V phải lấy để pha masterm
4 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1RNA RT-TQPCR TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
RT-TQPCR TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
4.1 Các chỉ tiêu phải đánh giá
Qui trình thử nghiệm phải được đánh giá trong phòng thắ nghiệm các chỉ tiêu sau đây:
34 Độ lặp lại trong phản ứng Độ lặp lại trong phản ứng
Độ lặp lại liên phản ứng
Độ đặc hiệu của bộ thử nghiệm Khả năng chống ức chế
Độ bền vững trong bảo quản
4.2 Phương pháp đánh giá
4.2.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Đối tượng được sử dụng để đánh giá là HIV1RNA-C[+] chưa pha loãng. Phương pháp thực hiện đánh giá là: (1) Pha loãng HIV1RNA-C[+] trong huyết tương chứng [-] thành các độ pha loãng chứa 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 10 và 1 copy trong 150ộl; (2) Tiến hành tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử
NK
RNAPREP theo phương pháp đã trình bày với thể tắch mỗi độ pha loãng được tách chiết RNA là 150ộl và ngay trước khi tách chiết RNA, thêm 10ộl HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch mẫu được tách chiết; (3) Đồng thời với tách chiết RNA các độ pha loãng HIV1RNA-C[+], thực hiện tách chiết RNA của 150ộl huyết thanh chứng [-], cũng thêm 10ộl chứng nội HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch huyết thanh chứng [-] được tách chiết; (4) Thực hiện tổng hợp cDNA toàn bộ 15ộl RNA tách chiết được, phương pháp như đã trình bày; (5) Cho toàn bộ 20ộl cDNA thu được vào HIV1-TQPCR mix và cho vào máy real-time PCR; (6) Chạy chương trình real-time PCR, ở đây sử dụng real-time PCR của Biorad model CFX96, chọn FAM và HEX cho các giếng, chương trình luân nhiệt là 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút để kắch hoạt hot-start taq polymerase, 40 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này; (7) Đọc giới hạn phát hiện là nồng độ copy HIV1RNA-C[+] thấp nhất mà bộ thử nghiệm có thể phát hiện được tức là vẫn còn cho tắn hiệu khuếch đại dương tắnh; (8) Trước khi đọc giới hạn định lượng, cho số copy HIVRNA-C[+] vào các giếng tương ứng, giới hạn định lượng là nồng độ copy HIV1RNA-C[+] cao nhất và thấp nhất cho được kết quả định lượng tuyến tắnh.
4.2.2 Độ lặp lại trong phản ứng
Do mẫu huyết tương thật sự nhiễm HIV là các mẫu thử rất cần phải thận trọng trong thao tác, do vậy để an toàn vẫn sử dụng đối tượng để đánh giá là HIV1RNA-C[+] chưa pha loãng. Phương pháp thực hiện đánh giá là: (1) Pha loãng HIV1RNA-C[+] trong huyết tương chứng [-] thành 3 dãy pha loãng với mỗi dãy là các độ pha loãng chứa 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 10 và 1 copy trong 150ộl; (2) Tiến hành tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo phương pháp đã trình bày với thể tắch mỗi độ pha loãng được tách chiết RNA là 150ộl và ngay trước khi tách chiết RNA, thêm 10ộl HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch mẫu được tách chiết; (3) Đồng thời với tách chiết RNA các độ pha loãng HIV1RNA-C[+], tách chiết RNA của 150ộl các chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-], cũng thêm 10ộl HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-] được tách chiết; (4) Thực hiện tổng hợp cDNA toàn bộ 15ộl RNA tách chiết được, phương pháp như đã trình bày; (5) Cho toàn bộ 20ộl cDNA thu được vào HIV1-TQPCR mix và cho vào máy real-time PCR; (6) Chạy chương trình real-time PCR, ở đây sử dụng real-time
35
PCR của Biorad model CFX96, chọn FAM và HEX cho các giếng, chương trình luân nhiệt là 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút để kắch hoạt hot-start taq polymerase, 40 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này; (7) Trước khi đọc kết quả, cho số copy HIV1RNA vào các giếng chuẩn định lượng để có đường biểu diễn chuẩn, đọc kết quả định lượng số copy HIV1RNA trong các giếng thử, tắnh CV của các kết quả định lượng đối với từng độ pha loãng HIV1RNA-C[+]; nếu CV≤10% thì độ lặp lại trong phản ứng là tốt.
