Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định lượng human immonodeficiency virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật realtime pcr

Kết luận Dựa vào kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đã xây dựng hoàn thiện qui trình phát hiện và định lượng HIV1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR với các thành phần c

Tóm tắt

Đặt vấn đề

Phát hiện và định lượng HIV1RNA là một nhu cầu rất cần thiết để có thể chẩn đoán phát hiện sớm nhiễm HIV trong giai đoạn cửa sổ hay trẻ sơ sinh và nhũ nhi cũng như để theo dõi hiệu quả điều trị trên các bệnh nhân HIV/AIDS đang được điều trị đặc hiệu Nhu cầu này có thể giải quyết được bằng các bộ xét nghiệm dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và bDNA đã được chấp nhận IVD và có trên thị trường Tuy nhiên giá thành của các bộ xét nghiệm này là khá cao, khó có thể đưa vào áp dụng tại các phòng thí nghiệm lâm sàng tại các quốc gia thu nhập thấp như Việt Nam chúng ta

Vật liệu và phương pháp

Qui trình xét nghiệm “HIV1 RT-TQPCR” được xây với mồi SK462 và SK431 đặc hiệu gene gag đã công bố và taqman probe được thiết kế từ sự biến đổi probe SK101 cũng đã được công bố Các chứng dương HIV1RNA và các mẫu chuẩn định lượng là RNA phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR đích nhân bản từ chính gene gag sử dụng mồi SK462 và SK431 Chứng nội sử dụng chung mồi là được phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR khuếch đai từ các sợi Oligo có trình tự hai đầu bắt cặp bổ sung được với trình tự hai mồi SK462 và SK431 nhưng trình tự probe là khác biệt Bộ tách chiết RNA sử dụng bộ NK RNAPREP của Nam Khoa và bộ tổng hợp cDNA sử dụng bộ NK cDNA synthesis của Nam Khoa Giới hạn phát hiện, khoảng định lượng, độ lặp lại liên phản ứng cũng như trong phản ứng được thực hiện trên các dãy pha loãng của chứng dương HIV1RNA Độ đặc hiệu được đánh giá trên các mẫu huyết thanh người bị nhiễm HBV, HCV, CMV và S aureus xác định bằng PCR hay nuôi cấy Khả năng chống ức chế được thử trên các chất có khả năng ức chế PCR như hemoglobin, lamivudine, BSA, và DNA bạch cầu người Độ bền trong lưu trữ được thử trên các mẫu nhiễm HIV1RNA và theo dõi trong 12 tháng với thử nghiệm mỗi 4 tháng một lần Thử nghiệm trên các mẫu thật được thực hiện có so sánh với thử nghiệm sử dụng bộ xét nghiệm Amplicor

độ ổn định trong phản ứng và liên phản ứng cao đối với các mẫu có giá trị định lượng từ 100copies/ml trở lên;

độ bền trong lưu trữ ít nhất là 12 tháng; không bị chéo với các tác nhân vi sinh khác; có khả năng chống ức chế;

và so sánh với bộ xét nghiệm đã được FDA công nhận IVD là HIV1 Amplicor khi thử trên các mẫu thật cho kết quả lương tương đương và nếu lấy kết quả xét nghiệm từ bộ xét nghiệm Amplicor làm chuẩn vàng thì độ nhạy và

độ đặc hiệu của qui trình xét nghiệm đạt 100%

Kết luận

Dựa vào kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đã xây dựng hoàn thiện qui trình phát hiện và định lượng HIV1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR với các thành phần cần thiết cho một xét nghiệm real-time PCR như bộ tách chiết RNA sử dụng bộ NK RNAPREP của Nam Khoa và bộ tổng hợp cDNA sử dụng bộ NK cDNA synthesis của Nam Khoa, bộ khuếch đại và định lượng, các bộ chứng và chuẩn định lượng Đồng thời từ việc đánh giá qui trình xét nghiệm HIV1 RT-TQPCR phát hiện và định lượng HIV1RNA chúng tôi thu được các thông

số như sau: (1) độ nhạy là 100% (2) độ đặc hiệu: 100% (3) ngưỡng phát hiện: 60 copies/ml huyết tương (4) khoảng định lượng là 10 2 -10 8 copies/ml (5) độ bền trong lưu trữ ít nhất là 12 tháng (6) có khả năng chống ức chế Tuy nhiên để có thể đăng ký được chấp nhận IVD thì cần phải có thêm kinh phí để thử trên các trung tâm đạt chuẩn ISO 15189 làm xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA trong chẩn đoán

Abstract

Background

Detection and quantification of HIV1RNA is the necessary requirement from the clinical to detect HIV infection during the window phase or to confirm the HIV infection in the baby, as well as to follow up the efficacy of the specific treatment These requirements could be solved by the using of the IVD approved kits using PCR or bDNA technologies However the price of these commercialized kits are very expensive, it could not be easily applied at the clinical laboratory in the existing conditions of the low-income countries like Vietnam

Main aims

There are two main aims: (1) Prepare the molecular biology kit named HIV1 RT-TQPCR kit, to detect and quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR technology using the primers and taqman probe specific the gag gene on the HIV1 genome; (2) Evaluate the process via the limit of detection, the range of quantification, the accuracy, the specificity, the elimination of the inhibitors, and the stability of the kits as well

as the sensitivity-specificity and the similarity when testing on the real samples using HIV1 Amplicors as gold standards

Materials and methods

The “HIV1 RT-TQPCR” was prepared using the published SK462 and SK431 specific to gag gene, and the taqman probe was designed from the modification of the published probe SK102 The positive control HIV1RNA and the standards for quantification was prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy inserted with the PCR product amplified from the gag gene using primers SK462 and SK431 The internal control RNA using the same primers of the target was also prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy inserted with the PCR product amplified from the two constructed oligo with SK462 and SK431 sequence at the 5’end and the middle sequence complementary with the internal control probe The RNA extraction kit is the

NK

RNAPREP of Nam Khoa and the cDNA synthesis kit is the NK cDNA synthesis kit of Nam Khoa The limit of detection, the range of quantification, the in testing and the trans-testing reproductibility were tested on the serial dilution of HIV1RNA The risk of the cross reaction were tested on the sera taken from HCV, HBV, CMV infection patients confirmed by PCR, and the sera taken from the S aureus septicemia patient The elimination of the inhibitors were tested of the hemoglobin, BSA, leukocyte DNA and the lamuvidine The stability of the kit was tested during 12 months with interval 4 months on the plasma samples pooled HIVRNA.The clinical trial was done on real plasma sample collected fron HIV infected and non infected patients and the results were analyzed versus the results get from HIV1 amplicor

Results and discussions

The process named HIV1 RT-TQPCR to detect and quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR technology using the primers and taqman probe specific the gag gene on the HIV1 genome was prepared Since the process supplied the control [+] and the standards under the RNA, the users could analyzed the real sensitivity of the testing and the test kit as well as the real quantification graph coming from the RNA not the cDNA The internal control was also supplied under the RNA using the sample primers of the target but the detection probe was difference by the sequence and the fluorophore and this design can help to user monitor the inhibitors in the sample with HIV1RNA detection negative The evaluation results demonstrated that the limit of detection of the process is 60 copies/ml;, the range of the quantification was 10 2 -10 8 copies/ml; the reproductivity was high with the quantification from 100 copies/ml; the stability of the kit was at least 12 months; no cross reaction with HBV, HCV, CMV, and S.aureus; the inhibitors was eliminated by testing with the kit; and the process gave the same results as the FDA approved for IVD kit, HIV1 Amplicor, when testing on the real samples HIV [+] and HIV [-] with sensitivity and specificity 100% if the Amplicor was considered as gold standards

Conclusion

Based on the results of the research we have complete the process with the necessary ingredients for a real-time PCR tests as the RNA extraction kit and the cDNA synthesis kit, amplification, positive control and internal control At the time of the evaluation of HIV1 RT-TQPCR tests, we obtained the following parameters: (1) sensitivity: 100% (2) specificity: 100% (3) threshold detection: 60 copies/ml plasma (4) the amount is about 10 2 -

10 8 copies/ml (5) durability in storage for at least 12 months (6) is resistant to inhibition However, in order to be approved as the IVD kit,the more funding will be needed to try the kit in the laboratories ISO 15189 certified for testing of HIV1RNA detection and quantification for clinical apliucations

STT MỤC LỤC Trang

3.1 Nồng độ HIV-1 tự do và kháng nguyên p24 trong huyết tương 8

3.2 Sự xuất hiện của các kháng thể kháng HIV-1 trong huyết thanh của bệnh

3.4 Các xét nghiệm được sử dụng để phát hiện và theo dõi nhiễmHIV/AIDS 9

4.2 Real-time PCR ứng dụng định lượng tác nhân vi sinh vật trong mẫu thử 14

2.1 Tách chiết RNA với bộ thuốc thử “NK

2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR với bộ thuốc thử “Wizard® SV Gel and PCR

2.6 Tách chiết plasmid với bộ thuốc thử “Wizard® Plus SV Minipreps DNA

3 PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM REAL-TIME PCR

3.2 Thiết kế các thành phần của qui trình thử nghiệm real-time PCR phát hiện và

3.4.1 Chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+] và chuẩn định lượng HIV1-RNA 30

4 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR 33

5 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR

1 KẾT QUẢ PHA CHẾ CÁC THÀNH PHẦN CỦA QUI TRÌNH THỬ

NGHIỆM REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1RNA 39

1.1 Kết quả đánh giá khả năng sử dụng mồi và probe đặc hiệu gene gag của

HIV1 qua kết quả pha chế HIV1-TQPCR master mix 39

1.4 Kết quả chứng minh chứng nội HIV1RNA-C[+] pha ở nồng độ 100

2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR

2.1 Kết quả đánh giá giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 41

3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR

4 QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1RNA RT-TQPCR VỚI CÁC THÀNH

4.1 Tên qui trình thử nghiệm và thành phần 47

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Acquired Immuno Deficiency Virus

ARV Anti-retrovirus

CDC Centers for Diseases & Prevention

cDNA complementary deoxyribonucleic acid

DNA Deoxyribonucleic acid

dATP 2’-deoxyadenosine 5’- triphosphate

dTTP 2’-deoxythymidine 5’- triphosphate

dCTP 2’-deoxycytidine 5’- triphosphate

dGTP 2’deoxyguanosine 5’- triphosphate

dNTP 2’-deoxynuclosid 5’- triphosphat

ELISA Enzyme – Linked Immunosorbent Assay

HIV-1 Human Immunodeficiency Virus type 1

OD Optical Density

PCR Polymerase chain reaction

Realtime PCR Realtime Polymerase chain reaction

RNA ribonucleic acide

RT-PCR reverse transcriptase- polymerase chain reaction UNIADS Joint Unitied Nations Programme on HIV/AIDS

