V phải lấy để pha masterm
3.4 Phương pháp pha chế các chứng và chuẩn
3.4.1 Chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+] và chuẩn định lượng HIV1-RNA
Chứng dương HIV1RNA-C[+] là gì?
Chứng dương HIV1RNA-C[+] là RNA có mang trình tự nucleotide giống hệt trình tự đắch của mồi SK462, SK431 và probe SK102. Chứng dương HIV1RNA-C[+] được sử dụng để kiểm soát độ nhạy của xét nghiệm RT- TQPCR phát hiện và định lượng HIV1-RNA khi được pha trong đệm TE1X thành các mẫu thử chứa nồng độ copy nhất định biết trước để được làm xét nghiệm cùng lúc với mẫu thử. Chứng dương HIV1RNA-C[+] cũng được dùng để pha các chuẩn định lượng bằng cách pha trong TE1X để đạt được các nồng độ 103, 104 và 105 bản sao cho mỗi 150ộl.
Phương pháp chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+]
Khuếch đạitrình tự đắch của PCR từ gene gag của bộ gene của HIV1
Phương pháp được tóm tắt như sau: (1) Trước hết chọn một mẫu huyết tương của bệnh nhân HIV/AIDS đã xác định là HIV1-RNA [+] bằng xét nghiệm trên bộ thuốc thử đã được chấp nhận và ở đây chúng tôi sử dụng kit của Qiagen. (2) Tách chiết RNA toàn phần của mẫu huyết tương bệnh nhân này bằng kit tách chiết NKRNAPREP của Nam Khoa theo qui trình đã trình bày ở trang 24. (3) Phiên mã ngược RNA tách chiết được thành cDNA bằng bộ thuốc thử
NKcDNA synthesis của Nam Khoa theo qui trình đã được trình bày. (4) Lấy toàn bộ 20l cDNA thu nhận được cho vào 30ộl HIV1-pPCR mix đã pha như đã trình bày để khuếch đại trình tự đắch dài khoảng 140bps nằm trên gene ỘgagỢ của bộ gene HIV1 theo chương trình luân nhiệt như sau: 95oC/3 phút để kắch hoạt taq-polymerase, sau đó 40 chu kỳ bao gồm 94oC/15Ợ- 60oC/1Ỗ, và cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC/5Ỗ. (5) Kiểm tra sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên thạch và xác định kết quả khi có vạch khuếch đại kắch thước 140bps. (6) Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ thuốc thử ỘWizardệ SV Gel và PCR Clean- Up SystemỢ của Promega theo qui trình đã trình bày. (7) Pha sản phẩm PCR đã tinh sạch trong TE1X và giữ ở -20oC đến -30oC cho đến khi sử dụng cho thắ nghiệm tiếp theo.
31
Tạo dòng trình tự đắch để có ỘHIV1DNA đắchỢ
Sản phẩm PCR đã tinh sạch được chèn vào plasmid pGEM-T Easy rồi được tạo dòng vào vi khuẩn E. coli. Vi khuẩn E. coli mang plasmid có đoạn chèn là trình tự đắch này được cấy tăng sinh rồi được tách chiết để lấy được các plasmid có mang trình tự đắch. Sản phẩm thu được chắnh là plasmid pGEM-T Eseay đã chèn trình tự đắch cho PCR và sản phẩm này được gọi là ỘHIV1DNA đắchỢ. Các phương pháp thực hiện đã được trình bày.
Chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+]
Phiên mã sản phẩm ỘHIV1DNA đắchỢ thành RNA sử dụng kit ỘRiboMAXỎ Large Scale RNA Production Systems - SP6 and T7Ợ của Promega với phương pháp thực hiện như đã được trình bày. Toàn bộ sản phẩm đã phiên mã này là 100ộl được cho vào tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo qui trình như đã trình bày, chỉ khác là ở giai đoạn cuối cùng khi làm tan cắn RNA, làm tan trong 100ộl, thay vì chỉ 15ộl, dung dịch nước tinh sạch đã được loại bỏ RNAse bằng DEPC (dung dịch R5 trong bộ thuốc thử NKRNAPREP). Điện di để xác định có sản phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+] cho kắch thước khoảng 240bases. Định lượng sản phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+] bằng quang phổ kế nanodrop. Vì RNA là sợi đơn nên xác định số bản sao RNA bằng công thức N (copies/ml) = 2 x (6.022 x 1023) x C / (650 x 109 x L) copies/ml với C là nồng độ ng/ml và L là chiều dài base của sản phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+]. Chứng dương HIV1RNA-C[+] được pha trong đệm TE1X thành một nồng độ nhất định trong khoản 103 đến 105 copy trong 150ộl. Phân chứng dương HIV1RNA-C[+] này thành các thể tắch 1ml và cho vào các tube 1.5ml nắp vặn. HIV1RNA-C[+] chưa pha cũng như HIV1RNA-C[+] đã pha được giữ ở 4oC.
