Tạo vi khuẩn E coli khả biến

2.4.1 Nguyên tắc

Chuẩn bị vi khuẩn E. coli khả biến là xử lý các tế bào vi khuẩn bằng ion Ca++ để tạo ra trên bề mặt của chúng các yếu tố thẩm quyền (competent factor) có khả năng giúp các DNA tự do có mặt trong môi trường bám lên bề mặt tế bào vi khuẩn, nhờ vậy mà khi bị shock nhiệt các DNA này có thể xuyên qua bề mặt và chuyển vào bên trong tế bào vi khuẩn.

2.4.2 Phương pháp

Chuẩn bị vi khuẩn E. coli sẽ được làm khả biến: Trước hết cấy 3 chiều vi khuẩn lên mặt thạch LB không có ampicillin, ủ 37oC qua đêm. Chọn một khuẩn lạc tiêu biểu và tách rời để cấy vào một tube Falcon chứa 5ml LB, ủ 37oC qua đêm. Lấy 2 chai Duran có chứa sẵn mỗi chai 40ml LB, cấy vào mỗi chai 400l canh cấy vi khuẩn đã chuẩn bị ở trên, vặn chặt nắp chai rồi cho vào tủ ủ 37oC có lắc để trộn. Sau 1 giờ ủ, kiểm tra độ đục của vi khuẩn trong chai bằng đo độ đục trên máy quang phổ. Canh cấy đạt độ đục khi đọc ở OD600 = 0.4 (chứng trắng là môi trường LB không cấy vi khuẩn). Nếu chưa đạt độ đục thì tiếp tục ủ và cứ 15 phút lại kiểm tra độ đục một lần cho đến khi canh cấy đạt độ đục.

Xử lý vi khuẩn E. coli để làm khả biến: Trước hết chuẩn bị một hộp đựng nhiều đá bào vì tất cả các bước tiếp theo đều phải làm trong đá bào; bật máy ly tâm lạnh và cho rotor máy ly tâm vào ngăn đông của tủ lạnh trước khi sử dụng ắt nhất 2 giờ để máy và rotor đạt nhiệt độ lạnh 4oC. Cho tất cả canh cấy vi khuẩn E. coli đã đạt độ đục ở trên vào tube Falcon 50ml hay tube ly tâm vô trùng phù hợp với rotor máy ly tâm lạnh. Giữ các tube huyền dịch vi khuẩn này trong đá bào trong 10 phút. Ly tâm lạnh ở 3000rpm trong 7 phút. Đổ bỏ dịch nổi. Cho vào các tube cặn tế bào vi khuẩn mỗi tube 10ml CaCl2 50mM đã vô trùng bằng phương pháp lọc và đã được giữ lạnh sẵn trong đá bào. Lắc nhẹ để trộn hay dùng pipette Pasteur vô trùng hút nhẹ lên xuống nhiều lần để trộn vi khuẩn vào CaCl2. Ly tâm lạnh 2500rpm trong thời gian 5 phút. Đổ bỏ dịch nổi. Thêm tiếp vào cặn tế bào 10ml CaCl2 50mM lạnh và trộn đều như trên. Giữ trong đá bào trong 30 phút. Ly tâm lạnh 2500rpm trong 5 phút. Đổ bỏ dịch nổi. Cho tiếp vào mỗi ống cặn tế bào vi khuẩn 3ml CaCl2 50mM lạnh và 750l glycerol, lắc trộn đều hay trộn đều bằng pipette Pasteur như trên. Phân vào các tube giữ chủng (cryotube), mỗi tube 50l huyền dịch vi khuẩn. Giữ ở tủ đông -70oC để sử dụng dần.

23