SIV Simian Immunodeficiency Virus

WHO World Heath Organization

DANH SÁCH BẢNG

1

Thể tích của các thành phần được lấy từ các nồng độ hay hàm lượng gốc

để pha được các HIV1-TQPCR mastermix cho 10 mix – 50 mix hay 100

mix

29

2 Giá trị định lượng HIV1RNA trong 3 dãy pha loãng và giá trị CV 42

3 Giá trị định lượng HIV1RNA trong 3 dãy pha loãng thực hiện trong 3

4 Giá trị định lượng HIV1RNA trong từng cặp mẫu co và không có thêm

Giá trị định lượng HIV1RNA trong 44 mẫu HIV1-RNA dương tính và

định lượng được với kit Amplicor và giá trị CV khi so với HIV1

RT-qPCR

47

DANH SÁCH HÌNH

5

Cơ chế hoạt động của SYBR I (1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại thì ống

thứ nghiệm không phát được hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích,

(2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì SYBR I chèn vào và

tập trung trên phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi

nhân được ánh sáng kích thích

9

6 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR 10

7 Tóm tắt cơ chế họat động của Beacon probe trong real-time PCR 11

8 Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe lai trong real-time PCR 12

9 Biển đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang

phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sánh kích thích ở mỗi chu kỳ nhiệt 12

10 Biểu đồ khuếch đại vẽ lên các đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu thử và

11

Biển đồ chuẩn vẽ lên đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa số lượng

bản DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng Trong

biểu đồ ở trên này, chúng ta E2-E4-E7 là các ống phản ứng chứa các mẫu

chuẩn còn B4 là ống phản ứng chứa mẫu thử

14

13 Bản đồ gene của plasmid pGEM-T Easy với vị trí chèn DNA ngay bên trong

14

Plasmid pGEM-T Easy được chèn trình tự DNA sẽ được enzyme cắt giới hạn

NdeI cắt ở đầu SP6 NdeI được sử dụng vì enzyme này chỉ cắt được một điểm

ở đầu SP6 và không cắt được đoạn DNA đã được chèn vào pGEM-T Easy

27

15 Nhờ men T7 RNA polymerase mà DNA được chèn vào plasmid pGEM-T

Esay sau khi duỗi thẳng được phiên mã thành chứng nội tại RNA 28

16

Biểu đồ khuếch đại các pha loãng “HIV1DNA đích” cho vào các

HIV1-TQPCR mix Kết quả cho thấy các đường khuếch đại có Ct cách đều nhau

khoảng 3-4 chu kỳ Sơ bộ cho phép kết luận là HIV1-TQPCR mix hoạt động

được mà không cần phải thiết kế lại primers và taqman probe

39

17

(A) Hình bên trái là kết quả điện di chip cho thấy lane 1 là sản phẩm PCR

đích của HIV1 kích thước 140bps khuếch đại từ gene gag của HIV1 genome

trích từ huyết thanh người nhiễm HIV có HIV1RNA [+], và lane 2 là sản

phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+] kích thước 240 bases phiên mã từ

40

plasmid pGEM-T Eseay chèn sản phẩm PCR (B) Hình bên phải là kết quả

điện di chip sản phẩm HIV1DNA-IC kích thước 200bps (lane 1) và sản phẩm

HIV1RNA-IC kích thước 300bps (lane 2) phiên mã từ plasmid pGEM-T

Eseay chèn sản phẩm PCR

18

(A) Biểu đồ khuếch đại dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có (màu đỏ) và không

có (màu xanh) cho thêm 10µl chứa 100 copies chứng nội HIV1RNA-IC trước

khi tách chiết RNA để tổng hợp cDNA rồi chạy real-time PCR Kết quả cho

thấy cả hai dãy pha loãng ở nồng độ cuối đều cho tín hiệu khuếch đại, chứng

tỏ chứng nội HIV1RNA-IC ở nồng độ 100 copies cho vào thể tích mẫu tách

chiết đã không cạnh tranh với đích (B) Biểu đồ khuếch đại của chứng nội

HIV1RNA-IC trong các 5 mẫu HIV1RNA-C[+] có cho 10µl chứng nội vào

mẫu, kết quả này chứng minh chứng nội thật sự được khuếch đại khi cho vào

HIV1-TQPCR mix

41

19 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm

lượng copies 1 đến 1010 copies trong 150µl huyết tương 41

20 Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 3 dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm

lượng copies 1 đến 108 copies trong 150µl huyết tương 42

21

Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm

lượng copies 1 đến 108 copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm

trong ngày 1

43

22

Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm

lượng copies 1 đến 108 copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm

trong ngày 2

43

23

Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm

lượng copies 1 đến 108 copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm

trong ngày 3

43

24

Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 4 mẫu huyết tương dương tính HBV,

HCV, CMV và S aureus cho thấy không có tín hiêu khuếch đại dương tính

cho HIV1RNA mà chỉ có tín hiệu khuếch đại dương tính cho chứng nội

(HIV1RNA-IC) chứng tỏ các mẫu thất sự âm tính HIV1RNA Các chuẩn định

lượng cho đường khuếch đại màu đỏ

44

25

Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 4 cặp mẫu huyết tương có pha loãng

HIVRNA-C[+] và trong mỗi cặp có 1 mẫu thêm chất ức chế (đường màu đen)

và 1 mẫu không thêm chất ức chế (đường màu xanh lá)

45

26

Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện

HIV1RNA trong 2 mẫu 103 và 107 copies HIV1RNA có trong 150µl, thực

hiện ngay sau khi pha

45

27 Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện

HIV1RNA trong 2 mẫu 103 và 107 copies HIV1RNA có trong 150µl, thực 45

hiện sau 4 tháng bảo quản

28

Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện

HIV1RNA trong 2 mẫu 103 và 107 copies HIV1RNA có trong 150µl, thực

hiện sau 8 tháng bảo quản

46

29

Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện

HIV1RNA trong 2 mẫu 103 và 107 copies HIV1RNA có trong 150µl, thực

hiện sau 12 tháng bảo quản

46

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Hùng Vân đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều

kiện thuận lợi, giúp đỡ con trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Nam Khoa đã hộ trợ kinh phí và tạo

mọi điều kiện thuận để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài

Đồng cảm ơn tất cả anh chị phòng Kiểm tra Chất lượng, phòng RD và phòng Sinh

học Phân tử Công ty Nam Khoa đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn quý cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công

nghệ trẻ đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn quý cơ quan chủ quản đề tài: Sở khoa học và Công nghệ Tp

Hồ Chí Minh đã đồng ý và cấp kinh phí cho tôi nghiên cứu đề tài này

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Tên đề tài

Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency Virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR

Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: Nguyễn Việt Quốc

Học vị: Cử nhân Công nghệ Sinh học Năm đạt học vị:

2005

Cơ quan công tác Công ty TNHH Nam Khoa

Cơ quan chủ trì Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ trẻ

Thời gian thực hiện đề tài 12 tháng

Kinh phí được duyệt 80.000.000 đồng

Kinh phí đã cấp 49.000.000 đồng theo TB số : /TB-SKHCN ngày

Mục tiêu Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định

lượng Human Immunodeficiency Virus – 1 trong

huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR

Nội dung

Thu nhận mẫu huyết tương dương tính và âm

tính với HIV bằng thử nghiệm ELISA

50 mẫu huyết tương dương tính và 20 mẫu huyết tương âm tính

Thực hiện thử nghiệm với kits Qiagen với

huyết tương thu nhận được

Xác định mẫu huyết tương dương tính

và âm tính với HIV1RNA

Nghiên cứu thiết kế các thành phần của quy

Thực hiện thử nghiệm so sánh quy trình nghiên

cứu với bộ Amplicor HIV1 Monitor

Thông số chất lượng của quy trình thử nghiệm

Hoàn thiện sản phẩm và nghiệm thu đề tài Qui trình hoàn thiện

PHẦN 2 ĐẶT VẤN ĐỀ

Đại dịch HIV/AIDS (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) đang là hiểm hoạ cho toàn cầu Số người nhiễm HIV/AIDS trên thế giới thay đổi không ngừng và không thể có con số thống kê chính xác, nhất là trên bình diện thế giới Chỉ tính riêng ở Việt Nam, tính đến tháng 5 năm 2008 tổng số người nhiễm HIV tử vong ở nước ta lên đến 39.180 người Số trường hợp nhiễm còn sống là 127.442 trường hợp và số bệnh nhân AIDS tích lũy từ đầu năm đã lên tới 1.892 trường hợp[32] Tuy nhiên, y học thế giới vẫn chưa tìm ra được vaccin phòng bệnh đặc hiệu Thuốc điều trị chỉ có thể ngăn chặn sự nhân lên của virus nhưng rất dễ bị đề kháng, rất đắt và thường chỉ phổ biến ở các nước phát triển Ơ các nước đang phát triển thì việc dùng thuốc điều trị HIV đặc hiệu còn nhiều hạn chế

Hiện nay, với sự phát triển của Công nghệ Sinh học, đặc biệt là sinh học phân

tử đã mở nhiều hướng mới cho việc phát hiện và điều trị căn bệnh thế kỹ này Các trường đại học, các viện nghiên cứu như Pastuer, các doanh nghiệp đã tiến hành nghiên cứu, áp dụng các phương pháp hiện đại như PCR, RT-PCR, real-time PCR trong việc phát hiện và theo dõi điều trị

Trong các phương pháp chẩn đoán thì RT- real-time PCR là một sự tiến bộ vượt bậc cho ta độ chính xác cao và thời gian ngắn Điều này có ý nghĩa quan trọng đối với các nhà lâm sàng trong việc chuẩn đoán và điều trị các trường hợp nhiễm HIV1 Và quan trọng hơn nữa nếu chúng ta xây dựng thành công

bộ kits phát hiện và định lượng HIV1 bằng kỹ thuật real-time PCR với giá thành phù hợp với người có thu nhập thấp như ở Việt Nam chúng ta

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng

quy trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1

trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR”

Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của đề tài là: Xây dựng quy trình phát hiện

và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1 trong huyết tương

người bằng kỹ thuật real-time PCR

PHẦN 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, vào thời điểm tháng 6/1994 trên thế giới có 985.199 ca AIDS thì đến tháng 12/1996 có 22,5 triệu người nhiễm HIV và đến tháng 10/1999 có 33,4 triệu người nhiễm HIV[31] Tốc độ dịch phát triển ở châu Á còn nhanh hơn nữa Từ tháng 6/1993 có 30.000 ca AIDS thì đúng 1 năm sau, tháng 6/1994 có 250.000 ca, tức là tăng 8 lần Năm 1999

có 14,5 triệu người nhiễm Số người nhiễm HIV/AIDS trên thế giới thay đổi không ngừng và vì thế không thể có con số thống kê chính xác, nhất là trên bình diện thế giới Trong các Hội nghị quốc tế về AIDS gần đây nhất người ta đánh giá rằng hiện 95% tổng số người nhiễm HIV sống ở các nước đang phát triển, và 95% những người đã chết vì AIDS cũng ở các nước đang phát triển Chương trình phối hợp của Liên hợp quốc về HIV/AIDS (UNAIDS) đã thông báo đến cuối năm 2006 trên thế giới có khoảng 39.5 triệu người nhiễm HIV đang còn sống, trong đó phụ nữ chiếm gần 50% (17.7 triệu người) và trẻ em dưới 15 tuổi là 2.3 triệu người Tổng số người nhiễm HIV hằng năm vào khoảng 4.3 triệu người[ 32] Tỷ lệ nhiễm HIV vẫn tiếp tục gai tăng nhiều nơi trên thế giới, điển hình là các khu vực Nam Á, trung Á và Đông Âu, và cũng theo thống kê của tổ chức này (UNAIDS) vào thời điểm cuối năm 2007 có khoảng 30.8 triệu người lớn và 2 triệu trẻ em đang sống với HIV[30] Tại châu

