V phải lấy để pha masterm
5 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1RNA RT-TQPCR THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT
RT-TQPCR THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT
5.1 Đối tượng được sử dụng để đánh giá
Mẫu được cung cấp từ Trung tâm y khoa Medic với 50 mẫu huyết tương dương tắnh HIV và 20 mẫu huyết tương âm tắnh HIV đã qua thử nghiệm ELISA được thực hiện tại đây. Các mẫu này được Trung tâm Y Khoa Medic lưu giữ ở -700C. Mẫu được đưa về phòng thắ nghiệm của công ty Nam Khoa trong hộp chuyển mẫu có gel lạnh với thời gian chuyển mẫu không quá 1 giờ. Sau khi đến phòng thắ nghiệm, tiếp tục giữ mẫu ở -80oC cho đến khi đem ra làm thắ nghiệm hàng loạt.
5.2 Phương pháp đánh giá
Thực hiện xét nghiệm định lượng HIV1RNA trong 70 mẫu thử bằng qui trình thử nghiệm đã được chế tạo so sánh với bộ thử nghiệm AMPLICOR HIV1 MONITOR v1.5 của Roche.
Thực hiện xét nghiệm định lượng HIV1 bằng bộ AMPLICOR HIV1 MONITOR v1.5 theo đúng qui trình đã được hướng dẫn theo bộ thử nghiệm. Thực hiện xét nghiệm định lượng HIV1 bằng qui trình thử nghiệm real-time PCR đã được chế tạo theo các bước như sau: (1) Tách chiết RNA của 150ộl mẫu thử, chuẩn định lượng và huyết thanh chứng [-] bằng bộ thuốc thử
NKRNAPREP theo qui trình đã trình bày, trước khi tách chiết cho 10ộl chứng nội HIV1RNA-IC vào thể tắch mẫu tách chiết; (2) Thực hiện tổng hợp cDNA toàn bộ 15ộl RNA tách chiết được, phương pháp như đã trình bày; (3) Cho toàn bộ 20ộl cDNA thu được vào HIV1-TQPCR mix và cho vào máy real- time PCR; (4) Chạy chương trình real-time PCR, ở đây sử dụng real-time PCR của Biorad model CFX96, chọn FAM và HEX cho các giếng, chương trình luân nhiệt là 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút để kắch hoạt hot-start taq polymerase, 40 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này; (5) Trước khi đọc kết quả, cho số copy HIV1RNA vào các giếng chuẩn định lượng để có đường biểu diễn chuẩn, đọc kết quả định lượng số copy HIV1RNA trong các giếng thử.
Lập bảng so sánh các kết quả định lượng của từng mẫu được thực hiện theo hai phương pháp thử nghiệm: AMPLICOR HIV1 MONITOR v1.5 của Roche và qui trình thử nghiệm real-time được chế tạo. Tắnh CV của từng cặp hai kết
38
quả định lượng trên các mẫu [+]. Nếu CV của từng cặp không vượt quá 10% thì có thể cho kết luận là kết quả tương đồng giữa hai phương pháp.
39
PHẦN 5 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN