2.5.1 Nguyên tắc
Vector pGEM-T Easy là plasmid nhân tạo được duỗi thẳng và được nối thêm nucleotide T vào đầu 3Ỗ để tránh plasmid tự tạo vòng trở lại. Cũng nhờ có T ở đầu 3Ỗ mà sản phẩm PCR, luôn có đầu 3Ỗ thêm nucleotide A, dễ dàng được enzyme T4 DNA ligase nối vào hai đầu của vector và tạo lại plasmid dạng vòng, kết quả là sản phẩm PCR chèn được vào pGEM-T Easy. Sau khi được chèn sản phẩm PCR thì gene
lacZ trên plasmid pGEM-T Easy sẽ không thể hoạt động vì sản phẩm PCR đã chèn vào giữa gene lacZ. Chắnh nhờ vậy mà sau khi biến nạp vào E. coli, vi khuẩn tái tổ hợp
với pGEM-T Easy có mang đoạn chèn giữa gene lacZ sẽ không có khả năng phân hủy IPTG để tạo thành khúm có màu xanh trong khi đó thì E. coli tái tổ hợp chỉ mang pGEM-T Easy không có đoạn chèn sẽ có khả năng phân hủy IPTG tạo nên khúm màu xanh nhờ sản phẩm biến dưỡng từ IPTG kết hợp được với X-gal, và đây chắnh là nguyên tắc xanh/trắng để chọn clone mang plasmid có đoạn chèn.
2.5.2 Phương pháp
Thực hiện phản ứng nối sản phẩm PCR vào plasmid pGEM-T Easy: (1) Vì dung dịch đệm cho T4 DNA ligase (2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase) rất dễ hỏng nếu bị làm rã đông nhiều lần, do vậy ngay lần đầu tiên sau khi rã đông và vortex mạnh để trộn đều, phân dung dịch đệm thành từng thể
tắch nhỏ 5ộl vào các tube Eppendorf tinh sạch và giữ đông lạnh để sử dụng
dần. (2) Tube đựng vector pGEM-T Easy sau khi rã đông phải được ly tâm
13,000 rpm trong thời gian ngắn để lắng toàn bộ xuống đáy tube. (3) Sản
phẩm PCR phải được tinh sạch và định lượng nồng độ DNA trước khi thực
hiện thắ nghiệm. (4) Trong tube Eppendorf đã chứa sẵn 5ộl dung dịch đệm cho T4 DNA ligase đã rã đông và vortex mạnh để trộn, thực hiện phản ứng nối
bằng cách cho vào tube 1ộl vector pGEM-T Easy, 2ộl sản phẩm PCR, 1ộl
enzyme T4 DNA ligase, 1ộl nước khử ion để có thể tắch cuối cùng là 10ộl, trộn đều bằng micropipette lên xuống nhiều lần rôi ly tâm 13,000 rpm trong thời gian ngắn để lắng tất cả xuống đáy tube. (5) Ủ tube trong ngăn mát tủ
lạnh ở 4oC qua đêm, như vậy là hoàn tất phản ứng nối. Lưu ý là phải sử dụng
enzyme T4 DNA ligase của bộ thuốc thử chứ không nên sử dụng từ các nguồn
khác vì có thể còn các exonuclease sẽ cắt bỏ nucleotide T ở đầu 3Ỗ của vector.
Chuẩn bị các vật liệu để biến nạp sản phẩm nối vào vi khuẩn E. coli: (1) Vi khuẩn E. coli được sử dụng là dòng JM109 của Promega đã được làm thành vi khuẩn khả biến (competent cell), cũng có thể sử dụng các dòng E. coli khác
như E. coli DH5alpha; các vi khuẩn khả biến này được giữ thành từng thể tắch
100l và giữ ở -70oC, ống vi khuẩn chỉ được lấy ra và giữ trong đá bào để rã
Hình 13: Bản đồ gene của plasmid pGEM-T Easy với vị trắ chèn DNA ngay bên
trong gene lacZ
24
đông ngay trước khi sử dụng. (2) Chuẩn bị hai hộp thạch LB có ampicillin
100g/ml và có trãi lên mặt mỗi hộp thạch hổn hợp 100l IPTG (dung dịch IPTG 100mM trong nước khử ion, sau đó lọc vô khuẩn rồi giữ ở 4oC) và 20l X-gal (dung dịch X-gal 50mg/ml N,NỖ-dimethyl formamide, giữ ở -20oC), hai hộp thạch này phải được để đạt nhiệt độ phòng ngay trước khi sử dụng. (3)
Chuẩn bị môi trường SOC (Super Optimal Catabolite Repression Broth) bằng
cách cho vào một chai Duran: 2.0gr bacto tryptone, 0.5gr bacto yeast extract,
1ml NaCl 1M, 0.25ml KCl 1M, rồi thêm nước cất cho vừa đủ 100ml; hấp vô trùng 121oC/15 phút, để nguội, sau đó thêm 1ml Mg++ 2M vô trùng (2.033gr MgCl2.6H2O + 1.203gr MgSO4 trong nước cất đến 10ml rồi lọc vô trùng) và
1ml 2M glucose vô trùng (3.6gr glucose trong nước cất đến 10ml rồi lọc vô trùng); đậy nắp chai rồi trộn đều; phân phối vô trùng vào các tube nắp vặn vô
trùng, mỗi tube 1ml; giữ các tube SOC ở tủ đông cho đến khi dùng.