Á, các nước Campuchia, Thái Lan và Myanma được đánh giá là những nước

có tỷ lệ nhiễm HIV cao nhất khu vực, tiếp theo là Indonesia, Nepan, Việt Nam

và Trung Quốc….Chính vì thế đã có nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp hiện và theo dõi điều trị HIV Hiện tại các nhà khoa học đã nghiên cứu

và tìm ra nhiều phương pháp chuẩn đoán cũng như theo dõi điều trị hữu hiệu Thông thường chẩn đoán bằng phương pháp ELISA , ngoài ra các nhà khoa học nghiên cứu sâu về phương pháp sinh học phân tử, với ưu điểm phát hiện các trường hợp nhiễm sớm và giúp ích cho quá trình theo dõi điều trị[35] Có nhiều công trình nghiên cứu và sáng chế liên quan đến các kỹ thuật phát hiện

và địnhlượng HIV1 và cũng từ đó đã có những sản phẩm thương mại có liên quan như các bộ kit phát hiện và định lượng HIV1-RNA của Roche, của Abbott

1.2 Tình hình nhiễm HIV tại Việt Nam

Trường hơp nhiễm HIV đầu tiên ở nước ta phát hiện vào tháng 12 năm 1990 tại thành phố Hồ Chí Minh Nhưng thực sự dịch HIV/AIDS bắt đầu bùng nổ từ

1993 trong nhóm những người nghiện chích ma túy tại thành phố Hồ Chí Minh Sau đó dịch bắt đầu lan ra các tỉnh Tính đến tháng 12 năm 2002, theo báo cáo của các tỉnh thành, cả nước đã phát hiện 58.490 trường hợp nhiễm HIV, 8.718 trường hợp biến chuyển thành bệnh AIDS và 4.834 trường hợp đã

tử vong[33] Tính đến tháng 6 năm 2008, đại dịch HIV ở nước ta đang tăng với tốc độ gắp hai lần so với cùng kỳ name 2007 Trong các ca nhiễm HIV thì có tới 83.3% ở độ tuổi từ 20 đến 39, tỷ lệ nhiễm ở nam giới cao gấp 4 lần so với

nữ giới[32] Theo thống kê từ cục phòng chống HIV/AIDS, đa phần các trường

hợp nhiễm HIV ở nước ta là nghiện chích ma túy hoặc liên quan đến ma túy, con đường lây nhiễm chủ yếu hiện nay là sử dụng chung kim tiêm và quan hệ tình dục không an toàn; 100% tỉnh /thành nước ta có người nhiễm HIV Tại một số địa phương, tỷ lệ người nghiện ma túy quan hệ tình dục với gái mại dâm cũng đang tăng mạnh như: An Giang (43,3%), Đà Nẵng (35,2%), Cần Thơ (28,9%) Cũng trong khoãng thời gian này tổng số người nhiễm HIV tử vong ở nước ta lên đến 39180 người Số trường hợp nhiễm còn sống là 127.442 trường hợp Tính riêng đến tháng 05 năm 2008, số bệnh nhân AIDS tích lũy từ đầu năm đã lên tới 1.892 trường hợp

Theo số liệu Cục Phòng chống HIV, đến nay đã có 203 điểm điều trị HIV bằng thuốc đặc hiệu kháng virus (ARV) tại tất cả 63 tỉnh, thành phố Ngoài ra

ở nước ta, bệnh viện Bình Triệu, công ty dược phẩm Stada Việt Nam, viện nghiên cứu và điều trị bệnh hiểm nghèo đã và đang nghiên cứu chế tạo ra các loại thuốc điều trị hữu hiệu cũng như thuốc làm tăng sức đề kháng tránh nhiễm trùng cơ hội đối với bệnh nhân nhiễm HIV[31] Cụ thể những bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS được điều trị bằng ARV, nếu bệnh nhân đáp ứng tốt với thuốc thì nồng độ virus tự do trong máu sẽ giảm lại và số lượng tế bào CD4 tăng lên Ngược lại, nếu hàm lượng virus tự do trong máu vẫn tăng và số lượng tế bào CD4 vẫn giảm thì bệnh nhân không đáp ứng với thuốc có thể do nhiều nguyên nhân như: không phối hợp thuốc, thuốc không có dược tính cao, hay chủng HIV có những đột biến gây tính kháng thuốc

Hiện nay các trường đại học, các viện nghiên cứu như Pasteur, các doanh nghiệp đã tiến hành nghiên cứu, áp dụng các phương pháp hiện đại như PCR, RT-PCR, real-time PCR trong việc phát hiện và theo dõi điều trị: Trường Đại Học Y Dược đã và đang nghiên cứu nhiều đề tài như tìm hiểu tình hình kháng thuốc Antiretro virus (ARV) của virus HIV trên các bệnh nhân nhiễm HIV, đề tài nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR, PCR nested

để khuếch đại các vùng gen ENV, PRO, RT), phân tích trình tự nucleotid và phát hiện đột biến kháng thuốc bằng phương pháp so sánh với ngân hàng dữ liệu quốc tế về tính kháng thuốc ARV Trường Đại Học Y Hà Nội, tác giả Đàm Tú Anh nghiên cứu sự lây truyền HIV từ mẹ sang con bằng kỹ thuật RT-PCR/HIV1 và PCR/HIV1 Viện Pastuer TP HCM, Ths Trần Chí Thành chủ nhiệm đề tài, đang nghiên cứu kỹ thuật PCR trong chuẩn đoán sớm nhiễm HIV/AIDS ở trẻ (< 18 tháng tuổi) có mẹ bị nhiễm HIV

2.1 Một số đặc điểm sinh học của HIV

HIV là một retrovirus thuộc họ lentivirus có vật

liệu di truyền là RNA Quá trình nhân lên của

HIV qua giai đọan trung gian DNA nhờ

enzyme sao chép ngược Sau một thời gian ủ

bệnh kéo dài, các lentivirus làm suy giảm hệ

thống miễn dịch kéo dài trong suốt giai đoạn

gây bệnh[30]

2.2 Các type di truyền của HIV

HIV gây bệnh AIDS thường gặp nhất là HIV1 và là tác nhân gây bệnh lan rộng khắp thế giới Tác nhân thứ hai là HIV-2, ít gặp hơn và độc lực thấp hơn nhưng vẫn cho các triệu chứng lâm sàng giống HIV1, tuy nhiên chúng khác nhau ở một số điểm: Về di truyền: bộ gen của HIV1 và HIV-2 có cấu trúc di truyền khác nhau Trên 50%, HIV-2 giống với SIV (gây bệnh ở khỉ) Kháng nguyên của hai virus này cũng khác nhau Trọng luợng phân tử của các thành phần cấu trúc cũng khác biệt Thời gian không triệu chứng của HIV-2 cũng dài hơn HIV1 Tỷ lệ nhiễm HIV1 cao hơn HIV-2.[48]

Những chủng của HIV1 có thể được xếp lớp vào 4 nhóm: nhóm M "chính",

nhóm O "biệt lệ" và 2 nhóm mới, N và P Nhóm O: xuất hiện giới hạn ở tây – trung Phi và nhóm N: nhóm cực kỳ hiếm được khám phá năm 1998 ở Cameroon Nhóm P: một chủng mới liên quan gần gũi với virus suy giảm

miễn dịch loài linh trưởng ở loài khỉ đột (gorilla) được phát hiện ở một phụ nữ người Cameroon năm 2009 Hơn 90% người nhiễm HIV1 thuộc nhóm M Với

nhóm M: có ít nhất 9 phó type di truyền khác biệt nhau của HIV1 Các phó

type này là A, B, C, D, F, G, H, J và K

Đôi khi, 2 virus có các phó type khác nhau có thể gặp nhau trong tế bào của một người nhiễm và trộn lẫn với nhau về các chất liệu di truyền của chúng để tạo nên một virus mới được lai tạo và đôi khi được gọi “giới tính virus” Nhiều trong số các chủng virus mới này không thể sống sót lâu dài, nhưng người ta biết những chủng mà gây nhiễm nhiều hơn một như là “những thể tái tổ hợp

lưu hành” viết tắt CRFs Lấy ví dụ, thể tái tổ hợp lưu hành A/B là một hổn

hợp của các phó type A và B

Một trong các thể của CRFs được gọi là A/E bởi vì người ta nghĩ là nó được tạo ra từ sự lai tạo giữa phó type A và một số phó type E của thế hệ "cha mẹ" khác Tuy nhiên, chưa một ai đã từng tìm thấy một thể thuần chủng của phó type E Một cách nhầm lẫn, nhiều người vẫn qui cho CRF A/E như là "phó type E" (trên thực tế nó được gọi chính xác nhất là CRF01_AE)

Các phó type và CFRs của HIV1 thường được kết hợp với các khu vực địa lý

nhất định, phổ biến nhất phó type A và C Phó type A và CRF A/G chiếm ưu

thế ở phương Tây và Trung Phi, với phó type A có thể cũng gây ra

nhiều vụ dịch ở Nga Về mặt lịch sử, phó type B là phó type/CRF phổ biến

nhất ở châu Âu, châu Mỹ, Nhật Bản và Australia và là phó type chủ yếu được tìm thấy trong nhóm MSM bị nhiễm ở châu Âu Các phó type khác đang ngày càng trở nên hay gặp và bây giờ chiếm ít nhất 25% số ca nhiễm HIV mới ở

châu Âu Phó type C chiếm ưu thế ở miền Nam và Đông Phi, Ấn Độ và Nepal

đã gây ra các dịch HIV tồi tệ nhất thế giới và chịu trách nhiệm cho khoảng

một nửa của tất cả các ca bệnh Phó type D thường giới hạn ở Đông và Trung

Phi Hiện nay, type CRF01_AE (tái tổ hợp vật chất di truyền giữa typ A và

E) là phân type gây đại dịch ở các nước Đông Nam Á và cũng là phân nhóm chiếm đến 97% phân typ HIV-1 lưu hành tại Việt Nam nhưng có nguồn gốc

từ Trung Phi Phó type F đã được tìm thấy ở Trung Phi, Nam Mỹ và Đông

Âu Phó type G và CRF A/G đã được quan sát ở Tây và Đông châu Phi và

Trung Âu Phó type H chỉ được tìm thấy ở Trung Phi, Phó type J chỉ

có ở Trung Mỹ và K chỉ có tại Cộng hòa Dân chủ Congo và Cameroon.[49]

