28.http://www.cdc.gov/hiv/ 29.http://hivinsite.ucsf.edu/ 30.http://unaids.org/en/ 31.http://search.who.int 32.http://www.ykhoanet.com/AIDS/ 33.http://www.moh.gov.vn/ 34.http://72.14.235.104/ 35.http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/AIDS/ 36.http://en.wikipedia.org/wiki/HIV_structure_and_genome 37.http://72.14.235.104/search97/v2/d/ 38.http://vnexpress.net/Vietnam/suc%2Dkhoe/2002/05/3B9BC637/ 39.http://en.wikipedia.org/wiki/Internal_Control 40.http://www.occ.treas.gov/handbook/intcntrl2.pdf 41.http://www.google.com/search?sourceid=navclient&aq=t&ie=UTF- 8&rlz=1T4AMSA_en-VN215&q=internal+control 42.http://en.wikipedia.org/wiki/Positive_control 43.http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Positivecontrol& 44.http://images.google.com.vn/images?hl=vi&q=HIV 45.http://en.wikipedia.org/wiki/Aids 46.http://www.gene-quantification.info/ 47.http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/ 48.http://www.hivmedicine.com/textbookvt.htm 49.http://www.vaac.gov.vn/.../QD1921ngay0562013
57
PHỤ LỤC
1. TÁCH CHIẾT RNA TỪ HUYẾT TƯƠNG DÙNG BỘ KIT QIAMP VIRAL RNA MINIKIT CỦA HÃNG QIAGEN VIRAL RNA MINIKIT CỦA HÃNG QIAGEN
1.1 Nguyên tắc
RNA tổng số được tách chiết từ huyết tương bằng bộ kit Qiamp viral RNA minikit của hãng QIAgen theo nguyên tắc lọc qua cột có lớp màng silicagel. RNA virus được giải phóng bởi tác nhân phá màng tế bào và màng nhân được gắn với chất mang RNA (RNA carrier). Lớp màng silicagel cố định bên dưới cột của bộ kit chỉ bắt giữ phức hợp RNA - chất mang RNA. Các dung dịch rửa giúp loại bỏ những thành phần không mong muốn như protein và các ion. Thu nhận RNA bằng dung dịch pha loãng mẫu có chứa EDTA giúp ổn định vật liệu di truyền.
1.2 Phương pháp
(1) Thêm vào 140μl huyết tương 560μl AVL-carrier RNA vortex 15 giây ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và ly tâm ngắn (short spin). (2) Thêm vào 560μl ethanol tuyệt đối vortex 15 giây rồi ly tâm ngắn. (3) Sau đó tiếp tục thực hiện hai lần thêm 630μl dung dịch qua cột và ly tâm ở tốc độ 8000 rpm/phút sau đó chuyển cột sang ống thu mẩu mới. (4) Tiếp tục thêm 500μl dung dịch AW1 rồi ly tâm 8000 rpm/phút chuyển sang tube 1.5 ml mới. (5) Thêm 500 μl dung dịch AW2 rồi ly tâm 13000 rpm/phút trong 3 phút chuyển cột sang ống 1.5ml và ly tâm 13000 rpm/phút trong 1 phút và chuyển sang tiếp 1.5ml mới. (6) Thêm 60μl dung dịch pha loãng mẫu rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút và ly tâm 9000 rpm/phút trong 1 phút rồi bỏ cột. (7) Dịch RNA virus bảo quản 4oC nếu sử dụng ngay và nếu chưa dùng thì bảo quản ở - 70oC.
