V phải lấy để pha masterm
105 đến 107 copies/150ộl
4.4 Nguyên tắc hoạt động của qui trình thử nghiệm
Phương pháp dựa trên PCR khuếch đại một đoạn đặc hiệu dài khoảng 140bp được phiên mã ngược từ vùng bảo tồn của cDNA phiên mã ngược từ gene gag
49
của bộ gene HIV1. Trong khi chạy PCR, một khi có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc hiệu với trình tự đắch sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị thủy giải bởi men taq polymerase (nhờ hoạt tắnh 5Ỗ- 3Ỗ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đọan kéo dài. Sự thủy giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát hùynh quang (fluorophore) FAM ở đầu 5Ỗ khỏi chất hấp phụ hùynh quang (quencher) ở đầu 3Ỗ của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát hùynh quang khi bị chiếu tia cực tắm hay laser và sự phát hùynh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real- time của máy. Mẫu thử chứa nhiều bản đắch ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng (Ct = chu kỳ mà đầu đọc realtime của máy bắt đầu ghi nhận được có tắn hiệu hùynh quang trong ống phản ứng) phát hiện sớm hơn là mẫu thử có ắt bản đắch. Dựa vào các số lượng copies DNA của các NKHIV1RNA chuẩn và chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn, chúng ta sẽ biết được số lượng bản sao (copies) cDNA ban đầu của mẫu thử dựa vào chu kỳ ngưỡng của các mẫu thử.
RNA chứng nội tại sử dụng cùng mồi nhưng cho cDNA có trình tự khác biệt trình tự cDNA của HIV1 đắch được cung cấp kèm theo để người sử dụng có thể chứng minh thử nghiệm đạt độ nhạy đồng thời chứng minh mẫu không bị ức chế bằng cách cho vào mẫu thử để cùng được tách chiết RNA với mẫu thử. Nhờ trong real-time PCR mix có thêm dò taqman đặc hiệu với sản phẩm PCR khuếch đại từ cDNA phiên mã ngược từ RNA chứng nội tại và sử dụng chất phát hùynh quang HEX hay JOE hoàn toàn khác biệt kênh với dò taqman của sản phẩm PCR đắch nên người dùng hoàn toàn có thể phát hiện sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại của cDNA phiên mã ngược từ RNA chứng nội tại. Sáu ưu điểm của phương pháp này là: (1) Được cung cấp kèm với bộ tách chiết RNA và bộ tổng hợp cDNA rất hiệu quả và dễ dàng sử dụng. (2) Được cung cấp kèm với các TQPCR mix được chế tạo từ các hóa chất có chất lượng nhất,
các primers và probes được thiết kế xuất sắc nhất cho độ nhạy và độ đặc hiệu
cao nhất; (3) Được cung cấp kèm với chứng nội tại (IC) là RNA khi được phiên mã ngược thành cDNA thì sử dụng được chung mồi nhưng khác probe đặc hiệu đối với cDNA đắch giúp người sử dụng kiểm soát độ nhạy trong quá trình xét nghiệm PCR cũng như kiểm soát ức chế bằng cách cho IC vào bệnh phẩm; (4) Được cung cấp kèm với các nồng độ chuẩn RNA đắch (3 độ pha loãng) đã pha sẵn ở dạng bền vững nhờ vậy mà người sử dụng có thể kiểm
soát được độ chắnh xác khi pipetting, độ tuyến tắnh của PCR định lượng, độ
nhạy của phương pháp và tắnh tóan được một cách chắnh xác số lượng bản
copies ban đầu của HIV1RNA đắch có trong mẫu thử; (5) Được cung cấp kèm
với mẫu chứng âm là huyết tương người bình thường để giúp người sử dụng
kiểm soát được độ nhạy của kit và kiểm soát được ngọai nhiễm trong quá trình
xét nghiệm bằng cách cho IC vào chứng âm và xét nghiệm chứng âm như mẫu
thật. (6) Được cung cấp kèm với mẫu chứng [+] HIV1RNA vừa để giúp người sử dụng kiểm soát được độ ổn định của thử nghiệm vì các mẫu chứng [+] này sẽ được làm xét nghiệm song song với mẫu và phải cho kết quả định lượng trong trị số giới hạn cho phép của chúng.
