Tối ưu điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất saponins và khả năng chống oxy hóa từ thân cây xáo tam phân (paramignya trimera)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SÓNG CHO HỢP CHẤT SAPONINS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG ÔXY HÓA TỪ THÂN CÂY XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA) Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Tặng Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thanh Hằng Mã số sinh viên : 57131389 Khánh Hòa - 2019 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SÓNG CHO HỢP CHẤT SAPONINS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG ƠXY HĨA TỪ THÂN CÂY XÁO TAM PHÂN(PARAMIGNYA TRIMERA) GVHD: TS Nguyễn Văn Tặng SVTH: Nguyễn Thị Thanh Hằng MSSV: 57131389 Khánh Hòa, tháng 7/2019 ii iii LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân em hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Văn Tặng phần nhỏ đề tài “Nghiên cứu hoạt chất hoạt tính sinh học từ Xáo tam phân” TS Nguyễn Văn Tặng – Trường Đại học Nha Trang Các số liệu, kết nêu đề tài trung thực chưa công bố cơng trình khác Em xin chịu trách nhiệm hồn tồn có gian dối Nha Trang, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Hằng iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài trước hết, em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Cơng Nghệ Thực phẩm kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc em xin gửi đến thầy TS Nguyễn Văn Tặng tận tình hướng dẫn, động viên truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu khoa học, kinh nghiệm thực tế kỹ làm việc suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo phịng thí nghiệm Khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm, khu công nghệ cao thuộc Trung tâm Thí nghiệm Thực hành – Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện sở vật chất, trang thiết bị để em hồn thành tốt đồ án Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiện, động viên cổ vũ tinh thần để em vượt qua khó khăn suốt thời gian vừa qua Em xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Hằng v TÓM TẮT Saponins nhóm hợp chất phân bố rộng rãi tự nhiên Cụ thể hơn, hợp chất ghi nhận có 100 họ thực vật có 150 saponins tự nhiên, biết đến nhóm hợp chất tự nhiên có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe người, bật chức chống ôxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm nhiễm ung thư…[31] Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu saponins từ loài thực vật khác nhau, tập trung vào khảo sát thành phần hóa học, hoạt tính sinh học hợp chất đơn lẻ dịch chiết, phương pháp cải thiện hiệu suất thu nhận (sử dụng phương pháp trích ly đại có giải pháp hỗ trợ: enzyme, vi sóng, sóng siêu âm, áp suất cao ), ứng dụng hợp chất thu nhận vào việc tạo sản phẩm thương mại Các phương pháp trích ly đại cho hiệu thu nhận cao hơn, rút ngắn thời gian trích ly, bảo tồn hoạt tính dịch chiết thu Tuy nhiên, điều kiện trích ly tối ưu cho phương pháp đối tượng cụ thể không giống Cây xáo tam phân (Paramignya trimera) [23] người dân địa phương biết đến sử dụng từ lâu, vị thuốc Xáo tam phân bào chế kết hợp với vị thuốc khác điều trị bệnh nan y ung thư vú, ung thư gan, ung thư đại tràng, viêm gan siêu vi sử dụng để bồi bổ sức khỏe