Liệu có thể có thêm nhiều phó type sẻ “xuất hiện”: Gần như chắc chắn rằng

các phó type gene mới và CRFs của HIV sẽ được phát hiện trong tương lai, và thực sự rằng là những phó type mới và CFRs mới sẽ phát triển vì sự tái tổ hợp

và đột biến của virus vẫn tiếp tục xảy ra Các phó type và CRFs hiện nay cũng

sẽ tiếp tục lây lan đến các khu vực mới khi đại dịch toàn cầu vẫn tiếp diễn [48]

2.3 Cấu trúc HIV

2.3.1 Hình thể và cấu tạo virus

Trên kính hiển vi điện tử virus HIV có dạng hình cầu lởm chởm, xù xì Đường kính khoảng từ 100-120 nanometres, khoảng 60 lần nhỏ hơn một tế bào hồng cầu[44] Virus HIV hoàn chỉnh có cấu tạo từ ngoài vào trong gồm có 3 lớp:

Bao ngoài: Là màng lipid kép Trên màng này là các phân tử glycoprotein,

dưới có chứa nhiều các núm (gai nhú) trên bề mặt là các phân tử glycoprotein

có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (Gp160), gồm 2 thành phần: Gp120

đảm nhận vai trò phân tử nhận biết thụ thể CD4+ có trên tế bào lympho CD4

và một số tế bào khác, nhờ đó virus bám được vào tế bào đích Gp41 (ở HIV2

thì đây là Gp36) là các glycoprotein xuyên qua màng lipid tham gia vào giai đoạn hòa màng của virus và tế bào nhiễm Như vậy những phân tử Gp120 và Gp41 có vai trò giúp cho virus bám và xâm nhập vào tế bào đích Lớp vỏ bao mới được tạo thành khi vỏ capsid của HIV nẩy chồi từ protein tế bào chủ[42]

Vỏ trong ( capsid) gồm 2 lớp protein: Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi phân tử

protein có trọng lượng phân tử là 17 kilodalton (P17), P17 này được mã hóa bởi gene Gag và quy định chất nền che chở Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi phân tử protein có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (P24), P24 được mã hóa bởi gene Gag và cung cấp yếu tố cấu trúc của virus Ngoài ra còn có vỏ capsid của nhân (P7 và P6) liên kết với bộ gen RNA và bảo vệ RNA khỏi sự tiêu hóa bởi nhân Chất nền tạo một sự liên kết của protein P17 xung quanh vỏ capsid, bảo đảm cho toàn bộ phần tử của protein vỏ Hơn nữa bao chung quanh trong các phần tử của vỏ protein virus là Vif, Vpr, Nef, P7 và enzyme protease virus

Lõi HIV được tạo từ 2 sợi RNA đơn giống hệt nhau được bao chung quanh

bởi vỏ capsid hình trụ là protein P24, sợi đơn RNA được kết hợp thành khối

chặt chẽ với protein vỏ capsid P7 và các enzyme cần thiết như: RT (Reverse

transcriptase): còn gọi là enzyme sao chép ngược, là enzyme RNA dạng hoạt

động: P66/51 ở HIV1, và P68 ở HIV-2, đảm nhiệm phiên mã bộ gene virus

thành DNA bổ sung(cDNA) Protearase (P12): Cắt các polyproteine được mã hoá thành các protein cấu trúc hoặc chức năng Intergrase (P31 ở HIV1 và

P34 ở HIV-2): Đảm nhiệm sự tích hợp DNA của virus vào nhiễm sắc thể của

tế bào ký chủ, cho phép DNA của virus trở thành 1 phần bộ gen tế bào chủ Ngoài ra còn một số gene tổng hợp các protein chức năng điều hòa khác

2.3.2 Cấu trúc gene HIV

Mỗi sợi RNA có khoảng 9200

cặp base với 3 gen cấu trúc

chính là: Gene Gag (groupe

Antigen – Kháng nguyên đặc

hiệu nhóm): mã hóa cho

protein lõi của virus P24,

protein nhân capsid P6 và P7, và P17 bên trong của virus Gene Pol

(polymerase):mã hóa cho các loại enzyme virus, quan trọng nhất là Reverse

Transcriptase, integrase, protease Gene Env (enveloppe): mã hóa cho các

glycoprotein vỏ Gp41, Gp120 bao phủ ngoài có vai trò quan trọng trong việc giúp virus bám và xâm nhập được vào tế bào đích Ngoài 3 nhóm gene chính, genome của virus còn có các gene khác mã hóa cho các protein có chức năng điều hòa và protein có cùng tên với gen mã hóa cho nó: Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu Các LTR (long termina Repeat) là những vị trí lồng ghép trong bộ gene đặc biệt vùng U3 của R và 5’LTR chứa các chuỗi điều hòa sao chép và là

vị trí khởi đầu cho sự sao chép[48]

2.4 Sức đề kháng của virus HIV

HIV đề kháng với nhiệt độ lạnh, tia gamma, tia cực tím Sống được 3 ngày trong máu của bệnh nhân nếu để ở ngoài trời

Virus HIV dễ bị tiêu diệt bởi alcol 72oC, javel, bị bất hoạt ở pH=1 hay pH=13 Đun nóng 56oC trong vòng 30 phút trong môi trường ẩm ước virus dễ bị tiêu diệt

Thời gian từ lúc nhiễm HIV đến lúc có chẩn đoán AIDS khá thay đổi Một số bệnh nhân biểu hiện triệu chứng sau vài tháng nhiễm, trong khi một số khác lại không biểu hiện triệu chứng đến 20 năm

Tiến trình từ lúc nhiễm HIV tới AIDS trải qua 4 giai đoạn: Giai đoạn sơ

nhiễm hay giai đoạn cửa sổ: 2-8 tuần sau khi nhiễm HIV, 20% bệnh nhân có

một số triệu chứng như sốt cao, đau cơ, mệt mỏi, chán ăn, tiêu chảy Phát ban

đỏ ngoài da xuất hiện ở 50% bệnh nhân Các triệu chứng này hiện diện 5-10

Hình 4: Vị trí của các gene trong bộ gene HIV

ngày và tự khỏi hoàn toàn Giai đoạn này mới có kháng nguyên HIV, 2-12

tuần sau kháng thể mới xuất hiện Giai đoạn nhiễm HIV không triệu chứng:

Sau thời kỳ cửa sổ, bệnh nhân nhiễm HIV rơi vào giai đoạn dài không triệu

chứng lâm sàng Kéo dài từ 2-10 năm Giai đoạn nhiễm HIV có triệu chứng:

Trong giai đạn này người nhiễm HIV có các triệu chứng rõ ràng và kéo dài tới bệnh AIDS: sốt, hạch to, ho, khó thở, sút cân, tổn thương da, niêm mạc, ĩa chảy, gan to, lách to, nhức đầu, và các bệnh nhiễm trùng cơ hội như candida

miệng, viêm da(không zona,zona), lao phổi Giai đoạn bệnh AIDS: Khi bệnh

nhân chẩn đoán là AIDS nghĩa là nhiễm HIV giai đoạn cuối

Thời gian từ lúc xác định bệnh đế khi chết thường không quá 2 năm Biểu hiện lâm sàng chính thường là nhiễm trùng cơ hội (ở phổi, hệ thần kinh, hệ tiêu hoá) hoặc ung thư Những chỉ số sinh học lâm sàng như nồng độ virus tự

do và kháng nguyên p24 trong máu, các kháng thể kháng HIV, và số lượng tế bào T CD4 của bệnh nhân nhiễm HIV thay đổi trong tiến trình bệnh sang giai đoạn AIDS[48]

3.1 Nồng độ HIV1 tự do và kháng nguyên p24 trong huyết tương

Nồng độ virus tự do trong huyết tương và nồng độ kháng nguyên p24 (một lọai kháng nguyên cấu thành lõi của HIV) tỷ lệ thuận với nhau, hai chỉ số này

có giá trị rất cao ở giai đọan nhiễm cấp (2-8 tuần đầu) Khi các virus chuyển sang dạng tiềm ẩn DNA provirus trong các tế bào đích (T CD4 chủ yếu) thì nồng độ virus tự do và kháng nguyên p24 sẽ giảm dần Dựa vào chỉ tiêu trên, người ta có thể phát hiện chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS trực tiếp bằng các phương pháp sau: Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy tế bào đơn nhân (PBMC) Phát hiện RNA hoặc DNA provirus của HIV bằng kỹ thuật sinh học phân tử

3.2 Sự xuất hiện của các kháng thể kháng HIV1 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS

Các kháng thể kháng HIV1 sẽ xuất hiện sau 1- 3 tháng so với thời điểm bắt đầu nhiễm HIV Khả năng trung hòa của các kháng thể này rất kém cho nên bệnh vẫn diển tiến, đây là hiện tượng đáp ứng đáp ứng miễn dịch không đầy

đủ[28]

Chẩn đoán phát hiện nhiễm HIV/AIDS ở người hiện nay đang sử dụng kỹ thuật ELISA và Westernblot để phát hiện sự tồn tại của kháng thể kháng HIV1 trong huyết thanh Tuy nhiên các kỹ thuật này rất dễ cho kết quả âm tính giả

do bỏ soát giai đoạn “cửa sổ “ của bệnh nhân khi kháng thể chưa được tổng hợp Do đó trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV/AIDS người ta dựa vào các chỉ tiêu RNA virus tự do, kháng nguyên p24, DNA provirus bằng kỹ thuật sinh học phân tử[48]

3.3 Lượng tế bào miễn dịch T CD4

Việc xác định tương đối giai đoạn nhiễm HIV/AIDS được dựa vào sự suy giảm của chỉ số tế bào miễn dịch T CD4: Giai đoạn mới nhiễm (2-6 tuần), số lượng tế bào T CD4 giảm nhẹ Giai đoạn ủ bệnh kéo dài trong nhiều năm, số

lượng tế bào TCD4 giảm dần Giai đoạn AIDS, số lượng tế bào T CD4 thấp

hơn 500 tế bào/µl máu

3.4 Các xét nghiệm được sử dụng để phát hiện và theo dõi nhiễm HIV/AIDS

Các phương pháp xét nghiệm sử dụng cho chẩn đoán nhiễm HIV là kiểm tra

sự thể hiện của kháng thể bao gồm kiểm tra nhanh và kiểm tra để chứng thực,

ước định sự tiến triển của bệnh, dự đoán và đưa ra các phép chữa bệnh (số

lượng tế bào lympho CD4, số lượng virus HIV), và từ đó có thể ước định

phương pháp thích hợp để điều trị Trong thời gian qua nhiều phương pháp

được sử dụng để phát hiện và định lượng HIV được sử dụng ở Việt Nam và

thế giới như là: kỹ thuật ngưng kết hạt vi lượng (Microtiter Particle

Agglutination), kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme ELISA (Enzyme – Linked

