Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết và bảo quản đến hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang (Aganonerion polymorphum)

Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết...34 2.2.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em xin gửi lời biết ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu TrườngĐại Học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa Công Nghệ thực Phẩm, Phòng Đào Tạo,Phòng Công Tác Sinh Viên cùng các đoàn thể trong Trường Đại Học Nha Trang sự

tự hào, được học tập tại trường trong những năm qua

Trong thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm nhờ sự giúp đỡ và tạo điều kiện củacác thầy cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm và các cán bộ phòng thí nghiệm mà

em đã hoàn thành xong đồ án tốt nghiệp của mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, cán bộ khoa Công NghệThực Phẩm đã giúp đỡ em

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Thế Hân và thầy Nguyễn AnhTuấn đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tận tình và động viên em trong suốt quátrình thực hiện đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và các anh chị Cao học

đã giúp đỡ, tạo điều kiện và động viên em trong thời gian qua

Em xin chân thành cám ơn!

Khánh Hòa, ngày 15 tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Văn Trường

MỤC LỤC Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích của nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa của đề tài nghiên cứu 3

4 Đối tượng nghiên cứu 3

5 Nội dung đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ LÁ GIANG 4

1.1.1 Tên gọi, hình thái 4

1.1.2 Cấu tạo của lá giang 5

1.1.3 Đặc tính sinh thái và địa điểm phân bố lá giang 6

1.1.4 Thành phần hóa học của lá giang 6

1.1.5 Ứng dụng của lá giang trong y học và đời sống hàng ngày 6

1.2 Gốc tự do và chất chống oxy hóa 8

1.2.1 Gốc tự do 8

1.2.2 Quá trình hình thành các gốc tự do 9

1.2.2.1 Chuỗi hô hấp tế bào 9

1.2.2.3 Trong hội trứng viêm 10

1.2.2.4 Trong quá trình thiếu máu cục bộ và tưới máu lại 11

1.2.2.5 Tác nhân xenobiotic 11

1.2.3 Ảnh hưởng của gốc tự do tới cơ thể 12

1.2.4 Chất chống oxy hóa 13

1.2.5 Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa 14

1.2.5.1 Các chất chống oxy hóa bậc 1: Vô hoạt các gốc tự do 14

1.2.5.2 Các chất chống oxy hóa bậc 2: Ngăn chặn sự tạo các gốc tự do 14

1.2.5.3 Tạo phức với kim loại 17

1.2.6 Một số chất chống oxy hóa 18

1.2.6.1 Acid ascorbic (Vitamin C) 18

1.2.6.2 Carotenoid 21

1.2.6.3 Polyphenol 22

1.2.6.4 Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa 24

1.3.Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 25

1.3.1 Phương pháp xác định trực tiếp hoạt tính chống oxy hóa 25

1.3.1.1 Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): 25

1.3.1.2 Phương pháp DPPH(Scavenging ability towards radicals): 25

1.3.1.3 Phương pháp ORAC(oxygen radical absorbance capacity): 26

1.3.1.4 Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): 27 1.3.1.5 Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): 27

1.3.2 Phương pháp xác định gián tiếp hoạt tính chống oxy hóa 28

1.3.2.1 Phương pháp cân khối lượng 28

1.3.2.2 Chỉ số peroxide (PV) 28

1.3.2.3 Chỉ số para-anisidine 28

1.3.2.4 Chỉ số acid thiobarbituric (TBA) 29

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá rình chiết 29

1.4.1 Lựa chon dung môi trích ly 29

1.4.2 Diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi 29

1.4.3 Độ ẩm của nguyên liệu 29

1.4.4 Nhiệt độ trích ly 30

1.4.5 Thời gian trích ly 30

CHƯƠNG 2 31

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất 31

2.1.1 Nguyên liệu lá giang 31

2.1.2 Hóa chất và thuốc thử 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Phương pháp xác định hàm ẩm (phụ lục 1) 32

2.2.2 Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang 32

2.2.3 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết 34

2.2.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang 35

2.2.5 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang 36

2.2.6 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của số lần chiết đến 38

2.2.7 Thí nghiệm ảnh hưởng của phương pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số 39

2.2.8 Thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản 41

2.3 Các phương pháp phân tích 42

2.3.1 Xác định hàm lượng polyphenol 42

2.3.2 Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH 42

2.3.3 Tổng năng lực khử 43

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 43

CHƯƠNG 3 44

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang 44

3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng 48

3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số 51

3.4 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số 56

3.5 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số 57

3.6 Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa 61

3.7 Ảnh hưởng của điều kiện và thời gian bảo quản đến hàm lượng 63

3.8 Ảnh hưởng của bộ phận trên cây lá giang tới hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa trong dịch chiết 66