Những nghiên cứu khoa học công bố gần từ số nước giới cho thấy Xáo tam phân có thành phần hóa học phong phú, có chứa hợp chất saponins, phenolics, courmarin, triterpenoid flavonoid Nghiên cứu thiết kế để tối ưu hóa thơng số chiết phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng (MAE) để thu hàm lượng saponins (SC), hiệu suất trích ly saponins (SEE), hàm lượng phenolic tổng số (TPC) khả chống ơxy-hóa (DRSC FRAP) từ thân Xáo tam phân phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Thiết kế Central Composite Design cho yếu tố thực thông qua việc bố trí 28 thí nghiệm để làm rõ ảnh hưởng (X1) nồng độ methanol (%); (X2) cơng suất vi sóng(W); (X3) thời gian chiếu xạ (giây/phút); (X4) thời gian chiết xuất (phút); (X5) tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g) SC, SEE, TPC, DRSC, FRAP Kết xây dựng phương trình mơ tả ảnh hưởng thông số MAE vi đến hàm mục tiêu hàm lượng saponins (YSC) khả chống ơxy-hóa (YDRSC, YFRAP) từ thân xáo phân sau: YSC = 26,52+ 6,37X1 - 6,47X2 + 3,809X3 +1,12X4 +1,89X5+ 0,696 X1X2 -1,63X1X3 - 1,499X1X4 + 2,36X1X5 +2,296X2X3 - 0,44X2X4 + 1,58X2X5 - 0,954X3X4 + 0,486X3X5 - 3,8025X4X5 + 8,24X12 + 8,236X22 - 0,289X32 -3,99X42 - 2,10X52 YDRSC = 80,31 +3,94 β1X1 + 1,343X2 + 2,23X3 -1,678X4 + 2,45X5+ 0,914X1X2 1,176X1X3 - 0,39X1X4 - 0,74X1X5 + 4,73X2X3 - 0,55X2X4 + 2,178X2X5 + 1,598X3X4 + 0X3X5 - 0,44X4X5 + 9,507X12 + 1,837X22 + 1,37X32 - 1,063X42 9,193X52 YFRAP = 3,397 + 0,797X1 - 0,46X2 - 0,082X3 - 0,018X4 – 0,147X5+ 0,0425X1X2 + 0,044X1X3 + 0,0025X1X4 + 0,133X1X5 - 0,161X2X3 - 0,22X2X4 + 0,165X2X5 + 0,056X3X4 + 0,54X3X5 + 0,005X4X5 + 0,25X12 + 0,801X22 – 0,339X32 + 0,641X42 – 0,219X52 Kết nghiên cứu đưa thông số MAE tối ưu để đạt SC, SEE, TPC cao khả chống ơxy hóa tốt nồng độ methanol 100%, cơng suất vi sóng 400 W, thời gian chiếu xạ giây/phút, thời gian chiết 40 phút tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 80 ml/g mẫu khô Tại thông số MAE tối ưu này, giá trị thực nghiệm SC, SEE, TPC, DRSC, FRAP thân Xáo tam phân 55,92 mg EE/g mẫu; 80,1%; 5,56 mg GAE/g mẫu; 89,4 mg DPPH/g mẫu 5,11 mg Fe(II)/g mẫu Những kết thực nghiệm đo có giá trị gần với kết dự đốn từ mơ hình (53,45 mg EE/g mẫu; 76,52%; 5,4 mg GAE/g mẫu; 90,57 mg DPPH/g mẫu 5,51mg Fe(II)/g mẫu), điều chứng tỏ mơ hình tối ưu tương thích tốt với thực nghiệm Như vậy, thơng số MAE tối ưu nồng độ methanol 100%, 400W, giây/phút, 40 phút 80 ml/g mẫu chọn để tối ưu hóa cho hợp chất saponins khả chống ơxy-hóa từ thân xáo tam phân cho nghiên cứu ứng dụng vii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………………………….v TÓM TẮT………………………………………………………………………………… …vi MỤC LỤC………………………………………………………………………………… viii DANH MỤC CÁC TỪ VIÊT TẮT…………………………………………………… …… x DANH MỤC HÌNH………………….……………………………………………………… xi DANH MỤC BẢNG……………………………………………………………………… xiii PHẦN MỞ ĐẦU……… ………………………………………………………………… …1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………………… … 1.1 Tổng quan xáo tam phân 1.1.1 Đặc điểm phân bố sinh thái Xáo tam phân 1.1.2 Thành phần hóa học Xáo tam phân 1.2 Công dụng Xáo tam phân 1.3 Giới thiệu hoạt chất sinh học 11 1.3.1 Hợp chất saponins 11 1.3.2 Hợp chất phenolics 15 1.3.3 Phương pháp trích ly thu nhận saponins từ mẫu nghiên cứu 17 1.3.4 Ngun lý q trình trích ly 17 1.3.5 Trích ly có