Immunosorbent Assay), các thử nghiệm khẳng định như là: thử nghiệm miễn

dịch điện di Western blot, thử nghiện miễn dịch huỳnh quang (Immuno –

Fluorescence Assay IFA) Hiện nay, nước ta Bộ Y tế đã ban hành Hướng

dẫn thực hiện xét nghiệm tải lượng HIV1 trong theo dõi điều trị HIV/AIDS

(Quyết định số 1921/QĐ-BYT, ngày 05/6/2013, của Bộ Y tế).[49]

4.1 Khái niệm real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị

được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là

real-time; và do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm

không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để

xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của

phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng

khuếch đại Như vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA

đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết

quả khuếch đại trong ống phản ứng

được hiển thị cùng lúc với phản ứng

khuếch đại xảy ra để người làm thí

nghiệm có thể thấy được[9]

Huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA:

Khởi thủy ethidium bromide được sử

dụng cho nguyên tắc real-time PCR

này, nhưng sau này các nhà khoa học

sử dụng SYBR I vì các ưu điểm vượt

trội hơn như màu huỳnh quang nền rất

thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao

nhưng không làm cho sợi đôi bị gắn

chặt vào nhau khi bị biến tính nhờ vậy

mà ảnh hưởng ít lên hiệu quả PCR

Nguyên tắc của kỹ thuật này là khi

không có sự hiện diện sản phẩm

khuếch đại của PCR, chất huỳnh quang

bị phân tán trong dung dịch PCR mix,

Nguồn sáng kích thích

Hình 5: Cơ chế hoạt động của SYBR I (1) Khi chưa có

sản phẩm khuếch đại thì ống thứ nghiệm không phát được hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích, (2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì SYBR I chèn vào và tập trung trên phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi nhân được ánh

(1) (2)

Ánh sáng hùynh quang

do vậy mà tube phản ứng sẽ không bị phát huỳnh quang hay chỉ phát huỳnh quang không đáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích Nhưng khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của PCR thì màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào

và tập trung trên các sợi đôi DNA của sản phẩm khuếch đại và sẽ làm cho tube phản ứng bị phát huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích [9]

Probe làm chất phát huỳnh quang, đó là những đoạn oligonucletides sợi đơn

có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích (trong PCR, đó là sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích) Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, và khi có sự bắt cặp này thì sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích Có

nhiều loại probe được sử dụng, thông thường nhất là taqman probe, beacon

probe và probe lai

Cơ chế phát huỳnh quang

của Taqman probe trong

hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn

nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng

hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích[9]

Beacon probe là probe có trình tự dài khoảng 25-40 bases, có đầu 5’ gắn với reporter và đầu 3’ gắn với quencher Probe có trình tự 15-39 bases ở giữa là bổ

[1] Khi chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc

hiệu, Taqman probe không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì huỳnh quang phát ra bị quencher hấp phụ hết

[2] (a) Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu,

Taqman probe sẽ bắt cặp trên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp sau giai đoạn biến tính

[2] (b) Taqman probe sẽ trở thành trình tự cản đầu

3’ khi Taq polymerase kéo dài mồi để bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung

[2] (c) Nhờ có hoạt tính 5’-3’ exonuclease nên

Taq polymerase sẽ cắt bỏ Taqman probe làm

huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ không còn

bị quencer hấp phụ nữa

[2] (d) Giai đoạn phát huỳnh quang của reporter

xảy ra trong suốt quá trình Taq polymerase

kéo dài mồi để tổng hợp sợi bổ sung

Hình 6: Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR

probe thì mỗi đầu có một

trình tự 5-6 bases bổ sung

với nhau làm cho probe tạo

thành cấu trúc hình kẹp tóc

do trình tự của hai đầu bắt

cặp nhau Cơ chế hoạt động

của Beacon probe được tóm

tắt như sau: (1) Ở giai đoạn

nhiệt độ biến tính, cấu trúc

kẹp tóc của Beacon probe

không còn nên nếu ở giai

đoạn này reporter nhận

nguồn sáng kích thích thì nó

sẽ phát huỳnh quang (2) Ở

giai đoạn nhiệt độ bắt cặp,

nếu chưa có mặt sản phẩm

khuếch đại đặc hiệu, Beacon

probe sẽ không phát được

huỳnh quang khi nhận được

nguồn sáng kích thích vì

cấu trúc kẹp tóc của hai đầu

đã làm cho repoter gần với

quencer khiến tất cả huỳnh

quang phát từ reporter đều bị

quencher hấp phụ Nhưng

nếu có mặt sản phẩm khuếch

đại đặc hiệu, Beacon probe

sẽ bắt cặp vào trình tự đặc

hiệu trên sợi đích của sản

phẩm khuếch đại, nhờ vậy

reporter cách xa quencher

nên reporter phát được

huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích (3) Trong giai đoạn nhiệt độ kéo

dài, enzyme Taq polymerase không thủy giải Beacon probe mà chỉ làm tách

Beacon probe khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự

mà probe bắt cặp vào Cuối giai đoạn kéo dài, Beacon probe tách khỏi sợi đích

và trở lại cấu trúc kẹp tóc nên không cho reporter phát được huỳnh quang nếu nhận được nguồn sáng kích thích

Trong kỹ thuật dùng probe lai, người ta dùng 2 probe Probe lai 1 có đầu 3’

gắn một chất phát huỳnh quang D (donnor), và probe lai 2 có đầu 5’ gắn một

chất phát huỳnh quang A (acceptor) Để tránh không cho probe lai 2 này có

thể kéo dài khi nó bắt cặp lên sợi khuôn, người ta thường gắn thêm một gốc phosphate ở đầu 3’ Hai probe lai này được thiết kế sao cho khi bắt cặp trên sợi khuôn thì đầu 3’ của probe lai 1 chỉ cách đầu 5’ của probe lai 2 khoảng từ 3-5 bases, ngoài ra phải chọn D và A sao cho huỳnh quang từ D phát ra có độ dài sóng trùng với nguồn sáng kích thích của A để làm cho A phát ra được

Hình 7: Tóm tắt cơ chế họat động của Beacon

probe trong real-time PCR

R Q

Khi không có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, ở giai đọan nhiệt độ bắt cặp, Beacon probe sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được repoter gần với quencher khiến tất cả huỳnh quang phát từ reporter đều

bị quencher hấp phụ

Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, Beacon probe bắt cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi đích của sản phẩm huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích

huỳnh quang có độ dài sóng khác biệt với

huỳnh quang phát ra từ D Để hệ thống hoạt

động được thì thiết bị real-time phải phát

được nguồn sáng kích thích D, nhưng CCD

hay cảm quang phải có kính lọc để chỉ ghi

nhận huỳnh quang phát ra từ A chứ không

phải từ D Cơ chế hoạt động của hybridization

probes được tóm tắt như sau: Ở giai đoạn

nhiệt độ bắt cặp, nếu không có sản phẩm

khuếch đại đặc hiệu thì D của probe lai 1 phát

huỳnh quang do nhận được nguồn sáng kích

thích, nhưng thiết bị real-time không ghi nhận

được huỳnh quang này vì bước sóng phát ra

từ D không đi qua được kính lọc để đến CCD

camera hay cảm quang Nếu có sản phẩm

khuếch đại hiện diện thì probe lai 1 và probe

lai 2 bắt cặp được vào sợi khuôn, do vậy mà

huỳnh quang phát ra từ D sẽ là nguồn sáng

kích thích A, làm cho A phát huỳnh quang và

thiết bị real-time sẽ ghi nhận được huỳnh

quang này nếu lượng sản phẩm khuếch đại đạt

đủ ngưỡng để huỳnh quang phát ra từ A qua

được kính lọc để đến được CCD camera hay

cảm quang của thiết bị real-time Cơ chế hoạt động của probe lai như vậy nên

kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật FRET real-time (Fluorescence Resonance Energy Transfer)[9]

Khi phân tích một đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) sau khi hoàn tất được các chu kỳ nhiệt, chúng ta sẽ thấy một thông số hết sức quan trọng luôn đi kèm với nó, đó là chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) Chu kỳ ngưỡng hay Ct là

huỳnh quang xuất

Hình 9: Biển đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ

huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sánh kích thích ở mỗi

Giai đoạn ủ Giai đoạn lũy thừa Giai đoạn bình nguyên

Đường nền (base line) Cường độ huỳnh quang nền

Cường độ huỳnh quang

Đường biểu diễn khuếch đại

Chu kỳ nhiệt Chu kỳ nền

Hình 8: Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe lai

trong real-time PCR

Khi chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, huỳnh quang phát ra từ D của probe lai 1 không kích thích được A của probe lai 2 vì chúng ở cách xa nhau

D A

Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Probe lai 1 và probe lai

ra từ D (có bước sóng trùng với bước sóng nguồn sáng kích thích bước sóng khác biệt với bước sóng phát huỳnh quang của D

Trong giai đoạn kéo dài, Taq polymerase vì không có hoạt

tính 5’-3’ exonuclease nên sẽ tách các probe lai 1 rồi probe lai 2 khỏi sợi khuôn, do vậy là A tách rời D nên D không còn nhận được buồn sáng kích thích từ D nữa và A sẽ không còn

hiện trong ống phản ứng trong một số chu kỳ đầu, chúng ta gọi là các chu kỳ nền (basal cycle), và lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này làm cường độ huỳnh quang nền Đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền này được gọi là đường nền (base line) Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biển diễn khuếch đại Do được tính toán như vậy nên chu kỳ ngưỡng thường là một số lẻ (ví dụ: Ct = 28.35) chứ ít khi là một số chẵn Có những ống phản ứng có Ct sớm và cũng có những ống phản ứng có Ct xuất hiện muộn hơn, và câu hỏi được đặt ra là lý do nào đã làm được như vậy? Câu trả lời chính xác là do số lượng bản DNA đích ban đầu (starting quantity, Sq) có trong ống phản ứng nhiều hay ít Nếu

cho được tín hiệu

huỳnh quang mà máy

trội của real-time

PCR so với PCR cổ điển, vì nhờ dựa vào đặc điểm này mà người làm thí nghiệm xác định được số copies của tác nhân đích có trong mẫu thử, một thông số mà PCR cổ điển không thể nào làm để có được kết quả chính xác Tuy nhiên để real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử, người làm thí nghiệm phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng,

và thường thì các mẫu chuẩn là các mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10 chứa số lượng DNA đích ban đầu Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt của real-time PCR, trên biểu đồ khuếch đại, các mẫu chuẩn và các mẫu thử sẽ có các đường biểu diễn khuếch đại của nó và tương ứng với các đường biểu diễn khuếch đại này, các mẫu chuẩn và mẫu thử đều có một chu kỳ ngưỡng (Ct) Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn được gọi là đường biểu diễn chuẩn (standard curve) Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn trên trục tung) và chu kỳ ngưỡng của ống phản ứng chứa số lượng bản DNA đích này Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct còn trục hoành (X) là số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn Do các mẫu chuẩn thường được pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10, nên số lượng bản DNA đích trong các

Đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu chuẩn

Đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu thử

Hình 10: Biểu đồ khuếch đại vẽ lên các đường biểu diễn khuếch đại

của các mẫu thử và các mẫu chuẩn

mẫu chuẩn được biểu thị bằng logarith cơ số 10 (log10) của số lượng này Có hai thông số được máy tính toán và hiển thị trên một đường biểu diễn chuẩn Hai thông số này rất có giá trị để người làm thử nghiệm có thể đánh giá được thao tác pipetting của mình trong quá trình làm thử nghiệm Thông số đầu tiên

là hệ số tương quan R 2, đánh giá độ chính xác của thao tác pipetting lấy có đúng thể tích mong muốn hay không Trị số R2 phải đạt là trên hay bằng (≥) 0.99 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao Khi người làm thử nghiệm không lấy được các thể tích chính xác thì chắc chắn các thể tích mẫu chuẩn cho vào real-time PCR mix sẽ không thể nào chính xác được, nên

R2 chắc chắn sẽ không thể nào đạt ≥ 0.99 Một trị số nữa rất có giá trị mà

người làm thử nghiệm phải biết rõ đó là hiệu quả PCR, được gọi là E% (PCR

efficiency) Dĩ nhiên hiệu quả PCR lý tưởng là 100 %, trong thực tế thì hiệu quả PCR chấp nhận được là 90 % - 105 % Người làm thí nghiệm phải biết dùng hiệu quả PCR hiển thị trong biểu đồ chuẩn để đánh giá thao tác pipetting

để pha loãng mẫu của mình Hiệu quả PCR cũng là một thông số rất có giá trị

để nhà nghiên cứu tối ưu được kỹ thuật real-time PCR mà mình Nếu hiệu quả PCR thấp thì nguyên do có thể là thiết kế mồi chưa đạt độ nhạy, do tách chiết DNA đích còn các ức chế ngăn cản phản ứng khuếch đại Nếu hiệu quả PCR cao thì nguyên do lại có thể là do sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi hay của probe Số lượng tác nhân đích ban đầu có trong mẫu thử được tính toán nhờ vào hàm số biểu thị mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng (Y = Ct) với log10của số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng (X = log10 Sq) Hàm số đó là: Y = [slope

nghiệm sẽ hiểu được tại

sao máy tính hiển thị

được Sq, đó là nhờ tính

toán từ Sq = 10[(Ct –

intercept)/slope]

Từ Sq này, người làm thí nghiệm sẽ

tính được số lượng tác

nhân đích ban đầu có

trong mẫu thử dựa vào

hiệu quả tách chiết

nucleic acid đích từ mẫu

thử và các pha loãng nếu

có trong quá trình tách

chiết củng như thực hiện

real-time PCR[9]

4.2 Real-time PCR ứng dụng định lượng tác nhân vi sinh vật trong mẫu thử

Có hai cách định lượng tác nhân đích dựa vào mục đích định lượng mà người

Hình 11: Biển đồ chuẩn vẽ lên đường biểu diễn chuẩn về mối

quan hệ giữa số lượng bản DNA đích có trong các mẫu chuẩn

và chu kỳ ngưỡng tương ứng Trong biểu đồ ở trên này, chúng

ta E2-E4-E7 là các ống phản ứng chứa các mẫu chuẩn còn B4

là ống phản ứng chứa mẫu thử

Định lượng tuyệt đối: Người làm thử nghiệm sẽ sử dụng định lượng tuyệt đối

nếu mục đích của xét nghiệm là định lượng để biết rõ số copies của tác nhân đích có trong mẫu thử hay trong bệnh phẩm Ví dụ xét nghiệm định lượng virus viêm gan B, hay viêm gan C, hay HIV trong mẫu máu của bệnh nhân để theo dõi hiệu quả điều trị đặc hiệu Phương pháp định lượng này đòi hỏi phải biết rõ lượng (thể tích, hay có thể là trong lượng) của mẫu thử Để có thể thực hiện phương pháp định lượng tuyệt đối, nhà nghiên cứu hay người làm thí nghiệm phải thực hiện xét nghiệm real-time PCR của mẫu thử cùng lúc với các mẫu chuẩn đã biết trước số lượng rồi tính ra số copies DNA của tác nhân đích có trong ống[9]

Định lượng tương đối: Nếu muốn định lượng tác nhân đích mà người làm thí

nghiệm không thể cân đo đong đếm được mẫu thử để có được số lượng chính xác thì nên làm phương pháp định lượng tương đối Ví dụ định lượng HIV, HBV hay HCV trong các mẫu mô sinh thiết Định lượng tương đối cũng được

sử dụng trong các nghiên cứu về ung thư để định lượng một biển hiện gene nào đó, hay cũng được sử dụng trong định lượng sản phẩm biến đổi gene

5.1 Chứng dương

Chứng dương là trình tự DNA đích được cho vào PCR mix để cho sản phẩm khuếch đại có kích thước và trình tự giống hệt sản phẩm khuếch đại của của DNA đích tách chiết từ bệnh phẩm Chứng dương được cho vào PCR mix cho mỗi lần chạy PCR nhằm các mục đích sau: (1) Kiểm tra độ nhạy của PCR mix còn tốt không nếu chứng dương được cho vào PCR mix với lượng tối thiểu vừa đủ để cho được sản phẩm khuếch đại phát hiện qua điện di PCR được cho

là đạt độ nhạy khi chứng dương cho kết quả dương và được phát hiện bằng các phương pháp điện di và không đạt độ nhạy khi cho kết quả âm tính (2) Đối với PCR phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng điện di thì kết quả điện di sản phẩm PCR của chứng dương sẽ cho vạch điện di đúng kích thước mong đợi Nhờ vậy người đọc kết quả có thể dễ dàng so sánh vạch điện di sản phẩm PCR của mẫu bệnh phẩm với vạch điện di của chứng dương để kết luận mẫu bệnh phẩm là dương tính (khi cho vạch điện di có kích thước trùng với kích thước vạch điện di của sản phẩm PCR chứng dương ) hay âm tính (khi cho vạch điện

di không trùng với kích thước vạch điện di của sản phẩm PCR chứng dương) (3) Đối với PCR phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp lai trên giếng ELISA (PCR-ELISA ) hay trên màng (PCR-blot hybridization ) thì kết quả phát hiện sản phẩm PCR của chứng dương còn cho phép người thực hiện thử nghiệm có thể kiểm tra hệ thống phát hiện có đạt hay không: Nếu chứng dương cho kết quả dương tính phát hiện được qua điện di mà phản ứng lai lại cho phản ứng âm tính thì có thể kết luận là hệ thống phát hiện bằng lai không đạt (4) Tuy nhiên chứng dương cho PCR mix không kiểm tra được qui trình tách chiết nuclic acid từ mẫu có đạt hay không Muốn kiểm tra được vấn đề này người thực hiện thử nghiệm phải có một mẫu bệnh phẩm đã biết trước dương tính hay một mẫu giả bệnh phẩm dương để thực hiện tách chiết nucleic acid mẫu này song song với các mẫu thật[9]

5.2 Chứng âm

Chứng âm là mẫu nước tinh sạch hay TE 1X được cho vào PCR mix Chứng

âm cho PCR mix nên cho vào một PCR mix cho mỗi lần chạy PCR, và cho vào cuối cùng sau khi đã cho mẫu và chứng dương vào các PCR mix tương ứng với các mục đích sau: (1) Chứng minh thao tác cho mẫu và chứng dương vào các PCR mix không bị nhiễm chéo hay không bị nhiễm sản phẩm khuếch đại vì nếu chứng âm cho PCR mix cho kết quả dương sản phẩm khuếch đại thì thì có thể các thao tác trên bị nhiễm chéo hay ngoại nhiễm sản phẩm khuyếch đại (2) Chứng minh PCR mix đang sử dụng là hoàn toàn tinh sạch không bị nhiễm các DNA ngọai lai vì nếu chứng âm lại có kết quả sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu dương thì chứng tỏ PCR mix đã bị nhiễm các DNA ngoại lai (3) Tuy nhiên chứng âm cho PCR mix không kiểm tra được toàn bộ qui trình thực hiện thử nghiệm PCR có bị ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại hay nhiễm chéo không Muốn kiểm tra toàn bộ qui trình thực hiện thử nghiệm PCR thì người thực hiện thử nghiệm phải thực hiện qui trình PCR trên một mẫu thử đã biết trước âm tính và thực hiện song song với các mẫu bệnh phẩm[9]

5.3 Chứng nội tại

Là DNA được khuếch đại song song với DNA đích nhưng cho sản phẩm khuếch đại có kích thước khác (trong PCR kinh điển) sản phẩm khuếch đại của DNA đích như vậy có thể phân biệt được khi điện di; và trình tự khác hoàn toàn hay khác một phần (trong PCR-ELISA hay trong real-time PCR) nhờ vậy có thể phân biệt được khi sử dụng probe đặc hiệu (specific probe) Tùy thuộc cho vào các giai đoạn nào mà chứng nội tại có thể được dùng cho các mục đích sau: (1) Kiểm soát sự tách chiết trên mẫu bệnh phẩm tốt hay không nếu cho vào bệnh phẩm với lượng tối thiểu vừa đủ hay có sẳn trong bệnh phẩm (2) Kiểm soát được ức chế để xác định kết quả là âm tính thật hay

âm tính giả do chất ức chế còn hiện diện trong các mẫu tách chiết nếu được cho vào PCR mix trước hay sau khi cho tách chiết DNA từ bệnh phẩm (3) Kiểm soát hệ thống khuếch đại DNA đích có đạt được độ nhạy hay không nếu chứng nội tại dùng chung mồi với DNA đích và hiện diện trong mẫu thử hay cho vào trong PCR mix với lượng tối thiểu vừa đủ (4) Kiểm soát hệ thống tách chiết đang dùng có tốt hay không và thao tác có ngoại nhiễm nếu chứng nội tại có sẳn trong mẫu chứng âm và được tham gia tách chiết song song với mẫu bệnh phẩm[9]

Có nhiều loại chứng nội tại, đó là: (1) Chứng nội tại là DNA bộ gen vật chủ, ví

dụ  globin gene nếu bệnh phẩm là mô lấy từ người, hay myoglobin gene của tôm nếu bệnh phẩm là các mẫu tôm sú Để có thể khuếch đại được DNA chứng nội tại, chúng ta phải cho thêm vào trong PCR mix một cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội tại và nên thiết kế mồi sao cho nhiệt độ bắt cặp tương

tự nhiệt độ bắt cặp của mồi dành cho DNA đích, và không tạo ra các dimer primer với mồi của DNA đích Do sử dụng DNA bộ gene vật chủ nên chứng nội tại này kiểm soát đđược mẫu thử có đủ không, kiểm soát được hệ thống tách chiết nucleic acid trên mẫu thử có tốt không, kiểm sóat được ức chế có hay không Tuy nhiên loại chứng nội tại này không kiểm soát được hệ thống

phẩm có chứa đđủ lượng mô tế bào vật chủ (2) Chứng nội tại là DNA tổng hợp có nguồn gốc là DNA đích, đó là DNA được tổng hợp bằng cách dùng đúng sản phẩm khuếch đại của DNA đích nhưng cắt ngắn đi hay chèn một đoạn DNA nhỏ để làm cho nó dài hơn Chứng nội tại loại này sử dụng cùng mồi với DNA đđích nên không cần thiết kế mồi để cho thêm vào PCR mix Nếu cho vào bệnh phẩm trước khi tách chiết với lượng vừa đủ thì ta đạt được

