hành

3.2.1 Thu thập mẫu rau ngót

Rau ngót được mua từ chợ Linh Trung thuộc phường Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.Rau sau khi được mua từ chợ về được nhặt và rửa sạch Sau đó

để khô dưới quạt cho ráo nước và chọn mẫu đem đi xử lý: Nếu chọn mẫu lá nên chọn những lá rau còn nguyên, không bị dập nát, không quá non cũng không quá già (từ lá thứ

5 trở đi kể từ ngọn của mỗi nhánh) Nếu thu thập mẫu ngọn thì chỉ lấy phần ngọn non của mỗi cây rau ngót (phần thân mềm: lấy cả lá và thân) và tối đa 4 lá non nhất của mỗi nhánh rau ngót (những lá còn màu xanh nhạt) Sau đó đem mẫu đi xay nhuyễn

Hình 3.1Vật liệu nghiên cứu

a) Mẫu lá rau ngót; b) Mẫu ngọn rau ngót

3.2.2 Hóa chất

Các loại hóa chất cần sử dụng trong nghiên cứu này gồm có: α-tocopherol chuẩn, L(+)-ascorbic acid, khí N2, Ethanol,n-Hexane,Ethyl acetate,Butylated hydroxytoluene (BHT), KOH dạng khan,Na2SO4, Methanol , Acetonitrile (ACN), KH2PO4