2.7.2 Phương pháp
Duỗi thẳng plasmid pGEM-T Easy đã chèn trình tự DNA đắch (là trình tự muốn phiên mã) bằng enzyme cắt giới hạn tạo đầu bằng: (1) Plasmid được định lượng và pha trong TE1X để đạt hàm lượng 0.2-1mg/ml. (2) Trong một tube PCR 0.2ml, cho vào các thành phần sau: Nước tinh sạch [14ộl], dung dịch đệm 10X của enzyme cắt giới hạn [2ộl], dung dịch BSA acetylated 1mg/ml [2ộl], Plasmid pha ở hàm lượng 0.2-1mg/ml [1ộl], Enzyme cắt giới hạn1 (trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng NdeI để cắt ở đầu SP6) 2-10U [1ộl], thêm nước tinh sạch [cho đến 20ộl]. (3) Ủ ở nhiệt độ phòng thắ nghiệm trong 1-4 giờ. (4) Tinh sạch plasmid đã duỗi thẳng bằng bộ thuốc thử ỘWizardệ SV Gel và PCR Clean-Up SystemỢ của Promega theo phương pháp đã được trình bày. (5) Kiểm tra kết quả bằng điện di, kết quả cho thấy plasmid được duỗi thẳng cho vạch DNA kắch thước 3015 đến 4000bps (tuỳ thuộc chiều dài đoạn chèn). (6) Định lượng nồng độ DNA và pha trong TE1X để đạt hàm lượng 5-10mg/ml.
Phiên mã DNA thành RNA bằng bộ thuốc thử ỘRiboMAXỎ Large Scale RNA Production Systems - SP6 and T7Ợ của Promega: (1) Trong một ống
PCR 0.2ml, cho vào: 20μl dung dịch đệm phiên mã T7 đậm đặt 5X, 30μl dung dịch 25mM rNTPs [ATP, CTP, GTP, UTP], 5-10μg plasmid đã duỗi thẳng,
cuối cùng thêm nuớc tinh sạch cho đến 100μl. (2) Trộn nhẹ bằng pipette lên xuống vài lần. (3) Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 2-4 giờ, thông thường 1ml phản ứng có thể cho được 2-5mg RNA sau khi phiên mã được từ 2-4 giờ. (4) Sau
khi hoàn tất phiên mã, tiến hành loại bỏ các DNA có trong ống phản ứng bằng
cách cho RQ1 RNase-Free DNase (có sẵn trong bộ thuốc thử) để đạt hàm
lượng 5U (5l DNAse), trộn nhẹ bằng pipette lên xuống vài lần, ủ 37oC trong 15 phút, cuối cùng tinh sạch RNA bằng bộ thuốc thử tách chiết RNA của Nam
Khoa (NKRNAPREP) theo qui trình đã trình bày. (6) Kiểm tra kết quả phiên mã bằng điện di trên thạch, kết quả sản phẩm phiên mã đạt độ dài tương đương độ dài của trình tự DNA chèn vào plasmid cộng thêm khoảng 80bps
các trình tự thêm vào của plasmid pGEM-T Easy kể từ trình tự T7 promoter đến vị trắ điểm cắt của enzyme cắt giới hạn. (7) Pha sản phẩm phiên mã trong
TE1X đã tinh sạch có thêm sodium azide và bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
Hình 14: Plasmid pGEM-T Easy được chèn trình tự DNA sẽ được enzyme cắt giới hạn NdeI cắt ở đầu SP6 NdeI được sử
dụng vì enzyme này chỉ cắt được một điểm ở đầu SP6 và không cắt được đoạn DNA đã được chèn vào pGEM-T Easy
1
Trong công trình nghiên cứu này chúng tôi sử dụng NdeI để cắt plasmid ở đầu SP6
T7
SP6
NdeI
T7 SP6
Duỗi thẳng plasmid bằng
28
Hình 15: Nhờ men T7 RNA polymerase mà DNA được chèn vào plasmid pGEM-T Esay sau khi duỗi thẳng được phiên mã thành chứng nội tại RNA