hỗ trợ vi sóng (MAE: microwave - assisted extraction) 17 1.3.6 Phương pháp tối ưu hóa q trình trích ly 19 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu, thiết bị dụng cụ hóa chất phân tích 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 22 2.1.3 Hóa chất phân tích 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 23 2.3 Bố trí thí nghiệm chi tiết 23 2.3.1 Xác định độ ẩm dư 23 2.3.2 Trích ly 24 2.3.3 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 25 2.3.4 Phân tích hàm lượng saponins (SC) 27 viii 2.3.5 Xác định hiệu suất chiết saponin hiệu (SEE) 28 2.3.6 Hàm lượng phenolic tổng số (TPC) 28 2.3.7 Khả bắt gốc tự DPPH 29 2.3.8 Khả chống ôxy hóa phương pháp khử ion sắt (FRAP) 29 2.4 Phương pháp xử lí số liệu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………………………… 31 3.1 Độ ẩm dư nguyên liệu 31 3.2 Ảnh hưởng thông số trích ly hỗ trợ vi sóng đến hàm lượng phenolics tổng số, hàm lượng saponins, hiệu suất thu hồi saponins khả chống ơxy-hóa dịch chiết từ thân Xáo tam phân 31 3.2.1 Hàm lượng saponins (SC) 33 3.2.2 Hiệu suất chiết saponins (SEE) 39 3.2.3 Hàm lượng phenolics tổng số (TPC) 43 3.2.4 Khả bắt gốc tự DPPH 48 3.2.5 Khả chống ơxy- hóa phương pháp khử ion sắt (FRAP) 53 3.3 Kiểm chứng phù hợp mơ hình so với thực nghiệm 58 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN…………………………………… 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Đề xuất ý kiến 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC……………….……… ………………………………………………………… 66 PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 66 5.1 Xác định hàm lượng ẩm dư 66 5.2 Xây dựng đường chuẩn acid galic 67 5.3 Xây dựng đường chuẩn escin 68 5.4 Xây dựng đường chuẩn DPPH 69 5.5 Xây dựng đường chuẩn FRAP 70 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SPSS 72 PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 75 ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PAL Phenylalanine ammonia lyase UV Ultraviolet MAE Microwave-assisted extraction UAE Ultrasound-assisted extraction SFE Supercritical fluid extraction RSM Response surface methodology UV-Vis Ultraviolet-visible spectroscopy 3D Three-dimensional SD Standard deviation TPC Total phenolic content GAE Gallic acid equivalent SEE Saponins extraction efficiency SC Saponin content EE Escin equivalent DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DRSC DPPH radical-scavenging capacity FRAP Ferric ion reducing antioxidant power WHO Wolrd Health Organization (Tổ chức Y tế giới) x Phạm Thị Qúi, "Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất [11] phenolics khả chống oxy hóa từ rễ an xoa (Helicteres hirsuta Lour.)," Đại Học Nha Trang, 2018 Trần Thị Thúy Quỳnh, Nguyễn Trung Dũng Phạm Đông Phương, "Phân lập [12] vài hợp chất acridon alcaloid rễ xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill)," Tạp chí Dược học, vol 54, pp 60-64, 2014 Trần Thị Thúy Quỳnh, Lê Thị Kim Thoa Phạm Đông Phương, "Phân lập [13] số hợp chất coumarin rễ xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill)," Tạp chí Dược học, vol 54, pp 60-66 [14] (2012) Bảo tồn thuốc xáo tam phân Available: https://tuoitre.vn/bao-ton- cay-thuoc-xao-tam-phan-524307.htm Thần dược từ thiên nhiên Available: http://duoclieuduongthu.vn/xao-tam- [15] phan.html [16] Xáo Tam Phân Available: https://blogcaycanh.vn/cay_canh/d/cay-xao-tam- phan-1 [17] Nguyễn Thùy (2018) ung thư Việt Nam số phải giật Available: https://anninhthudo.vn/doi-song/ung-thu-o-viet-nam-nhung-con-so-phai- giat-minh/789891.antd Tiếng Anh [18] Xue L B, Tian L Y, Ya H Y and Hua W Z, "Optimization of microwave‐ assisted extraction of polyphenols from apple pomace using response surface methodology and HPLC analysis," Journal of separation science, vol 33, pp 37513758, 2010 [19] Syed S B, Lakshmi N M and Bandi B G, "Polyphenolics profile and antioxidant properties of Raphanus sativus L," Natural product research, vol 26, pp 557-563, 2012 [20] Bhuyan D J, Vuong Q V, Chalmers A C, Van A I A, Bowyer M C and Scarlett C J, "Microwave-assisted extraction of Eucalyptus robusta leaf for the optimal yield of total phenolic compounds," Industrial Crops and Products, vol 69, pp 290-299, 2015 62 [21] Bouras M, Chadni M, Barba F J, Grimi N, Bals O and Vorobiev E, "Optimization of microwave-assisted extraction of polyphenols from Quercus bark," Industrial Crops and Products, vol 77, pp 590-601, 2015 [22] Bowyer M C, Vuong Q V, Van A I A and Scarlett C J, "Phytochemicals and antioxidant capacity of Xao tam phan (Paramignya trimera) root as affected by various solvents and extraction methods," Industrial Crops and Products, vol 67, pp 192-200, 2015 [23] Burkill I H, An enumeration of the species of Paramignya, Atalantia and Citrus, found in Malaya: éditeur non identifié, 1931 [24] Nguyen M C, Tran T H, Pham N K, Nguyen V T, Vu T H, Bui H T and Young H K, "Paratrimerins A and B, two new dimeric monoterpene-linked coumarin glycosides from the roots and stems of Paramignya trimera," Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol 63, pp 945-949, 2015 [25] Dai J and Mumper R J, "Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties," Molecules, vol 15, pp 7313-7352, 2010 [26] Diwan F H, Abdel H I A and Mohammed S T, "Effect of saponin on mortality and histopathological changes in mice," 2000 [27] Hassler M, "World Plants: synonymic checklists of the vascular plants of the world (version Nov 2015)," Species, 2000 [28] Lee M S, Chan J Y W, Kong S K, Yu B, Vincent O E C, Henry W N C, Thomas M C W and Kwok P F, "Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer cells and in xenograft," Cancer biology & therapy, vol 4, pp 1248-1254, 2005 [29] Feng L, Yukari O, Dya F D, Suresh A, Shigetoshi K and Yasuhiro T, "Anti- austerity agents from rhizoma et radix notopterygii (Qianghuo)," Planta medica, vol 78, pp 796-799, 2012 [30] Lugast A and Hovari J, "Flavonoid aglycons in foods of plant origin I Vegetables," Acta Alimentaria, vol 29, pp 345-352, 2000 [31] Shuli M, Wenyuan G, Yanjun Z, Luqi H and Changxiao L, "Chemical study and medical application of saponins as anti-cancer agents," Fitoterapia, vol 81, pp 703-714, 2010 63 [32] Müller J and Heindl A, "Drying of medicinal plants," Frontis, pp 237-252, 2006 [33] Nguyen M K, Pham T N H and Do T P, "Study on acute toxicity, hepatoprotective activity and cytotoxic activity of Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum," Tap Chi Duoc Lieu, vol 1, p 18, 2013 [34] Nguyen V T, Bowyer M C, Van I A A and Scarlett C J, "Optimisation of microwave-assisted extraction from Phyllanthus amarus for phenolic compoundsenriched extracts and antioxidant capacity," Chemical Papers, vol 70, pp 713-725, 2016 [35] Nguyen V T, Pham N M Q, Vuong Q V, Bowyer M C, Van A I A and Scarlett C J, "Phytochemical retention and antioxidant capacity of xao tam phan (Paramignya trimera) root as prepared by different drying methods," Drying technology, vol 34, pp 324-334, 2016 [36] Nguyen V T, Pham N M Q, Vuong Q V, Bowyer M C, Van A I A and Scarlett C J, "Microwave‐assisted extraction for saponins and antioxidant capacity from Xao tam phan (Paramignya trimera) root," Journal of food processing and preservation, vol 41, p e12851, 2017 [37] Pham H B, Nguyen M K and Nguyen T B T, "Isolation and quantitative analysis of Ostruthin in the medicinal plant Paramignya trimera collected in Vietnam," Journal of Medicinal Materials, vol 18, pp 173-179, 2013 [38] Pham H N T, Bowyer M C, Van A I A and Scarlett C J, "Influence of solvents and novel extraction methods on bioactive compounds and antioxidant capacity of Phyllanthus amarus," Chemical Papers, vol 70, pp 556-566, 2016 [39] Ragasa C Y, Tan M C S, Noel N G and Shen C C, "Isothiocyanates, sterol and triglycerides from Raphanus sativus," ed: Der PharmaciaLettre, 2015 [40] Rao A V and Sung M K, "Saponins as anticarcinogens," The Journal of nutrition, vol 125, pp 717S-724S, 1995 [41] Roskov Y, Kunze T, Orrell T, Abucay L, Paglinawan L, Culham A, Bailly N, Kirk P, Bourgoin T and Baillargeon G, "Species 2000 & ITIS Catalogue of Life, 2014 Annual Checklist Digital resource at www catalogueoflife org/annual- checklist/2014," ed: Species 2000, Naturalis, Leiden, the Netherlands, 2014 64 [42] Fereidoon S and Marian N, Phenolics in food and nutraceuticals: CRC press, 2003 [43] Ninh T S, "Notes on the genus Paramignya: Phytochemistry and biological activity," Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University, vol 56, pp 1-10, 2018 [44] Sparg S G, Light M E and Van S J, "Biological activities and distribution of plant saponins," Journal of ethnopharmacology, vol 94, pp 219-243, 2004 [45] Sing P T, Quan V V, Costas E S, Sophie E P and Paul D R, "Optimized aqueous extraction of saponins from bitter melon for production of a saponin‐enriched bitter melon powder," Journal of food science, vol 79, pp E1372-E1381, 2014 [46] Hoang L T A, Dong C K, Wonmin K, Tran M H, Nguyen X N, Pham H Y, Bui H T, Luu H T, Vu N L and Tran G, "Anti-inflammatory coumarins from Paramignya trimera," Pharmaceutical biology, vol 55, pp 1195-1201, 2017 [47] Tran T V, Bui Q T P, Nguyen T D, Ho T V T and Bach L G, "Application of response surface methodology to optimize the fabrication of ZnCl2-activated carbon from sugarcane bagasse for the removal of Cu2+," Water Science and Technology, vol 75, pp 2047-2055, 2017 [48] Quan V V, Sathira H, Paul D R, Michael C B, Phoebe A P and Christopher J S, "Effect of extraction conditions on total phenolic compounds and antioxidant activities of Carica papaya leaf aqueous extracts," Journal of Herbal Medicine, vol 3, pp 104111, 2013 [49] Rensheng X, Yang Y Weimin Z, Introduction to natural products chemistry: CRC press, 2011 [50] Hoang T Y, Trinh T T L, Mai C T, Nguyen T T H, Lai T N H and Bui V N, "Optimization of extraction of phenolic compounds that have high antioxidant activity from Rhodomyrtus tomentosa (ait.) Hassk.