V phải lấy để pha masterm
105 đến 107 copies/150ộl
4.6 Phương pháp
4.6.1 Mẫu thử
Huyết tương được tách từ máu kháng đông bằng citrate hay EDTA (không được kháng đông bằng heparin vì heparin gây ức chế PCR). Các mẫu huyết tương phải được tách từ máu không quá 4 giờ sau khi lấy. Máu sau khi lấy nếu chưa tách huyết tương phải được giữ 2-8oC. Huyết tương phải được lấy bằng đầu pipette tinh sạch và cho vào tube tinh sạch. Nếu chưa làm xét nghiệm ngay thì phải giữ mẫu ở -20oC với thời gian tối đa là 1 tuần. Nếu muốn giữ lâu hơn thì phải cho vào các tube chịu lạnh (cryotube) và giữ ở -70oC hay thấp hơn.
4.6.2 Phương pháp
Chuẩn bị mẫu thử
Phải kèm 1 chứng [-], 1 chứng [+], và 3 mẫu chuẩn định lượng cho mỗi lần làm xét nghiệm các mẫu thử. Chuẩn bị như sau:
Sử dụng 5 tube Eppendorf tinh sạch, ghi trên tube các ký hiệu sau: C [-], C [+]; S1, S2, S3 cho chứng [-], chứng [+], và 3 mẫu chuẩn định lượng. Cho vào đó 150l các mẫu tương ứng. Lưu ý: phải vortex mạnh 3 lần, mỗi lần 10 giây tube đựng chứng [+] và chẩn định lượng trước khi lấy.
Đếm số lượng mẫu thử phải làm xét nghiệm để lấy đủ số tube Eppendorf tinh sạch, mỗi tube cho một mẫu thử, ghi trên các tube ký hiệu của các mẫu thử. Cho 150l mẫu thử vào tube Eppendorf tương ứng
Vortex mạnh 3 lần, mỗi lần 10 giây tube NKHIV1RNA-IC. Dùng micropipette cho vào các tube C [-], C [+] cao, mẫu chuẩn định lượng và các tube mẫu thử đã chuẩn bị ở trên, mỗi tube 10l NKHIV1RNA-IC. Sau đó vortex các tube để trộn đều.
51
Phải tách chiết tòan bộ RNA từ các mẫu thử, chuẩn định lượng, và các
chứng với bộ NKRNAPREP.
Tổng hợp cDNA
Sử dụng NKcDNAsynthesis kit để thực hiện phản ứng RT với mồi ngẫu nhiên phiên mã ngược RNA trong các dịch tách chiết RNA ở trên (các mẫu bệnh phẩm, chuẩn định lượng và các chứng) thành cDNA theo hướng dẫn của bộ kit.
Cho vào TQPCR mix để chuẩn bị chạy realtime
Cho TQPCR master mix vào low-profile white PCR tube: Tắnh toán số phản
ứng cần phải thực hiện để lấy đủ số tube chứa master mix và số tube PCR. Mỗi một ống TQPCR master mix là đủ để cho vào 8 tube PCR 0.2 trên thanh PCR. Để các tube Master mix ở 4oC-10oC trong tối cho đến khi rã đông hòan tòan hay có thể làm tan nhanh bằng cách nắm các tube TQPCR master mix trong bàn tay. Một ống TQPCR master mix có thể làm rã đông và đông trong tối đa 3 lần. Sau khi rã đông hoàn toàn, lắc nhẹ để trộn; tuyệt đối không được vortex. Sau đó ly tâm nhẹ để lắng. Dùng micropipette phân phối TQPCR master mix vào các tube PCR, mỗi tube nhận 30l TQPCR master mix. Giữ các tube này trong đá bào hay giá đở tube đã giữ lạnh.
Cho cDNA vào TQPCR mix: Cho 20l cDNA vào mỗi TQPCR mix, phải ghi
vị trắ và các cDNA cho vào các TQPCR mix để biết rõ đâu là chứng [+], đâu là chứng [-], đâu là chuẩn định lượng và đâu là mẫu thử.
Sau khi hoàn tất cho các mẫu và chứng vào các tube PCR, tiến hành đậy nắp các thanh PCR. Cho các thanh PCR vào minispin có rotor cho thanh (strip), ly tâm trong 15 giây để lắng toàn bộ dung dịch trong tube PCR vào đáy ống nghiệm.