Pha các chuẩn định lượng cho HIV1-TQPCR
Pha loãng chứng dương HIV1RNA-C[+] trong đệm TE1X để đạt các nồng độ chuẩn 103, 104, và 105 trong mỗi 150l. Các nồng độ HIV1-RNA chuẩn này được phân thành các thể tắch 1ml và cho vào các tube 1.5ml nắp vặn, dán nhãn HIV1RNA-S1, HIV1RNA-S2, và HIV1RNA-S3 tương ứng cho các nồng độ 103, 104 và 105 rồi giữ ở -20oC.
3.4.2 Chế tạo chứng nội HIV1RNA-IC
Chứng nội HIV1RNA-IC là gì?
Chứng nội HIV1RNA-IC là RNA có mang trình tự nucleotide ở hai đầu giống hệt trình tự đắch của mồi SK462, SK431 nhưng bên trong lại là trình tự có chứa trình tự probe đặc hiệu cho chứng nội là HIV1-IC. Chứng nội HIV1RNA-IC được dùng để kiểm soát độ nhạy của toàn bộ qui trình và thuốc thử dùng trong xét nghiệm nhờ cho vào mẫu huyết thanh chứng [-] ở lượng phát hiện tối thiểu rồi được xét nghiệm cùng với mẫu thử. Chứng nội HIV1RNA-IC cũng được dùng để kiểm soát có ức chế hay không trong các mẫu thử mà kết quả xét nghiệm là âm nghiệm nhờ chứng nội HIV1RNA được cho vào mẫu thử ở lượng phát hiện tối thiểu trước khi mẫu thử được tách chiết RNA.
32
Tổng hợp chứng nội HIV1DNA-IC
Chứng nội HIV1DNA-IC được tổng hợp từ hai trình tự HIV1-ICfoligo và HIV1-ICroligo được đặt tổng hợp từ hãng Proligo của Sigma.
Trình tự HIV1-ICfoligo là: 5ỖAGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGACGACCTCTTCAA ATCTAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAG CGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGA. Trình tự HIV1-ICroligo là: 5ỖTGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCTGCTGCCTTGCCGGAAATTA GTGTGTGATAGACGGCATTCTTCATGGCTTCTGAGATGAGGACGGG ACCATTGTTGGATGTTGTTTCGCTATCTTCATAATC.
Trong đó trình tự tô màu vàng là trình tự của mồi SK462 và SK431 đặc hiệu cho HIV1, trình tự tô màu đỏ cánh sen là trình tự của probe đặc hiệu chứng nội tại, còn trình tự gạch dưới là trình tự bô sung nhau của hai mạch. HIV1DNA- IC được tổng hợp bằng phương pháp PCR với PCR mix có các thành phầm là platinium taq (Invitrogen) 1U cho một PCR mix, dNTP 200ộM cho mỗi loại, PCR buffer 1X, MgCl 1.5mM; thêm vào hai tŕnh tự HIV1-ICfolio và HIV1- ICroligo với hàm lượng 5pm cho mỗi loại, và hai mồi SK462 và SK431 được cho vào PCR mix với hàm lượng 25pm, thể tắch của phản ứng là 50ộl. Sau đó chạy chương trình luân nhiệt như sau: 95oC/3 phút để kắch hoạt taq- polymerase, sau đó 40 chu kỳ bao gồm 94oC/15Ợ- 55oC/30Ợ- 72oC/1Ỗ, và cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC/5Ỗ. Kiểm tra sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên thạch và xác định kết quả khi có vạch khuếch đại kắch thước 200bps. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ thuốc thử ỘWizardệ SV Gel và PCR Clean-Up SystemỢ của Promega theo qui trình đã trình bày. Pha sản phẩm PCR đã tinh sạch trong TE1X và giữ ở -20oC đến -30oC cho đến khi sử dụng cho thắ nghiệm tiếp theo
Tạo dòng trình tự HIV1DNA-IC
Sản phẩm PCR đã tinh sạch được chèn vào plasmid pGEM-T Easy rồi được tạo dòng vào vi khuẩn E. coli. Vi khuẩn E. coli mang plasmid có đoạn chèn là trình tự đắch này được cấy tăng sinh rồi được tách chiết để lấy được các plasmid có mang HIV1DNA-IC. Các phương pháp thực hiện đã được trình bày.