(sim) in chi linh, Hai Duong," Academia Journal of Biology, vol 37, pp 509-519, 2015 65 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 4.3 Xác định hàm lượng ẩm dư * Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay mẫu, sau dựa vào hiệu số khối lượng mẫu trước sau sấy ta xác định hàm lượng ẩm dư mẫu * Dụng cụ, hóa chất: Tủ sấy, cân phân tích, cốc sấy, bỉnh hút ẩm có chứa Silicagen * Tiến hành: Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc sấy rửa sạch, để nước, sấy o nhiệt độ 100-105 C khoảng giờ, lấy làm nguội bình hút ẩm đem cân cân phân tích Sấy đến khối lượng không đổi (giữa lần cân sai số khơng q 5,10-4 g) Cân xác g mẫu cho vào cốc sấy khô đến khối lượng không đổi, o cho cốc sấy vào tủ sấy Tiến hành sấy 100-105 C khoảng 6-7 Sau lấy để nguội bình hút ẩm khoảng 30 phút đem cân cân phân tích Tiếp tục sấy đến khối lượng không đổi Tính kết quả: Từ hao hụt khối lượng mẫu, ta xác định độ ẩm dư mẫu theo công thức sau: W (%) = 𝑮𝟏−𝑮𝟐 𝑮𝟏−𝑮 ∗ 𝟏𝟎𝟎 Trong đó: W (%): Hàm lượng ẩm (độ ẩm dư) G1 (g): Khối lượng cốc sấy mẫu trước sấy G2 (g): Khối lượng cốc sấy mẫu sau sấy G (g): Khối lượng cốc sấy G G1 G2 W 44,512 45,513 45,469 4,39 43,798 44,799 44,758 4,19 66 43,672 44,673 44,628 4,50 W=4,36% 4.4 Xây dựng đường chuẩn acid galic Cân xác 0,01 g acid gallic, cho vào cốc thủy tinh cho thêm 100 ml nước cất, hịa tan hồn tồn gallic acid ta nồng độ dung dịch gallic acid vừa pha 100 µg/ml Sau tiến hành pha loãng dung dịch vừa pha thành nồng độ khác (80 µg/ml, 60 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml) sau:  ml acid gallic 100 µg/ml + ml nước cất => acid gallic 80 µg/ml  ml acid gallic 100 µg/ml + ml nước cất => acid gallic 60 µg/ml  ml acid gallic 100 µg/ml + ml nước cất => acid gallic 40 µg/ml  ml acid gallic 100 µg/ml + ml nước cất => acid gallic 20 µg/ml Tiến hành tương tự xác định hàm lượng phenolics tổng số, khác ta thay dịch chiết thân Xáo tam phân acid galic nổng độ khác Tiến hành đo máy đo quang phổ bước sóng 765 nm, ta thu đường chuẩn sau: Acid galic Lần Lần Lần Trung bình Mẫu trắng 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 20 0.334 0.3510 0.3550 0.3467 40 0.531 0.5360 0.5340 0.5337 60 0.739 0.7880 0.8010 0.7760 80 1.011 0.9500 1.0210 0.9940 100 1.287 1.2080 1.2810 1.2587 67 1.4000 y = 0.0114x + 0.0965 R² = 0.997 1.2000 1.0000 0.8000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 20 40 60 80 100 120 4.5 Xây dựng đường chuẩn escin Hòa tan 0,02 g escin (tương ứng với viên thuốc Aescin-một loại chế phẩm escin chứa 20mg escin/viên) 40 ml methanol 100%, lọc qua giấy lọc, ta dung dịch escin 500 (µg/ml) Tiếp tục pha loãng nồng độ khác sau:  4ml dung dịch escin 500 (µg/ml) + ml methanol 100% => dung dịch escin 400 (µg/ml)  3ml dung dịch escin 500 (µg/ml) + ml methanol 100% => dung dịch escin 300 (µg/ml)  ml dung dịch escin 500 (µg/ml) + ml methanol 100% => dung dịch escin 200 (µg/ml)  1ml dung dịch escin 500 (µg/ml) + ml methanol 100% => dung dịch escin 100 (µg/ml)  0.5 ml dung dịch escin 500 (µg/ml) +4.5 ml methanol 100% => dung dịch escin 50 (µg/ml) Tiến hành tương tự xác định hàm lượng saponins, khác ta thay dịch chiết dung