Chạy realtime PCR phát hiện và định lượng HIV1RNA
Cho tất cả các ống PCR mix đã chuẩn bị ở trên vào buồng ủ nhiệt của máy real-time PCR. Lau sạch nắp tube PCR bằng giấy lau không bụi để ánh sáng kắch thắch hay tắn hiệu huỳnh quang không bị nhiễu. Chọn plate set-up và chọn kênh hùynh quang là ỘFamỢ và ỘHexỢ để đầu đọc real-time của máy chọn được kắnh lọc cho nguồn sáng kắch thắch ỘFamỢ và ỘHexỢ phát được hùynh quang khi các taqman probe tương ứng bị thủy giải, và máy chọn được các kắnh lọc hùynh quang tương ứng để camera của máy ghi nhận được các ánh sáng hùynh quang phát ra. Chọn thể tắch phản ứng là 50l. Sau đó chạy chương trình luân nhiệt real-time như sau: 1 chu kỳ 95oC trong 3 phút, 50 chu kỳ với 2 bước nhiệt độ 94oC/15Ợ Ờ 60oC/1Ỗ và chụp hình tắn hiệu huỳnh quang ở giai đọan này
Phân tắch kết quả
Sau khi hoàn tất chương trình PCR, phân tắch kết quả theo các trình tự như sau:
Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm: Chọn các tube chuẩn định lượng và
chứng [-]. Kết quả chứng [-] phải không có tắn hiệu khuếch đại dương tắnh khi đọc bằng kênh FAM. Nếu có tắn hiệu khuếch đại dương tắnh thì có nguy cơ ngoại nhiễm trong quá trình thực hiện thử nghiệm do vậy không
52
thể đọc được kết quả các mẫu thử cho tắn hiệu khuếch đại dương tắnh HIV1cDNA.
Kiểm tra độ nhạy của thử nghiệm: Chọn các tube chuẩn định lượng,
giếng chứng [+] và giếng chứng [-]. Kết quả chứng [-] phải có tắn hiệu khuếch đại dương tắnh khi đọc bằng kênh HEX. Nếu chứng [-] không có tắn hiệu khuếch đại dương tắnh thì độ nhạy của xét nghiệm bị giảm vì đã không khuếch đại và phát hiện được cDNA chứng nội tại phiên mã ngược từ NKHIV1RNA-IC đã cho vào chứng [-] trước khi tách chiết RNA. Tuy nhiên đây mới chỉ là độ nhạy của hệ thống phát hiện chứng nội tại, phải kiểm tra độ nhạy của hệ thống khuếch đại đắch qua kết quả của giếng chứng [+] phải cho số copies có giá trị không khác biệt với giá trị đã ghi trên ống chứng [+] kiểm tra qua CV phải dưới 10.
Kiểm tra độ chắnh xác của thao tác pipetting: Chọn các tube
HIV1RNA chuẩn, và tube chứng [-]. Cho các giá trị copy vào các tube HIV1RNA chuẩn. Chọn biểu đồ chuẩn và đọc bằng kênh FAM. Độ chắnh xác của thao tác pipetting của người làm thắ nghiệm được hiển thị qua các thông số của biểu đồ chuẩn: hệ số tương quan là phải đạt 0.990; đồng thời hiệu quả PCR (E) từ 90% đến 105%. Thao tác pipetting của người làm thắ nghiệm phải chắnh xác mới có thể nói được kết quả định lượng là chắnh xác. Chắnh vì vậy, người làm thắ nghiệm phải thao tác trên mẫu chuẩn cùng với mẫu thử chứ không sử dụng các chuẩn đã được cho sẵn vào các PCR mix bởi người cung cấp kit. Nếu đường biểu diễn chuẩn vẫn chưa đạt các thông số lý tưởng thì người làm thắ nghiệm sẽ cố thay đổi các trị số chu kỳ nền (baseline cycle) tức là số chu kỳ ban đầu mà thiết bị sẽ lấy tắn hiệu huỳnh quang nền trong từng tube chuẩn và hay đường nền (baseline) cho đến khi đạt được các thông số chuẩn, tuy nhiên việc điều chỉnh này chỉ nên làm nếu các tube phản ứng (tube PCR) là các tube nhựa trong vì tắn hiệu huỳnh quang có thể bị nhiễu do bloc nhiệt bị dơ hay tube PCR bị dắnh màu bút acetone
Xác định các mẫu dương tắnh HIV1RNA và số lượng copy
HIV1RNA ban đầu của các mẫu [+] này: Sau khi đã có đường chuẩn, xác
định các tube dương tắnh và lượng copies cDNA đắch ban đầu (SQ = starting quantity) trong các tube mẫu thử dương tắnh này bằng cách đọc bằng kênh FAM từng tube cùng với các tube chuẩn và tube chứng [-]. Tube mẫu thử được đọc là dương tắnh cDNA đắch khi có tắn hiệu khuếch đại dương tắnh và có được giá trị Ct, tức là đường biểu diễn tắn hiệu khuếch đại này cắt được đường nền. Số lượng định lượng được chắnh là SQ có trong thể tắch mẫu đưa vào phản ứng. Để tắnh được số copies HIV1RNA trong 1ml mẫu huyết thanh hay huyết tương trước khi tách chiết RNA và tổng hợp cDNA đắch, chúng ta sẽ nhân SQ với hệ số K là hệ số có liên quan đến độ thu hồi sau tách chiết của mẫu và thể tắch mẫu được tách chiết. Với thể tắch mẫu được làm tách chiết là 150l và thể tắch dịch tách chiết RNA thu được là 15l thì hệ số K là 6.67 (20/3). Có thể có một số tube có giá trị Ct thấp dưới 12 và đường biểu diễn khuếch đại cũng không ngóc lên được. Đây là các tube mà camera ghi nhận hùynh quang rất sớm nhưng tắn hiệu hùynh quang lại không tăng lên theo các chu kỳ