2 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG REAL-TIME PCR VỚI BỘ ARTUSệ HI
VIRUS-1 RG RT-PCR
2.1 Nguyên tắc
Phát hiện tác nhân gây bệnh bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dựa trên việc khuếch đại đoạn gen đặc hiệu. Trong real-time PCR sản phẩm khuếch đại được phát hiện thông qua thuốc nhuộm huỳnh quang. Ở đây sử dụng đầu dò đặc hiệu bắt cặp vào sản phảm khuếch đại. Giám sát cường độ huỳnh quang trong quá trình chạy PCR cho phép phát hiện và định lượng của sản phẩm tắch lũy mà không cần phải mở lại các ống phản ứng sau khi chạy PCR.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Pha chế master mix (chứng nội tại để kiểm tra sự ức chế của sản phẩmPCR)
Số lượng mẫu thử 1 mẫu 12 mẫu HI Virus-1 RG Master A 12μl 144μl HI Virus-1 RG Master B 18μl 216μl HI Virus-1 RG IC 2μl 24μl
58
2.2.2 Chuẩn bị phản ứng PCR
Số lượng mẫu thử 1 mẫu 12 mẫu
Master mix 30μl 30μl
Mẫu thử 20μl 20μl
Tổng thể tắch 50μl 50μl
2.2.3 Chạy realtime PCR phát hiện và định lượng HIV1RNA
Chọn plate set-up và kênh huỳnh quang là Ợ FAMỢ và ỢROXỢ. Sau đó chạy luân nhiệt realtime như sau: (1) 1 chu kỳ: 50oC trong 30 phút (2) 1 chu kỳ: 95oC trong 15 phút (3) 50 chu kỳ với 3 bước nhiệt độ 95oC /30Ợ - 50oC/60Ợ - 72oC /30Ợ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đoạn này.
3 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN AMPLICOR HIV-1 MONIOR
3.1 Tập trung mẫu
Amplicor HIV Ờ 1 Monitor chỉ dùng cho mẫu huyết tương. Máu nên chứa trong tube máu chứa chất kháng đông EDTA
3.2 Chuẩn bị thuốc thử
Bảo quản HIV-1 MMX và HIV-1 Mn2+ ở 2-80C tới khi sử dụng: (1) Chuẩn bị master mix bằng cách thêm 100μl HIV-1 Mn2+ vào tube HIV-1 MMX. Thêm 100μl HIV-1 Mn2+ vào toàn bộ các tube HIV-1 MMX. Đóng nắp và trộn đều bằng cách úp ngữa 10-15 lần. (2) Hút 50μl master mix vào trong mỗi tube phản ứng. Chắc rằng HIV-1 Mn2+ đã cho vào tube HIV-1 MMX bằng cách kiểm tra màu hồng. (3) Bảo quản giá tube phản ứng ở 2-80C đến khi chuẩn bị xong mẫu thử.
3.3 Chuẩn bị mẫu thử và chứng
Tất cả thuốc thử phải được chuẩn bị đầy đủ trước khi sử dụng
(1) Mở máy ly tâm lạnh ở 2-8oC. Sau đó chuẩn bị Ethanol 70% cho 12 phản ứng bằng cách trộn 11 ml Ethanol 95% và 4 ml nước khử ion. (2) Chuẩn bị working lysis cho 12 mẫu và chứng bằng cách trộn 25μl HIV-1 QS (vortex ắt nhất 10 giây trước khi sử dụng )vào một chai của HIV-1 LYS và trộn đều. (3) Dán nhãn vào tube ly tâm 1.5 ml cho mỗi mẫu và chứng. (4) Làm rã đông huyết tương ở nhiệt độ phòng và trộn đều. (5) Thêm 500μl huyết tương mẫu bệnh phẩm vào tube đã có nhãn rồi trộn đều 3 đến 5 giây. Đối với chứng âm và chứng dương thêm 500μl huyết tương người bình thường vào. (6) Ly tâm 23.600x g trong 60 phút rồi hút bỏ nước nổi tránh mất cắn lắng dưới đáy tube. (7) Phân phối 600μl Working Lysis vào mỗi tube. Đối với chứng âm và chứng dương cần thêm vào tube 12.5μl HIV-1 (-) và 12.5μl HIV-1 (+), vortex trong 5 giây. (8) Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút rồi thêm 600μl isoprobanol vào các tube và vortex trong 3-5 giây. (9) Ly tâm ở tốc độ tối đa (12.500x g) trong 15 phút. (10) Hút bỏ nước nổi tránh mất cắn lắng dưới đáy tube. (11) Thêm 1 ml Ethanol 70% và vortex 3-5 giây. (12) Tiếp tục ly tâm 5 phút ở tốc độ tương tự và hút bỏ nước nổi tránh mất cắn lắng dưới đáy tube. (13) Thêm 100μl HIV-1 DIL vào mỗi tube và vortex trong 10 giây. (14) Tiến hành khuếch đại trong hai giờ hoặc giữ dịch trắch biệt trong 1 tuần ở nhiệt độ
59
- 20oC. (15) Thêm 50μl dịch trắch biệt của chứng và mẫu vào tube phản ứng trước khi tiến hành khuếch đại và phân tắch kết qua.
