V phải lấy để pha masterm
1 KẾT QUẢ PHA CHẾ CÁC THÀNH PHẦN CỦA QUI TRÌNH THỬ
NGHIỆM REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG
HIV1RNA
1.1 Kết quả đánh giá khả năng sử dụng mồi và probe đặc hiệu gene gag của
HIV1 qua kết quả pha chế HIV1-TQPCR master mix
Kết quả chạy real-time PCR dãy nồng độ ỘHIV1DNA đắchỢ được pha loãng từ 10-1 đến 10-10 cho các đường biểu diễn khuếch đại hiển thị trên biểu đồ (hình 16) sau:
Hình 16: Biểu đồ khuếch đại các pha loãng ỘHIV1DNA đắchỢ cho vào các HIV1-TQPCR mix. Kết
quả cho thấy các đường khuếch đại có Ct cách đều nhau khoảng 3-4 chu kỳ. Sơ bộ cho
phép kết luận là HIV1-TQPCR mix hoạt động được mà không cần phải thiết kế lại primers
và taqman probe
Biểu đồ cho thấy ở các độ pha loãng cách nhau 10 lần, kết quả real-time cho các giá trị Ct cách đều nhau từ 3-4 chu kỳ, tuy chưa lý tưởng nhưng cũng cho phép sơ bộ đánh giá HIV1-TQPCR master mix hoạt động tốt, không cần phải thiết kế lại các primers và taqman probe đặc hiệu cho gene gag của HIV1. Cũng từ kết quả này, công thức pha HIV1-TQPCR master mix được giữ nguyên mà không cần phải thay đổi hay phải thăm dò các nồng độ và các hàm lượng các thành phần TQPCR mix.
1.2 Kết quả chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+]
Chứng dương HIV1RNA-C[+] là RNA phiên mã từ ỘHIV1DNA đắchỢ là plasmid pGEM-T Easy đã chèn DNA đắch là sản phẩm PCR kết quả của RT- PCR với hai mồi đặc hiệu SK462 và SK431 trên bộ gene HIV1 tách chiết từ bệnh nhân [+] HIV1RNA. Hình 17A chứng minh sản phẩm PCR 140bps khuếch đại từ gene gag của HIV, và sản phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+]
40
có kắch thước 240bases phiên mã từ ỘHIV1DNA đắchỢ. Kết quả định lượng HIV1RNA-C[+] sau khi phiên mã và tinh sạch để chỉ thu được RNA, định lượng bằng nanodrop cho kết quả là 35ng/ộl. Với kắch thước 240bases thì số copy là 270 x 109 copies cho 1ộl, tương đương 40 x 1012 copies cho 150ộl. Để có các chuẩn định lượng 103, 104 và 105 copy cho 150ộl, trước hết phải pha loãng nồng độ gốc 40 lần để có 1.000 x 109, sau đó tiến hành pha loãng tiếp 6 độ pha loãng theo hệ số pha loãng 1/10, độ pha loãng cuối cùng sẽ là 103, trên nữa là 104 và trên nữa là 105.
1.3 Kết quả chế tạo chứng nội HIV1RNA-C[+]
Chứng nội HIV1RNA-IC là RNA phiên mã từ ỘHIV1DNA-ICỢ là plasmid pGEM-T Easy đã chèn DNA đắch là sản phẩm PCR 200bps kết quả của bắt cặp hai đoạn oligo HIV1-ICfoligo với HIV1-ICroligo rồi khuếch đại nhờ hai mồi SK462 và SK431. Hình 17B chứng minh sản phẩm HIV1DNA-IC 200bps được khuếch đại, và sản phẩm chứng nội HIV1RNA-IC có kắch thước 300 bases phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy chèn HIV1DNA-IC. Kết quả định lượng HIV1RNA-IC sau khi phiên mã và tinh sạch để chỉ thu được RNA, định lượng bằng nanodrop cho kết quả là 25ng/ộl. Với kắch thước 300bases thì số copy là 160 x 109 copies cho 1ộl, tương đương 1.6 x 1012 copies cho 10ộl. Để có pha loãng 100 copy cho 10ộl, trước hết phải pha loãng nồng độ gốc 160 lần để có 10copies x 109, sau đó tiến hành pha loãng tiếp 7 độ pha loãng theo hệ số pha loãng 1/10.
Hình 17: (A) Hình bên trái là kết quả điện di chip cho thấy lane 1 là sản phẩm PCR đắch của HIV1 kắch thước 140bps khuếch đại từ gene gag của HIV1 genome trắch từ huyết thanh người
nhiễm HIV có HIV1RNA [+], và lane 2 là sản phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+] kắch
thước 240 bases phiên mã từ plasmid pGEM-T Eseay chèn sản phẩm PCR. (B) Hình bên phải là kết quả điện di chip sản phẩm HIV1DNA-IC kắch thýớc 200bps (lane 1) và sản
phẩm HIV1RNA-IC kắch thước 300bps (lane 2) phiên mã từ plasmid pGEM-T Eseay chèn sản phẩm PCR.
1.4 Kết quả chứng minh chứng nội HIV1RNA-C[+] pha ở nồng độ 100
41
Hình 18 là biểu đồ khuếch đại dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có và không có cho thêm 10ộl chứa 100 copies chứng nội HIV1RNA-IC trước khi tách chiết RNA để tổng hợp cDNA rồi chạy real-time PCR. Biểu đồ cho thấy nồng độ cuối vẫn cho tắn hiệu khếch đại đắch HIV1 của cả hai dãy pha loãng là giống nhau. Kết quả này cho phép kết luận là chứng nội HIV1RNA-IC ở nồng độ cho vào mẫu trước khi tách chiết RNA là không cạnh tranh với đắch.
Hình 18: (A) Biểu đồ khuếch đại dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có (màu đỏ) và không có (màu xanh)
cho thêm 10ộl chứa 100 copies chứng nội HIV1RNA-IC trước khi tách chiết RNA để tổng
hợp cDNA rồi chạy real-time PCR. Kết quả cho thấy cả hai dãy pha loãng ở nồng độ cuối đều cho tắn hiệu khuếch đại, chứng tỏ chứng nội HIV1RNA-IC ở nồng độ 100 copies cho
vào thể tắch mẫu tách chiết đã không cạnh tranh với đắch. (B) Biểu đồ khuếch đại của
chứng nội HIV1RNA-IC trong các 5 mẫu HIV1RNA-C[+] có cho 10ộl chứng nội vào mẫu,
kết quả này chứng minh chứng nội thật sự được khuếch đại khi cho vào HIV1-TQPCR mix.