Công trình nghiên cứu sẽ được thực hiện với những nội dung cụ thể như sau 1.1 Thiết kế mồi và taqman probe: (1) Mồi sử dụng là mồi đã được công bố dùng
khuếch đại một đoạn PCR từ gene gag. (2) Taqman probe dành cho chứng
dương có trình tự bắt cặp đặc hiệu với PCR đắch và đầu 5Ỗ gắn với chất phát
huỳnh quang FAM. (3) Taqman probe dành cho chứng nội tại có trình tự bắt
cặp đặc hiệu với đoạn gen chứng nội tại được tổng hợp có đầu 5Ỗ gắn với chất
phát huỳnh quang HEX.
1.2 Thu nhận 50 mẫu huyết tương dương tắnh và 20 mẫu huyết tương âm tắnh với HIV1 được chẩn đoán bằng phương pháp ELISA tại Trung tâm chẩn đoán y khoa Medic
1.3 Thử nghiệm một số mẫu huyết tương dương tắnh và âm tắnh ở trên với bộ thuốc thử của Qiagen để xác định chắc chắc vài mẫu huyết tương HIV1RNA dương tắnh và âm tắnh. Qui trình thử nghiệm theo hướng dẫn của bộ kit.
1.4 Với các mẫu huyết tương HIV1RNA dương tắnh được xác định: (1) Thử mồi
và các taqman probe đã được thiết kế thông qua chế HIV1 TQPCR master
mix. (2) Sử dụng bộ kit NKRNAPREP của công ty Nam Khoa để trắch biệt RNA
toàn phần. (3) Phiên mã ngược RNA thành cDNA sử dụng bộ kit NKcDNA
synthesis của công ty Nam Khoa. (4) Dùng dịch cDNA này để thử hệ thống
PCR khuếch đại đoạn DNA mong muốn trong cDNA của HIV.
1.5 Từ sản phẩm đặc hiệu khuếch đại được, xây dựng hệ thống chứng dương và chứng nội tại bằng kỹ thuật tạo dòng. (1) Tạo chứng dương: Thực hiện thành công bước 1.4, thu nhận được sản phẩm khuếch đại, chèn sản phẩm khuếch đại vào plasmid và ứng dụng kỹ thuật tạo dòng để tạo chứng dương HIV1RNA. Pha loãng chứng dương HIV1RNA để thu được các chuẩn định lượng HIV1RNA. (2) Tạo chứng nội tại: Tổng hợp đoạn DNA để làm chứng nội tại có trình tự hai đầu bắt cặp bổ sung với mồi khuếch đại với HIV-cDNA đắch nhưng kắch thước và trình tự khác biệt so với sản phẩm khuếch đại. Chèn sản phẩm khuếch đại vào plasmid và ứng dụng kỹ thuật tạo dòng để tạo chứng nội tại HIV1RNA.
1.6 Sau khi xây dựng thành công kỹ thuật RT-PCR, chứng dương và chứng nội tại tối ưu các thành phần của Realtime PCR dùng TaqMan probe để phát hiện HIV-1 RNA thông qua việc đánh giá các chỉ tiêu sau: (1) Đánh giá giới hạn
phát hiện và giới hạn định lượng. (2) Đánh giá độ lập lại trong phản ứng. (3)
Đánh giá độ lập lại liên phản ứng. (4) Đánh giá độ đặc hiệu. (5) Đánh giá khả
năng chống ức chế. (6) Đánh giá độ bền vững trong bảo quản.
1.7 Thử nghiệm so sánh qui trình nghiên cứu với bộ Amplicor HIV-1 Monitor của Roche trên các mẫu huyết tương dương tắnh HIV1 để so sánh về hàm lượng virus mà hai hệ thống phát hiện được. Từ đó, đánh giá thông số về độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng hàm lượng phát hiện của qui trình nghiên cứu so với Amplicor HIV-1 Monitor.
20
2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ĐƯỢC SỬ DỤNG