Biến nạp sản phẩm nối vào vi khuẩn E. coli: (1) Tube đựng vi khuẩn khả biến phải luôn giữ trong đá bào để rã đông, không được vortex để trộn mà chỉ trộn nhẹ bằng cách búng nhẹ đáy tube. (2) Quay ly tâm tube sản phẩm nối để lắng tất cả dung dịch vào đáy tube. (3) Chuẩn bị một tube Eppendorf tinh sạch, để trong đá bào, lấy 2l sản phẩm nối cho vào một tube rồi cho tiếp vào tube 50l huyền dịch vi khuẩn khả biến, búng nhẹ đáy tube để trộn rồi tiếp tục giữ trong đá bào trong 20 phút. (4) Gây shock nhiệt bằng cách lấy tube khỏi đá
bào rồi cho ngay vào máy cách thuỷ chắnh xác 42oC và giữ trong 45 Ờ 50 giây. (5) Lấy tube ra khỏi máy cách thuỷ rồi cho ngay lại vào đá bào và giữ tiếp trong đá bào trong 2 phút. (6) Cho vào tube 950l môi trường SOC đã giữ đạt ở nhiệt đô phòng rồi ủ tube ở 37oC trong tủ ủ có lắc trong 1 giờ 30 phút, ở đây
chúng tôi cho vào tủ ủ lai có quay tròn để trộn. (7) Sau khi ủ, lấy 100l huyền
dịch vi khuẩn nhỏ lên một hộp thạch LB ampicillin có trãi IPTG và X-gal đã chuẩn bị ở trên, đồng thời lấy 50l huyền dịch vi khuẩn nhỏ lên mặt hộp thạch
còn lại, cho lên mặt các hộp thạch khoảng 10 viên bi thuỷ tinh vô trùng, rồi lắc
xoay các hộp thạch nhiều lần để bi vô trùng trải đều vi khuẩn lên mặt thạch và
sau đó đổ bỏ bi. (8) Ủ hộp thạch ở 37oC trong 24 giờ, đáy trên nắp dưới, có thể
giữ thêm hộp thạch ở 4oC qua đêm để các khúm xanh trắng phân biệt được rõ
ràng hơn. (8) Các khúm trắng là các clone vi khuẩn có mang pGEM-T Easy có
đoạn chèn, còn các khúm xanh là các clone vi khuẩn mang pGEM-T easy
không có đoạn chèn, tuy nhiên cũng có khi các khúm xanh nhạt hơn vẫn có thể
là các clone vi khuẩn có mang plasmid có đoạn chèn.
Sàng lọc khúm trắng để chọn được clone vi khuẩn có mang pGEM-T Easy có đoạn chèn là sản phẩm PCR: (1) Chuẩn bị sẵn các chai chứa 5ml môi trường LB đã được hấp khử trùng, thêm ampicillin vào môi trường để đạt nồng độ ampicillin là 100g/ml ngay trước khi sử dụng. (2) Dùng vòng cấy nhựa hay tăm gổ vô trùng, chọn các khúm trắng cấy vào chai LB đã chuẩn bị ở trên, mỗi khúm cấy vào một chai. (3) Cho các chai vào tủ ủ 37oC có lắc, ở đây chúng tôi dùng tủ lai có xoay tròn để trộn, trong thời gian 16 đến 24 giờ. (4) Lấy 0.5ml canh cấy từ mỗi chai cho vào mỗi tube Eppendorf tinh sạch, đun sôi cách thuỷ các tube này trong 5 phút để tách chiết thô DNA của vi khuẩn, sau đó quay ly tâm 13,000 rpm trong 5 phút để lắng tế bào vi khuẩn xuống đáy tube. (5) Lấy
25
1l dịch nổi cho vào tube PCR chứa 24l PCR mix đặc hiệu cho đoạn chèn, ở đây là sản phẩm PCR do vậy sử dụng đúng mồi đã dùng để khuếch đại sản phẩm PCR, chạy chương trình luân nhiệt đúng là chương trình để khuếch đại sản phẩm PCR. (6) Chọn các chai LB cấy khúm trắng nào cho kết quả PCR đúng kắch thước sản phẩm PCR đã chèn vào pGEM-T Easy để tách chiết plasmid và cấy giữ chủng, dịch tách chiết plasmid này phải được định lượng để tắnh được số copy plasmid pGEM-T Easy được chèn sản phẩm PCR. Lưu ý
rằng chúng tôi sàng lọc các khúm trắng không bằng phương pháp làm PCR trực tiếp từ khúm vi khuẩn để tránh trường hợp khúm vi khuẩn dù không mang plasmid có đoạn chèn vẫn có thể bị nhiễm sản phẩm nối khi trãi huyền dịch vi khuẩn lên mặt thạch.
Giữ chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp plasmid pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR: (1) Từ các chai cấy vi khuẩn đã chọn, cấy lại vi khuẩn lên mặt hộp thạch LB có ampicillin 100g/ml, cấy theo phương pháp ba chiều để kiểm tra luôn tạp nhiễm nếu có. (2) Ủ hộp thạch trong tủ ấm 37oC trong 16-24 giờ, đáy trên nắp dưới. (3) Dùng tăm bông vô khuẩn gặt lấy vi khuẩn và trộn thành huyền dịch trong cryo-tube có chứa sẵn 0.5ml môi trường TSB có thêm 20% glycerol. (4) Giữ các tube vi khuẩn này ở -70oC.