53
nhiệt. Đối với các tube này, thử thay đổi baseline cycle của nó bằng cách tăng trị số đến các trị số vượt quá Ct của nó, mẫu có thể trở nên âm tắnh. Tuy nhiên để đảm bảo không bị âm tắnh giả, nên pha loãng thêm tách chiết 1/10 trước khi cho vào PCR mix
54
PHẦN 6 KẾT LUẬN
Thiết kế và đánh giá qui trình xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1-RNA trong huyết tương bệnh nhân nhiễm HIV/AID là một nhu cầu rất cần thiết phục vụ cho lâm sàng, đó là: (1) Chẩn đoán phát hiện được nhiễm HIV ở giai đoạn cửa sổ khi mà virus đã xâm nhập và hiện diện trong máu bệnh nhân mà đáp ứng miễn dịch của cơ thể chưa sản xuất đủ lượng kháng thể đặc hiệu để có thể phát hiện được trong máu; (2) chẩn đoán phát hiện được nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh vì kháng thể đặc hiệu hiện diện trong máu trẻ sơ sinh có thể chỉ là kháng thể từ mẹ nhiễm HIV truyền qua thai nhi chứ chưa hẵn đã là kháng thể do hệ miễn dịch của trẻ sản xuất vì trẻ nhiễm HIV từ mẹ; (3) Theo dõi được hiệu quả điều trị thông qua số lượng copies virus đếm được nhờ xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA trong huyết tương. Để đáp ứng được các yêu cầu trên thì qui trình xét nghiệm phải đủ nhạy cảm để có thể phát hiện được lượng virus thấp nhất có trong huyết tương bệnh nhân, phải cho được số định lượng chắnh xác với khoảng định lượng rộng đủ bao phủ được lượng virus có trong huyết tương bệnh nhân. Ngoài hai thông số này thì các thông số khác cũng cần phải được đánh giá là độ ổn định của xét nghiệm khi sử dụng qui trình xét nghiệm thông qua đánh giá độ lặp lại của các kết quả và độ bền trong lưu trữ bộ xét nghiệm. Cuối cùng, rất quan trọng đó là phải đánh giá được giá trị sử dụng trên các mẫu thật sự thông qua so sánh với một bộ xét nghiệm đã được công nhận IVD, tốt nhất là FDA công nhận.
Từ các nhận định như trên, qui trình xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA bằng kỹ thuật RT real-time PCR sử dụng taqman probe đặc hiệu gene gag của HIV1 đã được xây dựng hoàn thiện với tên là qui trình xét nghiệm ỘHIV1 RT-TQPCRỢ. Qui trình xét nghiệm bao gồm: (1) bộ tách chiết RNA sử dụng bộ NKRNAPREP của Nam Khoa; (2) bộ tổng hợp cDNA sử dụng bộ NKcDNA synthesis của Nam Khoa; (3) bộ khuếch đại và định lượng; (4) các bộ chứng và chuẩn. Các kết quả đánh giá cho thấy qui trình xét nghiệm có giới hạn định lượng thấp nhất, còn gọi là độ nhạy, là 60 copies HIV1RNA trong 1ml huyết tương; khoảng định lượng là 102-108 copies/ml; độ ổn định trong phản ứng và liên phản ứng cao đối với các mẫu có giá trị định lượng từ 100copies/ml trở lên; độ bền trong lưu trữ ắt nhất là 12 tháng; không bị chéo với các tác nhân vi sinh khác; có khả năng chống ức chế; và so sánh với bộ xét nghiệm đã được FDA công nhận IVD là HIV1 Amplicor khi thử trên các mẫu thật cho kết quả tương đương và nếu lấy kết quả xét nghiệm từ bộ xét nghiệm Amplicor làm chuẩn vàng thì độ nhạy và độ đặc hiệu của qui trình xét nghiệm đạt 100%.
Tuy nhiên để có thể đưa qui trình xét nghiệm vào chẩn đoán, phải xin phép để qui trình xét nghiệm HIV1 RT-QPCR được chấp nhận IVD từ Bộ Y Tế. Muốn vậy ngoài các đánh giá đã thực hiện trong công trình này, qui trình xét nghiệm cần phải được đánh giá tại Trung Tâm Kiểm Chuẩn Quốc Gia và được gửi thử nghiệm tại một số cơ sở đã đăng ký và được chấp nhận tiêu chuẩn ISO 15189 làm xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV trên các mẫu thật. Quá trình này cần phải có kinh phắ để trển khai.
55
TÀI LIỆU THAM KHẢO