Tách chiết plasmid với bộ thuốc thử ỘWizardệ Plus SV Minipreps DNA

Purification systemỢ của Promega

2.6.1 Nguyên tắc

Nguyên tắc của bộ thuốc thử là làm ly giải vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang plasmid có đoạn chèn để phóng thắch plasmid vào dung dịch, còn DNA bộ gene của vi khuẩn thì bị vón cùng với cặn là các mãnh vở xác vi khuẩn, nhờ vậy plasmid sẽ được tóm bắt trên màng silica của cột lọc. Sau khi rửa sạch, plasmid bám trên cột lọc sẽ được thôi ra dung dịch nước khử ion tinh sạch 2.6.2 Phương pháp

Chuẩn bị thuốc thử và vi khuẩn E. coli tái tổ hợp: (1) Chuẩn bị dung dịch rửa cột bằng cách thêm 35ml ethanol 95% vào chai chứa 20ml dung dịch rửa cột (colum wash solution), vặn chặt nắp để trộn đều, dung dịch này có thể ổn định trong 6 tháng để sử dụng dần. (2) Vi khuẩn E. coli mang plasmid được cấy qua đêm trong 5ml môi trường LB lỏng có ampicillin 100g/ml, ly tâm toàn bộ huyền dịch ở tốc độ tối đa của máy ly tâm bàn trong 5 phút, gặt lấy tế bào vi khuẩn bằng cách đổ bỏ dịch nổi và thấm khô dịch thừa bằng cách úp ngược tube trên tờ giấy thấm.

Làm ly giải tế bào vi khuẩn: (1) Cho vào tube cặn tế bào vi khuẩn 250l dung dịch làm huyền dịch tế bào (CRA = cell resuspension solution), dùng pipette hút lên xuống nhiều lần để làm huyền dịch vi khuẩn, sau đó hút chuyển toàn bộ huyền dịch qua một tube Eppendorf tinh sạch. (2) Cho tiếp vào tube 250l dung dịch ly giải tế bào (CLA = cell lysis solution), trộn đền bằng cách úp sấp ngữa tueb 4 lần, sau đó ủ ở nhiệt độ phňng thắ nghiệm cho đến khi huyền dịch trong (trong 4-5 phút, nhưng không được quá 5 phút). (3) Cho thêm vào tube 10l dung dịch Alkaline Protease và trộn đều bằng úp ngữa tube 4 lần, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút (không được quá 5 phút vì alkaline protease có

26

mục đắch bất hoạt các endonuclease được phóng thắch khi tế bào bị ly giải, nhưng nếu ủ quá lâu thì có thể tạo các nick trên plasmid DNA). (4) Cho tiếp vào tube 350l dung dịch trung hòa (NSB = Neutralization solution), rồi lập tức úp ngữa tube 4 lần để trộn (không vortex), sau đó ly tâm 13,000rpm trong 10 phút ở nhiệt độ thường.

Tinh sạch plasmid bằng cột qua ly tâm: (1) Cho cột vào tube thu (collection tube), hút toàn bộ dịch nổi (khoảng 850l) cho vào cột (tránh không hút cặn, nếu có cặn thì đổ trở ra một tube Eppendorf khác rồi quay ly tâm 13,000rpm trong 5 phút ở nhiệt độ thường, sau đó lấy dịch nổi cho lại vào cột trước đó mà không cần cho vào cột mới), ly tâm 13,000rpm trong 1 phút, đổ bỏ dịch qua cột rồi cho cột vào lại tube thu. (2) Cho vào cột 750l dịch rửa cột đã cho thêm ethanol 95% trước đó, ly tâm 13,000rpm trong 1 phút, đổ bỏ dịch qua cột rồi cho cột vào lại tube thu. (3) Rửa cột thêm một lần nữa nhưng lần này với 250l dịch rửa cột và ly tâm 13,000rpm trong 2 phút, cho cột vào lại tube Eppendorf mới, tránh không cho cột đụng vào dịch rửa cột, nếu có hay nếu cột còn dắnh dịch rửa cột thì lại quay ly tâm thêm 13,000rpm trong 1 phút nữa để làm khô cột hoàn toàn rồi chuyển cột vào một tube Eppendorf mới. (4) Cho vào cột 100l nước tinh sạch, ly tâm 13,000rpm trong 1 phút, bỏ cột đi, dịch thu được chứa plasmid DNA tinh sạch có thể giữ lâu bền ở -20oC, nếu muốn giữ ở 4oC thì thêm vào dịch 11l dung dịch 10X TE, tuy nhiên nếu muốn giải trình tự bằng bigdye thì không được cho TE vào. (5) Định lượng plasmid DNA bằng đo OD, tắnh số copy plasmid theo công thức : N (copies/ml) = (6.022 x 1023) x C / (650 x 109 x L) copies/ml với C là nồng độ ng/ml và L là chiều dài base của plasmid.