4.2.3 Độ lặp lại liên phản ứng
Do mẫu huyết tương thật sự nhiễm HIV là các mẫu thử rất cần phải thận trọng trong thao tác, do vậy để an toàn vẫn sử dụng đối tượng để đánh giá là HIV1RNA-C[+] chưa pha loãng. Phương pháp thực hiện đánh giá là: (1) Pha loãng HIV1RNA-C[+] trong huyết tương chứng [-] thành 3 dãy pha loãng với mỗi dãy là các độ pha loãng chứa 1010, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 10 và 1 copy trong 150ộl; 3 dãy pha loãng này được làm thử nghiệm trong 3 ngày liên tiếp với lưu dãy pha loãng chưa thử nghiệm ở -80oC; (2) Tiến hành tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo phương pháp đã trình bày với thể tắch mỗi độ pha loãng được tách chiết RNA là 150ộl và ngay trước khi tách chiết RNA, thêm 10ộl HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch mẫu được tách chiết; (3) Đồng thời với tách chiết RNA các độ pha loãng HIV1RNA-C[+], thực hiện tách chiết RNA của 150ộl các chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-], cũng thêm 10ộl HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-] được tách chiết; (4) Thực hiện tổng hợp cDNA toàn bộ 15ộl RNA tách chiết được, phương pháp như đã trình bày; (5) Cho toàn bộ 20ộl cDNA thu được vào HIV1-TQPCR mix và cho vào máy real-time PCR; (6) Chạy chương trình real-time PCR, ở đây sử dụng real-time PCR của Biorad model CFX96, chọn FAM và HEX cho các giếng, chương trình luân nhiệt là 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút để kắch hoạt hot-start taq polymerase, 40 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này; (7) Trước khi đọc kết quả, cho số copy HIV1RNA vào các giếng chuẩn định lượng để có đường biểu diễn chuẩn, đọc kết quả định lượng số copy HIV1RNA trong các giếng thử; (8) tổng hợp kết qủa định lượng trong 3 ngày rồi tắnh CV của các kết quả định lượng đối với từng độ pha loãng HIV1RNA-C[+]; nếu CV≤10% thì độ lặp lại liên phản ứng là tốt.
4.2.4 Độ đặc hiệu
Thử độ đặc hiệu bằng cách thực hiện xét nghiệm với qui trình thử nghiệm trên các mẫu huyết tương không nhiễm HIV1 nhưng đã cho kết quả dương tắnh với HCV, HBV, CMV xác định bằng kỹ thuật real-time PCR. Các mẫu này được cung cấp từ phòng thắ nghiệm NK-BIOTEK của công ty Nam Khoa. Cũng phải thử nghiệm cùng với mẫu huyết thanh chứng [-] và mẫu chứng dương HIV1RNA-C[+]. Phương pháp như sau: (1) Tiến hành tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo phương pháp đã trình bày với thể tắch mỗi mẫu được tách chiết RNA là 150ộl và ngay trước khi tách chiết RNA, thêm 10ộl HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch mẫu được tách chiết; (2) Thực hiện tổng hợp cDNA toàn bộ 15ộl RNA tách chiết được, phương pháp như đã trình
36
bày; (3) Cho toàn bộ 20ộl cDNA thu được vào HIV1-TQPCR mix và cho vào máy real-time PCR; (4) Chạy chương trình real-time PCR, ở đây sử dụng real- time PCR của Biorad model CFX96, chọn FAM và HEX cho các giếng, chương trình luân nhiệt là 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút để kắch hoạt hot-start taq polymerase, 40 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này; (5) Đánh giá độ đặc hiệu 100% khi chỉ có mẫu chứng dương HIV1RNA-C[+] là cho kết quả tắn hiệu khuếch đại dương tắnh còn các mẫu khác là cho kết quả âm tắnh.