3.4 Phiên mã và khuếch đại
Để mẫu vào máy và chạy chương trình luân nhiệt: (1) 1 chu kỳ 50oC trong 2 phút. (2) 1 chu kỳ 60oC trong 30 phút. (3) 4 chu kỳ với ba bước nhiệt 90oC/10Ợ Ờ 60oC/10Ợ Ờ 72oC/10Ợ. (4) 26 chu kỳ với ba bước nhiệt 95oC/10Ợ Ờ 55oC/10Ợ Ờ 72oC/10Ợ. (5) 1 chu kỳ 72oC trong 15 phút.
Sau khi thực hiện chương trình luân nhiệt mang các tube phản ứng cẩn thận tránh làm trào các tube. Và thêm 100μl MONITOR DN vào trong các tube phản ứng. Trộn đều bằng pipeting khoảng 5 lần. Các tube phản ứng có thể ở trạng biến tắnh trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành phát hiện phản ứng.
3.4 Phát hiện
Để hóa chất ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng: (1) Chuẩn bị Working Wash Solution bằng cách trộn đều một lượng thể tắch 10X WB vào 9 lượng thể tắch nước đã khử ion. (2) Thêm 100μl MONITOR HYB vào mỗi giếng. Những dòng từ A đến F của MONITOR MWP được phủ bởi probe HIV1 đặc hiệu; dòng G đến H phủ với probe QS đặc hiệu. (3) Thêm 25μl dung dịch đã biến tắnh vào trong dãy A của MWP và trộn đều bằng pipetting khoảng 10 lần. Pha loãng theo từng hàng những giếng HIV từ dãy B đến dãy F. Chuyển 25μl từ dãy A sang dãy B và trộn đều. Tiếp tục tương tự cho đến dãy F, sau đó hút bỏ 25μl. (4) Thêm 25μl dung dịch biến tắnh vào giếng QS trong dãy G của MWP trộn đều bằng pipetting khoảng 10 lần. Chuyển 25 μl dung dịch từ dãy G sang dãy H và trộn đều. Sau đó hút bỏ 25μl từ những giếng ở dãy H. (5) Dán nắp MWP và ủ ở 37oC trong 1 giờ. (6) Rửa WWP 5 lần với Working Wash Solution. (7) Thêm 100μl AV-HRP vào mỗi giếng. Phủ MWP và ủ 37oC trong 15 phút. (8) Rửa MWP như bước trên. (9) Chuẩn bị Working Subtract Solution bằng cách trộn đều 12ml SUB A với 3ml SUB B. Bảo quản tránh sang và chỉ dùng trong 3 giờ sau pha. (10) Thêm 100μl Working Subtrate Solution vào mỗi giếng. (11) Hiện màu trong 10 phút ở nhiệt độ phòng trong tối. (12) Thêm 100μl STOP vào mỗi giếng. (13) Đo OD tại 450nm trong thời gian 10 phút thêm STOP.
3.5 Kết quả
Tắnh toán nồng độ HIV1RNA của cả mẫu và chứng dùng công thức
Total HIV1 OD/Total QS OD * soá copies của QS trong mỗ phản ứng* 4 = HIV1 copies/ml huyết tương.
Số liệu được nhập và làm sạch bằng phần mềm Epidata 3.1, sau đó được phân tắch trên phần mềm STATA 11.