dịch escin nổng độ khác Tiến hành đo máy đo quang phổ bước sóng 560 nm, ta thu đường chuẩn sau: Nồng độ escin (ppm) 50 Lần 0.054 100 200 300 400 500 0.162 0.293 0.565 0.708 0.912 68 Lần 0.053 0.174 0.288 0.551 0.664 0.899 Lần 0.044 0.121 0.213 0.408 0.637 0.880 Trung bình 0.050 0.152 0.265 0.508 0.670 0.897 y = 0.0019x - 0.0566 R² = 0.9921 0.8 0.6 0.4 0.2 0 100 200 300 400 500 600 4.6 Xây dựng đường chuẩn DPPH Pha dung dịch DPPH gốc nồng độ 24000 µg/ml cách cân 0,003g pha 12,5 ml metanol Pha dung dịch DPPH phản ứng: 1ml DPPH 24000 µg/ml +39 ml methanol => DPPH 600 µg/ml  5ml DPPH 600 µg/ml + ml metanol => DPPH 500 µg/ml  ml DPPH 600 µg/ml + ml metanol => DPPH 400 µg/ml  ml DPPH 600 µg/ml + ml metanol => DPPH 300 µg/ml  ml DPPH 600 µg/ml + ml metanol => DPPH 200 µg/ml  ml DPPH 600 µg/ml + ml metanol => DPPH 100 µg/ml Dung dịch DPPH nồng độ đo 515 nm máy quang phổ UV-Vis, ta đường chuẩn DPPH sau: Nồng độ DPPH 600 500 400 300 200 100 lần 0.303 0.217 0.180 0.140 0.051 0.002 69 lần 0.297 0.251 0.179 0.103 0.076 0.003 lần 0.300 0.258 0.176 0.114 0.047 0.004 trung bình 0.300 0.242 0.178 0.119 0.058 0.003 0.35 0.3 y = 0.0006x - 0.0596 R² = 0.9997 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 100 200 300 400 500 600 700 4.7 Xây dựng đường chuẩn FRAP Pha dung dịch Fe2+ gốc nồng độ 100 µg/ml cách cân 0,009g Fe2+ pha 50 ml nước  2,5ml Fe2+ 100 µg/ml + 2,5 ml nước => Fe2+ 50 µg/ml  ml Fe2+ 100 µg/ml + ml nước => Fe2+ 40 µg/ml  1,5 ml Fe2+ 100 µg/ml + 3,5 ml nước => Fe2+ 30 µg/ml  ml Fe2+ 100 µg/ml + ml nước=> Fe2+ 20 µg/ml  0,5 ml Fe2+ 100 µg/ml + 4,5 ml nước => Fe2+10 µg/ml  0,5 ml Fe2+ 100 µg/ml + 9,5 ml nước => Fe2+ µg/ml Tiến hành tương tự xác định khả chống ơxy hóa FRAP, khác ta thay dịch chiết dung dịch Fe2+ nổng độ khác Tiến hành đo máy đo quang phổ bước sóng 593 nm, ta thu đường chuẩn sau: 70 Concen ABS ABS ABS Avarage STDEV 10 0.022 0.016 0.019 0.019 0.003 20 0.077 0.082 0.079 0.079 0.003 30 0.155 0.157 0.177 0.163 0.012 40 0.235 0.218 0.221 0.225 0.009 50 0.316 0.319 0.297 0.311 0.012 71 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SPSS 72 73 74 PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình 5.1 Chuẩn bị mẫu Hình 5.2 Chiết Xáo tam phân 75 Hình 5.4 Xác định hàm lượng Hình 5.3 Xác định hàm lượng saponins phenolics Mẫu trắng (bên phải) Mẫu trắng (bên trái) và mẫu thử (bên trái) mẫu thử (bên phải) của thí nghiệm thí nghiệm Hình 5.5 Xác định khả Hình 5.6 Xác định khả khử gốc DPPH khử gốc tự tự FRAP Mẫu trắng (bên trái) mẫu thử Mẫu thử thí Mẫu trắng (bên phải) nghiệm mẫu thử (bên trái) thí nghiệm 76 (bên phải) thí nghiệm ... phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài nghiên cứu ? ?Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất saponins khả chống ơxyhóa từ thân Xáo tam phân? ?? Mục tiêu đề tài: Xác định điều kiện tối. .. -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SÓNG CHO HỢP CHẤT SAPONINS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG ƠXY HĨA TỪ THÂN CÂY XÁO TAM PHÂN(PARAMIGNYA TRIMERA) GVHD: TS Nguyễn Văn Tặng... theo điều kiện thiết kế - Xác định hiệu chỉnh điều kiện chiết tối ưu Ý nghĩa khoa học đề tài: Đề tài tìm điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng tối ưu để thu hàm lượng saponins cao từ thân Xáo tam phân