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 68

4.1 KẾT LUẬN 68

4.2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 1 PL

DANH MỤ

Hình 1.1 Lá giang tươi 5

Hình 1.2 Quá trình gây hại của gốc tự do đối với màng tế bào 13

Hình 1.3 Cấu trúc của Vitamin C 19

Hình 1.4 Cấu trúc của vitamine E (α-tocopherol) 20

Hình 1.5 Một số hợp chất carotenoid 22

Hình 1.6 Phản ứng giữa DPPH và một số chất chống oxy hóa 26

Hình 1.7 Đồ thị miêu tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian 27

YHình 2.1 Quy trình xử lý và bảo quản nguyên liệu lá giang 32

Hình 2.2 Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang 33

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sự ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm 34

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá 35

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá 37

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết đến đến hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ lá 38

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của phương pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang 40

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản 41

YHình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng số củadịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống

kê p< 0,05) 45

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến tổng năng lực khử của dịch chiết từlá 46Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH củadịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống

từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p<

0,05) 55

Hình 3.10 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịchchiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê

tự do DPPH 62Hình 3.17 Ảnh hưởng của điều kiện và thời gian bảo quản tới hàm lượngpolyphenol tổng số của dịch chiết lá giang 64Hình 3.18 Ảnh hưởng của điều kiên và thời gian bảo quản tới khả năng khử gốc tự

do DPPH của dịch chiết lá giang 65Hình 3.19 Ảnh hưởng của các bộ phận trên cây lá giang tới hàm lượng polyphenoltổng số trong dịch chiết ở nhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết 66Hình 3.20 hưởng của các bộ phận trên cây lá giang tới năng lực khử của dịch chiết ởnhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết 90 phút, dung môi 50% ethanol 67Hình 3.21 Ảnh hưởng của các bộ phận trên cây lá giang tới khả năng khử gốc tự doDPPH trong dịch chiết ở nhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết 90 phút, dung môi 50%ethanol .67

DANH MỤC BẢNG Trang phụ lụcY

Bảng PL1.1 Hàm lượng nước có trong nguyên liệu 2PLBảng PL2 Đường chuẩn Gallic acid 3PLBảng PL3.1 Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang 4PLBảng PL3.2 Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang 5PLBảng PL3.3 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang 6PLBảng PL3.4 Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang 7PLBảng PL3.5 Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang 8PLBảng PL3.6 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang 8PLBảng PL3.7 Hàm lượng polyphenol của dịch chiết từ lá giang 9PLBảng PL3.8 Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang 10PLBảng PL3.9 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang 10PLBảng PL3.10 Hàm lượng polyphenol của dịch chiết từ lá giang 12PLBảng PL3.11 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang 11PLBảng PL3.12 Hàm lượng polyphenol của dịch chiết từ lá giang 12PLBảng PL3.13.Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang 12PLBảng PL3.14 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang 13PLBảng PL3.15 Hàm lượng polyphenol tổng của dich chiết lá giang 13PLBảng PL 3.16 Ảnh hưởng của điều kiện, thời gian bảo quản đến khả năng khử gốc

tự do DPPH 14PL

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

UV-VIS Ultraviolet-visible spectroscopy

TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity

TRAP Total radical-trapping antioxidant potential

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cùng với sự lo ngại của người tiêu dùng đối với những sản phẩm thực phẩm

và dược phẩm bổ sung hóa chất có nguồn gốc tổng hợp, trong những năm gần đây,nhiều nhà khoa học và nhà sản xuất đã chú ý quan tâm đến các sản phẩm có nguồngốc từ tự nhiên Polyphenol từ thực vật là nhóm hợp chất có nhiều họat tính sinhhọc quý như chống oxy hóa, chữa bệnh…Lá giang là một loài cây trồng rất phổbiến ở Việt Nam và các nước nhiệt đới Lá giang được sử dụng rộng rãi trong cácbữa ăn hàng ngày của người dân Việt Nam Trong y học dân gian cho rằng lá giang

có khả năng hỗ trợ điều trị một số bênh: sỏi thận, chữa viêm đường tiết niệu và cósỏi, chữa đau nhức xương khớp, chữa mụn nhọt [100] Tuy nhiên bằng chứng khoahọc về khả năng điều trị những bệnh này còn rất hạn chế…Theo nghiên cứu củaSakong tiến hành trên đối tượng lá giang thu thập ở Thái Lan thì hàm lượngpolyphenol và vitamin C trong lá giang chứa một lượng rất lớn (polyphenol: 647.05

± 5.87mg GAE/100g NL khô, 6.92 ± 0.2 mg GAE/100g NL khô) [103], đây lànhững hợp chất quý và đóng vai trò quan trọng vào quá trình chống oxy hóa