3 mục đích, đó là kiểm soát được độ nhạy của toàn bộ qui trình xét nghiệm, kiểm soát được ức chế có hay không, và kiểm soát được có ngoại nhiễm không (3) Chứng nội tại là DNA tổng hợp có nguồn gốc khác DNA đích nhưng sử dụng cùng mồi với DNA đích, đó là DNA được tổng hợp bằng cách dùng sản phẩm khuếch đại của DNA khác biệt với DNA đích nhưng chèn ở hai đầu các trình tự giống hệt trình tự mồi của DNA đích Do sử dụng cùng mồi với DNA đích nên không cần thiết kế mồi để cho thêm vào PCR mix Nếu cho vào bệnh phẩm trước khi tách chiết với lượng vừa đủ thì ta đạt được 3 mục đích kiểm soát như trên (4) Chứng nội tại là một hệ thống mồi và DNA khác biệt hoàn toàn với DNA đích, được khuếch đại song song với DNA đích nhưng dùng mồi khác biệt DNA đích Để có thể khuếch đại được DNA chứng nội tại, phải cho thêm vào trong PCR mix một cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội tại và nên thiết kế mồi sao cho nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ bắt cặp của mồi dành cho DNA đích, và không tạo ra các dimer primer với mồi của DNA đđích DNA chứng nội tại loại này nếu được cho vào bệnh phẩm trước khi tách chiết với lượng vừa đủ thì cũng đạt được cả 3 mục đích kiểm soát nêu trên

6.1 Mục đích của sự tạo dòng

Mục đích của việc tạo dòng nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định Ngoài ra tạo dòng còn được dùng để chọn lọc một trình tự DNA trong một thư viện các dòng vi khuẩn tái tổ hợp

6.2 Các bước cơ bản của phương pháp tạo dòng

Các nhân tố tham gia vào quá trình tạo dòng (như vector, tế bào chủ, …) có

thể thay đổi nhưng tiến trình thực hiện đều gồm các bước sau: (1) Chọn và xử

lý vector: Việc chọn lọc vector phụ thuộc nhiều yếu tố: kích thước DNA cần

tạo dòng, mục đích tạo dòng Trước hết , vector được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym giới hạn Sau đó cả hai chổ mối cắt được xử lý để chúng không bị nối trở lại, vector chỉ có thể trở lại dạng vòng ban đầu khi hai chỗ mối nối được nối với trình tự DNA lạ Điều này nhằm tránh sự hình thành các

vòng vi khuẩn mang vector không tái tổ hợp (2) Xử lý DNA cần tạo dòng:

Trứơc hết chọn lọc các đoạn DNA có kích thứơc gần giống nhau và tương ứng với vector đã chọn Sau đó hai đầu DNA này được xử lý cho phù hợp với hai đầu chổ mối cắt của vector (dùng enzym cắt giới hạn để cắt tạo các đầu so le

tương hợp) (3) Tạo vector tái tổ hợp: Vector và DNA cần tạo dòng đã xử lý

sẽ được trộn chung theo tỷ lệ nhất định với sự hiện diện của ligase Ligase xúc tác phản ứng nối vector với DNA cần tạo dòng để tạo thành vector tái tổ hợp (recombinant) Vector tái tổ hợp sau đó sẽ được tinh sạch qua tách chiếc và

tủa (4) Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: Công đoạn này nhằm mục

đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một lượng lớn bản sao Tùy thuộc vào tế bào chủ, người ta sử dụng một kỹ thuật

chuyển thích hợp (5) Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gen: Để phát

hiện đoạn cần tìm, người ta sử dụng một mẫu dò, mẫu dò có thể là một kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa bởi gen cần tìm hoặc một trình tự DNA bổ sung cho gen cần tìm

PHẦN 4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Công trình nghiên cứu sẽ được thực hiện với những nội dung cụ thể như sau

1.1 Thiết kế mồi và taqman probe: (1) Mồi sử dụng là mồi đã được công bố dùng

khuếch đại một đoạn PCR từ gene gag (2) Taqman probe dành cho chứng dương có trình tự bắt cặp đặc hiệu với PCR đích và đầu 5’ gắn với chất phát huỳnh quang FAM (3) Taqman probe dành cho chứng nội tại có trình tự bắt cặp đặc hiệu với đoạn gen chứng nội tại được tổng hợp có đầu 5’ gắn với chất phát huỳnh quang HEX

1.2 Thu nhận 50 mẫu huyết tương dương tính và 20 mẫu huyết tương âm tính với HIV1 được chẩn đoán bằng phương pháp ELISA tại Trung tâm chẩn đoán y khoa Medic

1.3 Thử nghiệm một số mẫu huyết tương dương tính và âm tính ở trên với bộ thuốc thử của Qiagen để xác định chắc chắc vài mẫu huyết tương HIV1RNA dương tính và âm tính Qui trình thử nghiệm theo hướng dẫn của bộ kit

1.4 Với các mẫu huyết tương HIV1RNA dương tính được xác định: (1) Thử mồi

và các taqman probe đã được thiết kế thông qua chế HIV1 TQPCR master mix (2) Sử dụng bộ kit NK RNAPREP của công ty Nam Khoa để trích biệt RNA toàn phần (3) Phiên mã ngược RNA thành cDNA sử dụng bộ kit NK cDNA synthesis của công ty Nam Khoa (4) Dùng dịch cDNA này để thử hệ thống PCR khuếch đại đoạn DNA mong muốn trong cDNA của HIV

1.5 Từ sản phẩm đặc hiệu khuếch đại được, xây dựng hệ thống chứng dương và

chứng nội tại bằng kỹ thuật tạo dòng (1) Tạo chứng dương: Thực hiện thành

công bước 1.4, thu nhận được sản phẩm khuếch đại, chèn sản phẩm khuếch đại vào plasmid và ứng dụng kỹ thuật tạo dòng để tạo chứng dương HIV1RNA Pha loãng chứng dương HIV1RNA để thu được các chuẩn định

lượng HIV1RNA (2) Tạo chứng nội tại: Tổng hợp đoạn DNA để làm chứng

nội tại có trình tự hai đầu bắt cặp bổ sung với mồi khuếch đại với HIV-cDNA đích nhưng kích thước và trình tự khác biệt so với sản phẩm khuếch đại Chèn sản phẩm khuếch đại vào plasmid và ứng dụng kỹ thuật tạo dòng để tạo chứng nội tại HIV1RNA

1.6 Sau khi xây dựng thành công kỹ thuật RT-PCR, chứng dương và chứng nội tại tối ưu các thành phần của Realtime PCR dùng TaqMan probe để phát hiện

HIV-1 RNA thông qua việc đánh giá các chỉ tiêu sau: (1) Đánh giá giới hạn

phát hiện và giới hạn định lượng (2) Đánh giá độ lập lại trong phản ứng (3) Đánh giá độ lập lại liên phản ứng (4) Đánh giá độ đặc hiệu (5) Đánh giá khả năng chống ức chế (6) Đánh giá độ bền vững trong bảo quản

1.7 Thử nghiệm so sánh qui trình nghiên cứu với bộ Amplicor HIV-1 Monitor của

Roche trên các mẫu huyết tương dương tính HIV1 để so sánh về hàm lượng virus mà hai hệ thống phát hiện được Từ đó, đánh giá thông số về độ nhạy,

độ đặc hiệu, ngưỡng hàm lượng phát hiện của qui trình nghiên cứu so với Amplicor HIV-1 Monitor

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ĐƯỢC SỬ DỤNG

2.1 Tách chiết RNA với bộ thuốc thử “ NK RNAPREP” của Nam Khoa

2.1.2 Phương pháp

Thêm vào tube chứa 150l mẫu thử là huyết tương một thể tích 450l dung dịch R1 là Trizol (invitrogen) rồi làm thuần nhất mẫu dịch trong này bằng cách dùng pipette hút lên xuống nhiều lần Ủ dịch thuần nhất ở 30oC trong 10 phút Thêm 120l R2 là chloroform, lắc nhanh và cẩn thận dung dịch bằng cách úp ngữa trong 15 giây Giữ 30oC trong 10 phút Ly tâm 13,000RPM trong 15 phút ở máy ly tâm (có thể dùng ly tâm thường hay ly tâm lạnh 2-

8oC) Hút cẩn thận 300l dịch nổi vào một tube tinh sạch khác tránh không hút phase giữa Thêm 300l R3 là iso-propanol, úp ngữa tube 15 giây rồi tiếp tục giữ 30oC trong 10 phút Ly tâm 13,000RPM trong 10 phút ở máy ly tâm lạnh Hút bỏ phần nước nổi, tránh không làm mất cắn RNA (nhiều khi không thấy) đóng trên một bên đáy tube Rửa cắn với 700µl R4 là ethanol 80% dùng

ly tâm 8,000RPM trong 5 phút Dùng micropipette hay hút chân không hút bỏ tất cả phần nước nổi Làm khô cắn ở 55oC trong 10-15 phút Bước làm khô nầy nên thực hiện trong ổ nhiệt khô hay trong máy cách thủy Cho vào cắn khô 15l R5 là nước tinh sạch đã qua xử lý DEPC Giữ ở 55-60oC trong 10 phút Nếu chưa sử dụng ngay thì giữ dung dịch RNA đã tách chiết nầy ở –20oC

2.2 Tổng hợp cDNA từ tách chiết RNA với bộ thuốc thử “ NK cDNA synthesis” của Nam Khoa

synthesis của công ty

Nam Khoa sản xuất dựa

trên bộ hóa chất iScript

cDNA synthesis của

Biorad

Nguyên tắc hoạt động

của thuốc thử này là

enzyme RT (reverse

Hình 12: Nguyên tắc tổng hợp cDNA từ RNA

(P.H Vân vẽ minh họa)

transcriptase) phiên mã ngược mạch khuôn RNA sang cDNA nhờ mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexaner primers)

2.2.2 Phương pháp

Phương pháp thực hiện như sau: (1) Trước hết cho 15l dung dịch tách chiết vào tube PCR 0.2 có chứa sẵn 5l enzyme RT và Reaction mix 5X đang được ngâm trong đá (2) Sau đó thực hiện tổng hợp cDNA bằng cách ủ tube phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình luân nhiệt chỉ 1 chu kỳ với 3 bước nhiệt độ: 25oC trong 5 phút để mồi ngẫu nhiên 6 nucleotide bắt cặp vào RNA sợi khuôn, sau đó 42oC trong 30 phút để enzyme Reverse transcriptase gắn vào mạch RNA và tổng hợp cDNA từ mồi đồng thời enzyme RNAseH cắt bỏ RNA khỏi mạch cDNA, sau cùng nhiệt độ được nâng lên 85oC để chấm dứt hoạt động của enzyme Reverse transcriptase (3) Cuối cùng sản phẩm cDNA được giữ ở 4oC để chuẩn bị được cho vào real-time PCR mix đặc hiệu cho HIV1