4.2.5 Khả năng chống ức chế
Thử khả năng chống ức chế bằng cách thử nghiệm trên 4 mẫu chứng dương HIV1RNA-C[+] pha loãng trong huyết thanh chứng [-] ở các độ pha loãng bất kỳ. Các mẫu này được tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo phương pháp đã trình bày, thực hiện 2 tách chiết RNA cho mỗi mẫu với một cho thêm 10ộl một chất ức chế PCR vào thể tắch mẫu tách chiết trước khi tách chiết và một không cho thêmchất ức chế PCR. Các chất ức chế được sử dụng là: DNA bạch cầu người nồng độ là 10ng/ộl, Hemoglobin trắch từ máu người với nồng độ là 15ng/ộl, albumin sử dụng BSA với nồng độ là 10ng/ộl, Lamivudine với nồng độ là 100ng/ộl. Đồng thời với tách chiết RNA các HIV1RNA-C[+], tách chiết RNA của 150ộl các chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-] với thêm 10ộl HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-] được tách chiết. Tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo qui trình đã trình bày. Sau đó thực hiện tổng hợp cDNA toàn bộ 15ộl RNA tách chiết được, phương pháp như đã trình bày. Cho toàn bộ 20ộl cDNA thu được vào HIV1-TQPCR mix và cho vào máy real- time PCR. Chạy chương trình real-time PCR, ở đây sử dụng real-time PCR của Biorad, model CFX96, chọn FAM và HEX cho các giếng, chương trình luân nhiệt: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút để kắch hoạt hot-start taq polymerase, 40 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này. Trước khi đọc kết quả, cho số copy HIV1RNA vào các giếng chuẩn định lượng để có đường biểu diễn chuẩn, đọc kết quả định lượng số copy HIV1RNA trong các giếng thử. Kết quả xác định khả năng chống ức chế nếu kết quả định lượng HIV1RNA trong mẫu có cho chất ức chế và trong mẫu không có cho chất ức chế không lệch quá 1 Log (tức là 10 lần).
4.2.6 Độ ổn định trong điều kiện bảo quản
Độ ổn định của qui trình thử nghiệm trong bảo quản được thực hiện bằng cách bảo quản các thành phần của qui trình thử nghiệm đúng theo điều kiện bảo quản của các thành phần đó, sau đó cứ mỗi 4 tháng thử nghiệm trên các mẫu chứng dương HIV1RNA-C[+] đã được pha loãng thành hai nồng độ 103 và 107 copies trong 150ộl huyết tương chứng [-]. Các mẫu HIV1RNA-C[+] đã pha loãng này được phân thành các thể tắch 150ộl cho mỗi lần thử và giữ ở -80oC. Trước khi tách chiết RNA, cho 10ộl chứng nội HIV1RNA-IC vào thể tắch mẫu được tách chiết. Đồng thời với tách chiết RNA các HIV1RNA-C[+], tách chiết RNA của 150ộl các chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-] với thêm 10ộl HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-] được tách chiết. Tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo qui trình đã trình bày. Sau đó thực hiện tổng hợp cDNA toàn bộ 15ộl
37
RNA tách chiết được, phương pháp như đã trình bày. Cho toàn bộ 20ộl cDNA thu được vào HIV1-TQPCR mix và cho vào máy real-time PCR. Chạy chương trình real-time PCR, ở đây sử dụng real-time PCR của Biorad, model CFX96, chọn FAM và HEX cho các giếng, chương trình luân nhiệt: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút để kắch hoạt hot-start taq polymerase, 40 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này. Trước khi đọc kết quả, cho số copy HIV1RNA vào các giếng chuẩn định lượng để có đường biểu diễn chuẩn, đọc kết quả định lượng số copy HIV1RNA trong các giếng thử. Kết quả xác định độ ổn định khi kết quả của mỗi nồng độ sau 3 lần thử (1 năm) cho CV không quá 10%.