Chế tạo chứng nội HIV1RNA-IC
Phiên mã sản phẩm PCR đã tinh sạch được chèn vào plasmid pGEM-T Easy thành RNA sử dụng kit ỘRiboMAXỎ Large Scale RNA Production Systems - SP6 and T7Ợ của Promega với phương pháp thực hiện như đã được trình bày. Toàn bộ sản phẩm đã phiên mã này là 100ộl được cho vào tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo qui trình như đã trình bày, Chỉ khác là ở giai đoạn cuối cùng khi làm tan cắn RNA, làm tan trong 100ộl, thay vì chỉ 15ộl, dung dịch nước tinh sạch đã được loại bỏ RNAse bằng DEPC (dung dịch R5 trong bộ thuốc thử NKRNAPREP). Điện di để xác định có sản phẩm chứng nội HIV1RNA-IC cho kắch thước khoảng 300 bases. Định lượng sản phẩm chứng nội HIV1RNA-IC bằng quang phổ kế nanodrop. Vì RNA là sợi
33
đơn nên xác định số bản sao bằng công thức N (copies/ml) = 2 x (6.022 x 1023) x C / (650 x 109 x L) copies/ml với C là nồng độ ng/ml và L là chiều dài base của sản phẩm chứng nội HIV1RNA-IC. Chứng nội HIV1RNA-IC được pha trong đệm TE1X thành một nồng độ nhất định 100 copy trong 10ộl. Phân chứng nội HIV1RNA-IC này thành các thể tắch 1ml và cho vào các tube 1.5ml nắp vặn. Chứng nội HIV1RNA-IC chưa pha và chứng nội HIV1RNA-IC đã pha được giữ ở -20oC.
Đánh giá nguy cơ cạnh tranh với đắch HIV1RNA bằng cách thử trên dãy pha loãng HIVRNA-C[+] trong huyết tương chứng [-] có thêm và không thêm 10 ộl HIV1RNA-IC đã pha. Thực hiện như sau: (1) Trước hết chuẩn bị dãy pha loãng HIV1RNA-C[+] trong huyết tương chứng [-]; (2) Các độ pha loãng được tách chiết RNA bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP theo phương pháp đã trình bày, thực hiện 2 tách chiết RNA cho mỗi độ pha loãng, một cho thêm 10ộl chứng nội HIV1RNA-IC đã pha vào thể tắch mẫu được tách chiết (150ộl), và một không cho thêm chứng nội HIV1RNA-IC; (3) Thực hiện tổng hợp cDNA toàn bộ 15ộl RNA tách chiết được, phương pháp như đã trình bày; (4) Cho toàn bộ 20ộl cDNA thu được vào HIV1-TQPCR mix và cho vào máy real-time PCR; (5) Chạy chương trình real-time PCR, ở đây sử dụng real-time PCR của Biorad, model CFX96, chọn FAM và HEX cho các giếng, chương trình luân nhiệt: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút để kắch hoạt hot-start taq polymerase, 40 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này; (6) Đọc kết quả xác định pha loãng cao nhất của HIV1RNA-C[+] có và không có HIV1RNA-IC vẫn còn cho tắn hiệu khuếch đại, gọi là Ộđộ pha loãng cuốiỢ; (7) Nếu cả hai dãy pha loãng đều cho kết quả giống nhau thì kết luận được nồng độ chứng nội HIVRNA-IC đã pha là không cạnh tranh với đắch; còn nếu dãy pha loãng không cho chứng nội HIV1RNA-IC cho kết quả Ộđộ pha loãng cuốiỢ là thấp hơn dãy pha loãng HIV1RNA-IC thì kết luận là nồng độ chứng nội HIV1RNA-IC đã pha là có cạnh tranh với đắch, sẽ thử tiếp tục với nồng độ chứng nội pha loãng 1/2, 1/5, hay 1/10 của nồng độ đã pha.
2.4.3 Mẫu huyết tương người bình thường
Mẫu huyết tương người bình thường không nhiễm HBV, HCV, HIV được mua từ Trung Tâm Huyết Học và Truyền Máu TP. HCM. Mẫu trước khi sử dụng được thử lại các chỉ tiêu HBsAg, anti-HCV và anti-HIV bằng thuốc thử nhanh mua từ hãng Bioland. Mẫu sẽ được dùng làm mẫu chứng [-] nếu 3 chỉ tiêu trên đều cho kết quả âm tắnh. Mẫu chứng [-] được phân thành các thể tắch 1ml cho vào các tube Eppendorf 1.5ml nắp vặn chặt và được dán nhãn là NHP (normal human plasma) để được dùng làm mẫu chứng âm. NHP được giữ ở -18oC hay thấp hơn.