Cho đến nay chưa có công trình nào công bố về khả năng chống oxy hóa của

lá giang trồng tại Việt Nam Mặc dù về khoa học, lá giang có dược tính cao và đãđược dùng như một cây thuốc phổ biến ở một số nước như Thái Lan, Lào…Tuynhiên ở nước ta loại cây này chỉ mới được sử dụng làm gia vị [103] Trên thế giớihiện chỉ có một vài nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của lá giang được nghiêncứu Mặc dù vậy những nghiên cứu này được thực hiện trên đối tượng nguyên liệu

ở nước ngoài, ví dụ như nghiên cứu ở Thái Lan của Pornkamon Sakong và cộng sựmới chỉ dừng lại ở việc tìm hiểu thành phần của lá giang, hàm lượng polyphenol vàvitamin C ở một điều kiện tách chiết: 70% ethanol, 300C trong thời gian 5 phút,trong khi đó mỗi loài thực vật thì thành phần các chất trong nó phụ thuộc nhiều vàođiều kiện khí hậu, giống, đất đai…Trong y học dân gian, và đặc biệt là luận án tiếnsĩ: Nghiên cứu về thực vật hóa học và một số tác dụng sinh học của cây lá giang (Lê

Thế Chính - Đại học Dược Hà Nội) [102] đã cho chúng ta cái nhìn khái quát hơn vềloài cây này ở nước ta Các ứng dụng về việc sử dụng các hoạt chất sinh học từ lágiang để đưa vào trong sản xuất và đời sống còn hạn chế [100] Trong khi đó, ngàynay việc ứng dụng các hoạt chất sinh học và sản xuất và bảo quản thực phẩm, cũngnhư phục vụ cho y học đang là nhu cầu cấp thiết và có triển vọng cao Là hướng đimang lại nhiều hiệu quả Lá giang có khả năng ứng dụng cao, mang lại thu nhập chongười dân nếu biết cách tận dụng nguồn cây leo này.

Xuất phát từ những vấn đề trên cùng với sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Thế

Hân và thầy Nguyễn Anh Tuấn, em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết và bảo quản đến hàm lượng polyphenol và khả năng chống

oxy hóa của dịch chiết từ lá giang (Aganonerion polymorphum)”, nghiên cứu này

đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi chiết, điều kiện chiết đến hàm lượngpolyphenol và khả năng chống oxy hóa của lá giang thu hoạch ở Khánh Hòa.Nghiên cứu này cũng so sánh hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóacủa lá và thân cây giang Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy sự thay đổi của hàmlượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa trong các điều kiện bảo quản khácnhau

2 Mục đích của nghiên cứu.

- Tìm ra được điều kiện chiết thích hợp (nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ

lệ dung môi/nguyên liệu…) để thu được dịch chiết từ lá giang có hàm lượngpolyphenol và khả năng chống oxy hóa cao

- Đánh giá được hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa củadịch chiết lá giang thu hái tại Khánh Hóa

- Đánh giá được sự thay đổi của hàm lượng polyphenol tổng số và khả năngchống oxy hóa của dịch chiết lá giang trong thời gian bảo quản

- Đánh giá được hàm lượng polyphenol trên các bộ phận lá và thân cây lá giang

để tiến hành tách chiết có hiệu quả

3 Ý nghĩa của đề tài nghiên cứu

Ý nghĩa khoa học:

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để khẳng định một số hoạt tính

y dược từ thực vật nói chung và cây lá giang nói riêng

- Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn trong việc tách chiết cáchợp chất chống oxy hóa từ thực vật

- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp một số dữ liệu khoa học về lá giang

- Tìm ra hướng đi mới cho việc trồng và sử dụng lá giang một cách hiệu quả

4 Đối tượng nghiên cứu

Lá giang, tên gọi khác: Cây giang chua, dây dang, tên khoa học: Aganonerion polymorphum Pierre, 1906, tên tiếng Anh: Sour-soup creeper, River-leaf creeper Ở

Việt Nam, cây lá giang mọc ở nhiều nơi thuộc các tỉnh miền Trung và vùng đồngbằng sông Cửu Long Ở Nam Bộ, cây lá giang thường mọc hoang ven sông rạch,trong vườn cây, được dùng làm rau và làm thuốc Hiện nay, cây lá giang được trồnglàm nguồn rau sạch đặc sản ở một số hộ nông dân Người dân Nam Bộ dùng lágiang nấu canh chua, chế biến nhiều món ăn bổ dưỡng như xào với thịt gà, cá nướcngọt, thịt bò Canh chua lá giang là một món ăn ngon, bổ.[100]

Lá giang được thu hái tại các vùng quê, đồi núi xung quanh khu vực thành phốNha Trang (Diên Khánh, Khánh Vĩnh )

5 Nội dung đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết (ethanol trong nước) đến hàm lượngpolyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số vàkhả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số vàkhả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang

- Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số vàkhả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang

- Nghiên cứu ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số vàkhả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện và thời gian bảo quản đến hàm lượngpolyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang

- So sánh hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của lá và thân lágiang

Trong quá trình thực hiện đề tài này mặc dù em đã cố gắng tìm tòi và học hỏi,

do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, nên đề tài không tránhkhỏi những thiếu sót, kính mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô, các chuyêngia và các sinh viên để đề tài có thể được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô và các bạn!

