PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM REAL TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1RNA

TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1RNA

3.1 Mồi và Taqman probe

3.1.1 Mồi

Do HIV1 có quá nhiều biến thể, do vậy chúng tôi sử dụng mồi đã được sử dụng và đã được công bố, đó là SK462 (5' AGT TGG AGG ACA TCA AGC AGC CAT GCA AAT 3') và SK431 (5' TGC TAT GTC AGT TCC CCT TGG TTC TCT 3'). Mồi được đặt tổng hợp từ Proligo-Sigma.

3.1.2 Taqman probe

Taqman probe được sử dụng cũng là probe đã được công bố, đó là SK102 (5Ỗ- AGA CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG A-3Ỗ). Taqman probe dành cho chứng nội tại chắnh là một trình tự đặc hiệu đã được chúng tôi chèn vào DNA chứng nội tại, đó là HIV1-IC (5Ỗ-AGC CAT GAA GAA TGC CGT CTA TCA CAC A-3Ỗ). Màu huỳnh quang ở đầu 5Ỗ của SK 102 là FAM, của HIV1-IC là HEX, còn chất hấp phụ huỳnh quang của cả hai là BHQ1. Taqman probe được đặt tổng hợp từ Proligo-Sigma

3.2 Thiết kế các thành phần của qui trình thử nghiệm real-time PCR phát hiện và định lượng HIV1RNA hiện và định lượng HIV1RNA

Qui trình thử nghiệm sẽ bao gồm các thành phần sau đây

Dành cho khuếch đại nucleic acid NK

cDNA synthesis kit* HIV1-TQPCR master mix

Dành cho chứng và chuẩn HIV1RNA-IC HIV1DNA S1 HIV1DNA S2 HIV1DNA S3 HIV1RNA-C[+] Chứng [-]

Dành cho tách chiết nucleic acid từ bệnh phẩm NK

RNAPREP*

*là các sản phẩm có sẵn từ công ty Nam Khoa mà không cần phải nghiên cứu pha chế

T7 SP6

T7 RNA polymerase polymerase

29

3.3 Phương pháp pha chế HIV1-TQPCR master mix

HIV1-TQPCR được pha chế gồm từ các thành phần sau: (1) Platinium taq polymerase của Invitrogene. (2) dNTP của Promega. (3) PCR buffer kèm platinium taq polymerase của Invitrogen. (4) Mg++ kèm với platinium taq polymerase của Invitrogen. (5) Mồi SK462 và SK431 được đặt tổng hợp từ Proligo của Sigma. (6) Taqman probe SK102 đặc hiệu cho sản phẩm PCR khuếch đại từ gene gag của bộ gene HIV1 là được đặt tổng hợp từ Proligo của Sigma. (7) Taqman probe dành cho chứng nội tại HIV1-IC được đặt tổng hợp từ Proligo của Sigma. (7) Nước tinh sạch.

Để dễ dàng trong công việc pha chế, bảng 1 dưới đây là một danh sách các thành phần với các nồng độ hay hàm lượng ban đầu và các thể tắch phải lấy để pha được các HIV1-TQPCR master mix cho 10, 50 và 100 HIV1-TQPCR mix đạt các nồng độ và hàm lượng phải có trong phản ứng. Trong thực tế, HIV1- TQPCR master mix phải được pha trong buồng sạch với khắ thổi ra. Các thành phần được sử dụng để pha master mix phải được để tan đá hoàn toàn (trừ Taq polymerase vì enzyme này không bị đông đá dù để trong tủ đông), sau đó được lắc nhẹ để trộn đều (không vortex), rồi cho vào ly tâm lắng bọt, và ngay sau đó phải giữ lạnh trong đá bào. HIV1-TQPCR master mix trong và sau khi pha xong cũng phải luôn được giữ trong đá bào. Sau khi pha xong master mix, vặn chặt nắp tube rồi úp ngữa nhẹ nhàng nhiều lần để trộn đều, không vortex. Phân phối master mix vào các tube Eppendorf 1.5ml sậm màu, nắp vặn; mỗi tube cho 245l để khi sử dụng phân ra được 8 HIV1-TQPCR mix với thể tắch cho mỗi mix là 30l. Sau khi dán nhãn, cho các tube master mix này vào trong các túi nylon vuốt miệng và giữ ở tủ đông từ -18oC đến -20oC cho đến khi sử dụng

Bảng 1: Thể tắch của các thành phần được lấy từ các nồng độ hay hàm lượng gốc để pha được các

HIV1-TQPCR mastermix cho 10 mix Ờ 50 mix hay 100 mix