Tổng hợp cDNA từ tách chiết RNA với bộ thuốc thử ỘNKcDNA synthesisỢ của Nam Khoa

2.1.1 Nguyên tắc

RNA từ các mẫu thử được tách chiết bằng thuốc thử RNAPREP của công ty Nam Khoa. Nguyên tắc hoạt động của bộ thuốc thử là dựa trên phương pháp do CHOMCZYNSKI và SACCHI sáng chế, đó là dùng Guanidine 14M và urea, phối hợp với phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây biến tắnh các protein, kết quả là các protein trong mẫu thử sẽ bị vón lại, DNA sẽ tan trong phase phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâm lắng tách. RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hổ trợ của tRNA và glycogen.

2.1.2 Phương pháp

Thêm vào tube chứa 150l mẫu thử là huyết tương một thể tắch 450l dung dịch R1 là Trizol (invitrogen) rồi làm thuần nhất mẫu dịch trong này bằng cách dùng pipette hút lên xuống nhiều lần. Ủ dịch thuần nhất ở 30oC trong 10 phút. Thêm 120l R2 là chloroform, lắc nhanh và cẩn thận dung dịch bằng cách úp ngữa trong 15 giây. Giữ 30oC trong 10 phút. Ly tâm 13,000RPM trong 15 phút ở máy ly tâm (có thể dùng ly tâm thường hay ly tâm lạnh 2- 8oC). Hút cẩn thận 300l dịch nổi vào một tube tinh sạch khác tránh không hút phase giữa. Thêm 300l R3 là iso-propanol, úp ngữa tube 15 giây rồi tiếp tục giữ 30oC trong 10 phút. Ly tâm 13,000RPM trong 10 phút ở máy ly tâm lạnh. Hút bỏ phần nước nổi, tránh không làm mất cắn RNA (nhiều khi không thấy) đóng trên một bên đáy tube. Rửa cắn với 700ộl R4 là ethanol 80% dùng ly tâm 8,000RPM trong 5 phút. Dùng micropipette hay hút chân không hút bỏ tất cả phần nước nổi. Làm khô cắn ở 55oC trong 10-15 phút. Bước làm khô nầy nên thực hiện trong ổ nhiệt khô hay trong máy cách thủy. Cho vào cắn khô 15l R5 là nước tinh sạch đã qua xử lý DEPC. Giữ ở 55-60oC trong 10 phút. Nếu chưa sử dụng ngay thì giữ dung dịch RNA đã tách chiết nầy ở Ờ20oC.

2.2 Tổng hợp cDNA từ tách chiết RNA với bộ thuốc thử ỘNKcDNA synthesisỢ của Nam Khoa của Nam Khoa

2.2.1 Nguyên tắc

RNA tách chiết được từ các mẫu thử sẽ được tổng hợp thành cDNA với thuốc thử NKcDNA synthesis của công ty Nam Khoa sản xuất dựa trên bộ hóa chất iScript cDNA synthesis của Biorad.

Nguyên tắc hoạt động của thuốc thử này là enzyme RT (reverse

Hình 12: Nguyên tắc tổng hợp cDNA từ RNA

21

transcriptase) phiên mã ngược mạch khuôn RNA sang cDNA nhờ mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexaner primers).

2.2.2 Phương pháp

Phương pháp thực hiện như sau: (1) Trước hết cho 15l dung dịch tách chiết vào tube PCR 0.2 có chứa sẵn 5l enzyme RT và Reaction mix 5X đang được ngâm trong đá. (2) Sau đó thực hiện tổng hợp cDNA bằng cách ủ tube phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình luân nhiệt chỉ 1 chu kỳ với 3 bước nhiệt độ: 25oC trong 5 phút để mồi ngẫu nhiên 6 nucleotide bắt cặp vào RNA sợi khuôn, sau đó 42oC trong 30 phút để enzyme Reverse transcriptase gắn vào mạch RNA và tổng hợp cDNA từ mồi đồng thời enzyme RNAseH cắt bỏ RNA khỏi mạch cDNA, sau cùng nhiệt độ được nâng lên 85oC để chấm dứt hoạt động của enzyme Reverse transcriptase. (3) Cuối cùng sản phẩm cDNA được giữ ở 4oC để chuẩn bị được cho vào real-time PCR mix đặc hiệu cho HIV1

2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR với bộ thuốc thử ỘWizardệ SV Gel and PCR Clean-Up SystemỢ của Promega