Là DNA được khuếch đại song song với DNA đắch nhưng cho sản phẩm khuếch đại có kắch thước khác (trong PCR kinh điển) sản phẩm khuếch đại của DNA đắch như vậy có thể phân biệt được khi điện di; và trình tự khác hoàn toàn hay khác một phần (trong PCR-ELISA hay trong real-time PCR) nhờ vậy có thể phân biệt được khi sử dụng probe đặc hiệu (specific probe). Tùy thuộc cho vào các giai đoạn nào mà chứng nội tại có thể được dùng cho các mục đắch sau: (1) Kiểm soát sự tách chiết trên mẫu bệnh phẩm tốt hay không nếu cho vào bệnh phẩm với lượng tối thiểu vừa đủ hay có sẳn trong bệnh phẩm. (2) Kiểm soát được ức chế để xác định kết quả là âm tắnh thật hay âm tắnh giả do chất ức chế còn hiện diện trong các mẫu tách chiết nếu được cho vào PCR mix trước hay sau khi cho tách chiết DNA từ bệnh phẩm. (3) Kiểm soát hệ thống khuếch đại DNA đắch có đạt được độ nhạy hay không nếu chứng nội tại dùng chung mồi với DNA đắch và hiện diện trong mẫu thử hay cho vào trong PCR mix với lượng tối thiểu vừa đủ. (4) Kiểm soát hệ thống tách chiết đang dùng có tốt hay không và thao tác có ngoại nhiễm nếu chứng nội tại có sẳn trong mẫu chứng âm và được tham gia tách chiết song song với mẫu bệnh phẩm[9].
Có nhiều loại chứng nội tại, đó là: (1) Chứng nội tại là DNA bộ gen vật chủ, vắ dụ globin gene nếu bệnh phẩm là mô lấy từ người, hay myoglobin gene của tôm nếu bệnh phẩm là các mẫu tôm sú. Để có thể khuếch đại được DNA chứng nội tại, chúng ta phải cho thêm vào trong PCR mix một cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội tại và nên thiết kế mồi sao cho nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ bắt cặp của mồi dành cho DNA đắch, và không tạo ra các dimer primer với mồi của DNA đắch. Do sử dụng DNA bộ gene vật chủ nên chứng nội tại này kiểm soát đđược mẫu thử có đủ không, kiểm soát được hệ thống tách chiết nucleic acid trên mẫu thử có tốt không, kiểm sóat được ức chế có hay không. Tuy nhiên loại chứng nội tại này không kiểm soát được hệ thống khuếch đại DNA đắch vì dùng mồi khác biệt và chỉ dùng cho một số bệnh
17
phẩm có chứa đđủ lượng mô tế bào vật chủ. (2) Chứng nội tại là DNA tổng hợp có nguồn gốc là DNA đắch, đó là DNA được tổng hợp bằng cách dùng đúng sản phẩm khuếch đại của DNA đắch nhưng cắt ngắn đi hay chèn một đoạn DNA nhỏ để làm cho nó dài hơn. Chứng nội tại loại này sử dụng cùng mồi với DNA đđắch nên không cần thiết kế mồi để cho thêm vào PCR mix. Nếu cho vào bệnh phẩm trước khi tách chiết với lượng vừa đủ thì ta đạt được 3 mục đắch, đó là kiểm soát được độ nhạy của toàn bộ qui trình xét nghiệm, kiểm soát được ức chế có hay không, và kiểm soát được có ngoại nhiễm không. (3) Chứng nội tại là DNA tổng hợp có nguồn gốc khác DNA đắch nhưng sử dụng cùng mồi với DNA đắch, đó là DNA được tổng hợp bằng cách dùng sản phẩm khuếch đại của DNA khác biệt với DNA đắch nhưng chèn ở hai đầu các trình tự giống hệt trình tự mồi của DNA đắch. Do sử dụng cùng mồi với DNA đắch nên không cần thiết kế mồi để cho thêm vào PCR mix. Nếu cho vào bệnh phẩm trước khi tách chiết với lượng vừa đủ thì ta đạt được 3 mục đắch kiểm soát như trên. (4) Chứng nội tại là một hệ thống mồi và DNA khác biệt hoàn toàn với DNA đắch, được khuếch đại song song với DNA đắch nhưng dùng mồi khác biệt DNA đắch. Để có thể khuếch đại được DNA chứng nội tại, phải cho thêm vào trong PCR mix một cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội tại và nên thiết kế mồi sao cho nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ bắt cặp của mồi dành cho DNA đắch, và không tạo ra các dimer primer với mồi của DNA đđắch. DNA chứng nội tại loại này nếu được cho vào bệnh phẩm trước khi tách chiết với lượng vừa đủ thì cũng đạt được cả 3 mục đắch kiểm soát nêu trên.
6 PHƯƠNG PHÁP TẠO DÒNG