2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR với bộ thuốc thử “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” của Promega

2.3.1 Nguyên tắc

Nguyên tắc của bộ thuốc thử là sử dụng cột lọc là silica để tóm bắt các sản phẩm PCR có kích thước từ 100bp trở lên và rửa trôi tất cả các thành phần khác kể cả các primer thừa qua cột lọc bằng ly tâm hay bằng hút chân không, sau đó thôi sản phẩm PCR từ cột lọc vào dung dịch TE 1X Khả năng tóm bắt của cột lọc là đến 40µg DNA và tỷ lệ thu hồi được sản phẩm PCR là từ 84% đến 95% tùy thuộc chiều dài của sản phẩm PCR

2.3.2 Phương pháp

Chuẩn bị dung dịch rửa màng (membrane wash solution): thêm 15ml ethanol 95% vào chai chứa 15ml dung dịch rửa màng, đậy chặt nắp để tránh dung dịch

bị bay hơi sau này

Chuẩn bị sản phẩm PCR: Nếu là sản phẩm khuếch đại sau PCR, thêm vào ống PCR một thể tích dung dịch gắn màng (membrane binding solution) bằng với thể tích sản phẩm khuếch đại, dùng đầu micropipette hút trộn lên xuống nhiều lần cho đều Nếu là vạch điện di được cắt từ thạch thì cứ mỗi 20mg lát cắt cho 20µl dung dịch gắn màng, vortex để trộn đều, sau đó ủ lát cắt thạch trong dung dịch gắn màng ở nhiệt độ 50 – 65oC cho đến khi thạch tan hoàn toàn

Thực hiện tinh sạch sản phẩm PCR: (1) Trước hết gắn DNA vào cột bằng cách cho cột vào tube thu nhận rồi cho toàn bộ sản phẩm PCR đã chuẩn bị trên vào trong cột, chú ý cho lên đúng trên màng silica, ủ cột trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm cột ở 13,000 – 16,000 rpm trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch trong tube thu nhận rồi cho cột vào lại tube thu nhận (2) Sau đó rửa cột bằng cách cho vào cột 700µl dung dịch rửa màng, ly tâm cột ở 13,000 – 16,000 rpm trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch trong tube thu nhận rồi cho cột vào lại tube thu nhận Rửa lần 2 bằng cách cho vào cột 500µl dung dịch rửa màng, ly tâm cột ở 13,000 – 16,000 rpm trong 5 phút, đổ bỏ dung dịch trong tube thu nhận rồi cho cột vào lại tube thu nhận (3) Làm khô cột bằng cách ly tâm cột ở 13,000 – 16,000 rpm trong 1 phút với nắp máy ly tâm mở để cột khô sạch ethanol còn

sót lại (4) Thôi sản phẩm PCR ra khỏi cột bằng cách cho cột vào một tube Eppendorf tinh sạch, cho vào cột 50µl nước tinh sạch (được cung cấp trong bộ thuốc thử), lưu ý cho đúng trên màng silica, ủ trong 1 phút ở phòng thí nghiệm, sau đó ly tâm 13,000 – 16,000 rpm trong 1 phút, bỏ cột và thu dung dịch trong tube, giữ ở 4oC hay -20oC cho đến khi sử dụng

2.4 Tạo vi khuẩn E coli khả biến

2.4.1 Nguyên tắc

Chuẩn bị vi khuẩn E coli khả biến là xử lý các tế bào vi khuẩn bằng ion Ca++

để tạo ra trên bề mặt của chúng các yếu tố thẩm quyền (competent factor) có khả năng giúp các DNA tự do có mặt trong môi trường bám lên bề mặt tế bào

vi khuẩn, nhờ vậy mà khi bị shock nhiệt các DNA này có thể xuyên qua bề mặt và chuyển vào bên trong tế bào vi khuẩn

2.4.2 Phương pháp

Chuẩn bị vi khuẩn E coli sẽ được làm khả biến: Trước hết cấy 3 chiều vi

khuẩn lên mặt thạch LB không có ampicillin, ủ 37oC qua đêm Chọn một khuẩn lạc tiêu biểu và tách rời để cấy vào một tube Falcon chứa 5ml LB, ủ

37oC qua đêm Lấy 2 chai Duran có chứa sẵn mỗi chai 40ml LB, cấy vào mỗi chai 400l canh cấy vi khuẩn đã chuẩn bị ở trên, vặn chặt nắp chai rồi cho vào

tủ ủ 37oC có lắc để trộn Sau 1 giờ ủ, kiểm tra độ đục của vi khuẩn trong chai bằng đo độ đục trên máy quang phổ Canh cấy đạt độ đục khi đọc ở OD600 = 0.4 (chứng trắng là môi trường LB không cấy vi khuẩn) Nếu chưa đạt độ đục thì tiếp tục ủ và cứ 15 phút lại kiểm tra độ đục một lần cho đến khi canh cấy đạt độ đục

Xử lý vi khuẩn E coli để làm khả biến: Trước hết chuẩn bị một hộp đựng

nhiều đá bào vì tất cả các bước tiếp theo đều phải làm trong đá bào; bật máy ly tâm lạnh và cho rotor máy ly tâm vào ngăn đông của tủ lạnh trước khi sử dụng

ít nhất 2 giờ để máy và rotor đạt nhiệt độ lạnh 4oC Cho tất cả canh cấy vi

khuẩn E coli đã đạt độ đục ở trên vào tube Falcon 50ml hay tube ly tâm vô

trùng phù hợp với rotor máy ly tâm lạnh Giữ các tube huyền dịch vi khuẩn này trong đá bào trong 10 phút Ly tâm lạnh ở 3000rpm trong 7 phút Đổ bỏ dịch nổi Cho vào các tube cặn tế bào vi khuẩn mỗi tube 10ml CaCl2 50mM đã

vô trùng bằng phương pháp lọc và đã được giữ lạnh sẵn trong đá bào Lắc nhẹ

để trộn hay dùng pipette Pasteur vô trùng hút nhẹ lên xuống nhiều lần để trộn

vi khuẩn vào CaCl2 Ly tâm lạnh 2500rpm trong thời gian 5 phút Đổ bỏ dịch nổi Thêm tiếp vào cặn tế bào 10ml CaCl2 50mM lạnh và trộn đều như trên Giữ trong đá bào trong 30 phút Ly tâm lạnh 2500rpm trong 5 phút Đổ bỏ dịch nổi Cho tiếp vào mỗi ống cặn tế bào vi khuẩn 3ml CaCl2 50mM lạnh và 750l glycerol, lắc trộn đều hay trộn đều bằng pipette Pasteur như trên Phân vào các tube giữ chủng (cryotube), mỗi tube 50l huyền dịch vi khuẩn Giữ ở

tủ đông -70oC để sử dụng dần

2.5 Tạo dòng với hệ thống “pGEM®-T Easy” của Promega

2.5.1 Nguyên tắc

Vector pGEM-T Easy là plasmid nhân tạo

được duỗi thẳng và được nối thêm

nucleotide T vào đầu 3’ để tránh plasmid tự

tạo vòng trở lại Cũng nhờ có T ở đầu 3’

mà sản phẩm PCR, luôn có đầu 3’ thêm

nucleotide A, dễ dàng được enzyme T4

DNA ligase nối vào hai đầu của vector và

tạo lại plasmid dạng vòng, kết quả là sản

phẩm PCR chèn được vào pGEM-T Easy

Sau khi được chèn sản phẩm PCR thì gene

lacZ trên plasmid pGEM-T Easy sẽ không

thể hoạt động vì sản phẩm PCR đã chèn

vào giữa gene lacZ Chính nhờ vậy mà sau

khi biến nạp vào E coli, vi khuẩn tái tổ hợp

với pGEM-T Easy có mang đoạn chèn giữa gene lacZ sẽ không có khả năng phân hủy IPTG để tạo thành khúm có màu xanh trong khi đó thì E coli tái tổ

hợp chỉ mang pGEM-T Easy không có đoạn chèn sẽ có khả năng phân hủy IPTG tạo nên khúm màu xanh nhờ sản phẩm biến dưỡng từ IPTG kết hợp được với X-gal, và đây chính là nguyên tắc xanh/trắng để chọn clone mang plasmid có đoạn chèn

2.5.2 Phương pháp

Thực hiện phản ứng nối sản phẩm PCR vào plasmid pGEM-T Easy: (1) Vì dung dịch đệm cho T4 DNA ligase (2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase) rất dễ hỏng nếu bị làm rã đông nhiều lần, do vậy ngay lần đầu tiên sau khi rã đông và vortex mạnh để trộn đều, phân dung dịch đệm thành từng thể tích nhỏ 5µl vào các tube Eppendorf tinh sạch và giữ đông lạnh để sử dụng dần (2) Tube đựng vector pGEM-T Easy sau khi rã đông phải được ly tâm 13,000 rpm trong thời gian ngắn để lắng toàn bộ xuống đáy tube (3) Sản phẩm PCR phải được tinh sạch và định lượng nồng độ DNA trước khi thực hiện thí nghiệm (4) Trong tube Eppendorf đã chứa sẵn 5µl dung dịch đệm cho T4 DNA ligase đã rã đông và vortex mạnh để trộn, thực hiện phản ứng nối bằng cách cho vào tube 1µl vector pGEM-T Easy, 2µl sản phẩm PCR, 1µl enzyme T4 DNA ligase, 1µl nước khử ion để có thể tích cuối cùng là 10µl, trộn đều bằng micropipette lên xuống nhiều lần rôi ly tâm 13,000 rpm trong thời gian ngắn để lắng tất cả xuống đáy tube (5) Ủ tube trong ngăn mát tủ lạnh ở 4oC qua đêm, như vậy là hoàn tất phản ứng nối Lưu ý là phải sử dụng enzyme T4 DNA ligase của bộ thuốc thử chứ không nên sử dụng từ các nguồn khác vì có thể còn các exonuclease sẽ cắt bỏ nucleotide T ở đầu 3’ của vector

Chuẩn bị các vật liệu để biến nạp sản phẩm nối vào vi khuẩn E coli: (1) Vi khuẩn E coli được sử dụng là dòng JM109 của Promega đã được làm thành vi khuẩn khả biến (competent cell), cũng có thể sử dụng các dòng E coli khác như E coli DH5alpha; các vi khuẩn khả biến này được giữ thành từng thể tích

100l và giữ ở -70oC, ống vi khuẩn chỉ được lấy ra và giữ trong đá bào để rã

Hình 13: Bản đồ gene của plasmid pGEM-T

Easy với vị trí chèn DNA ngay bên

trong gene lacZ

(Trích từ nguồn Promega)