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ LÁ GIANG

1.1.1 Tên gọi, hình thái

Về tên gọi

Lá giang, tên gọi khác: cây giang chua, dây dang, tên khoa học: Aganonerion polymorphum Pierre, 1906, tên tiếng Anh: Sour-soup creeper, River-leaf creeper.

Hình 1.1 Lá giang tươi

1.1.2 Cấu tạo của lá giang

Lá giang có cấu tạo tương đối đơn giản Gồm rễ, thân, lá và hoa quả, là thândây leo nằm hoặc bám vào các cây bụi khác

1.1.3 Đặc tính sinh thái và địa điểm phân bố lá giang

Ở Việt Nam, cây lá giang mọc ở nhiều nơi thuộc các tỉnh miền Trung và vùngđồng bằng sông Cửu Long Ở Nam Bộ, cây lá giang thường mọc hoang ven sôngrạch, trong vườn cây, được dùng làm rau và làm thuốc Hiện nay, cây lá giang đượctrồng làm nguồn rau sạch đặc sản ở một số hộ nông dân Người dân Nam Bộ dùng

lá giang nấu canh chua, chế biến nhiều món ăn bổ dưỡng như xào với thịt gà, cánước ngọt, thịt bò Canh chua lá giang là một món ăn ngon, bổ

1.1.4 Thành phần hóa học của lá giang

Thành phần hóa học của lá giang phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, vị tríđịa lý, môi trường sinh sống

Theo nghiên cứu của viện dữ liệu thực vật Việt Nam:

Thành phần dinh dưỡng trong 100g lá giang tươi [101]:

Thành phần Protein (g) Glucid (g) Carotein

(mg)

Vitamin C(mg)

Nước (g)

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lá giang tươi

1.1.5 Ứng dụng của lá giang trong y học và đời sống hàng ngày.

Lá giang đã được sử dụng làm thức ăn cho người và động vật từ rất lâu Ngàynay, lá giang là một phần trong bữa ăn như sử dụng lá giang làm các món như canhchua lá giang, cá cơm xào lá giang…

Trong y học dân gian: Lá giang là loại rau này có tác dụng giải nhiệt tốt Cóthể giã nát, lấy nước uống Có nơi dùng lá của cây này giã lẫn với lá khoai lang, chếnước uống chữa ngộ độc sắn (mì)

Cây lá giang là cây thuốc dân gian, dùng chữa chứng ăn uống không tiêu,bụng đầy trướng, đau dạ dày, đau nhức xương khớp Cây lá giang dùng ngoài chữamụn nhọt, lở ngứa ngoài da; dùng làm thực phẩm có vị chua khi chế biến các món

ăn (cá, thịt)

Thân lá giang làm thuốc chữa sỏi tiết niệu, viêm đường tiết niệu, viêm thậnmạn tính Đặc biệt, nó còn có tác dụng chữa viêm ruột, phong thấp, sưng tấy Vềmặt sinh học, cao lỏng lá giang được chiết xuất không thấy độc tính, có tác dụng ứcchế 9 loại vi khuẩn, tiêu viêm cấp tính cả khi uống và tiêm Bộ phận dùng làm thuốc

là thân, rễ và lá

- Lá giang chữa viêm đường tiết niệu và có sỏi: Thân hoặc lá giang 100-200 g,sắc uống nhiều lần trong ngày (theo y học cổ truyền Việt Nam) Hoặc thân lá giang10-20 g, hãm uống thay trà

- Lá giang chữa ăn không tiêu, bụng trướng đầy: Lá giang 30-50 g, sắc uống.Đơn thuốc này uống liên tục chữa được sỏi và viêm đường tiết niệu

- Lá giang chữa đau nhức xương khớp, đau dạ dày: Rễ hoặc lá 20-40 g, sắcuống, thường kết hợp với một số vị thuốc trị đau khác

- Chữa mụn nhọt, lở ngứa ngoài da, vết thương: Lá tươi rửa sạch, giã nát, đắplên vết thương

- Cá chuồn nấu lá giang (công dụng bổ hư tổn, khu phong trừ thấp, cường kiệncân cốt; phòng chữa viêm đường tiết niệu với các triệu chứng đái dắt, đái buốt): Cáchuồn 3-5 con, lá giang 100 g Cá chuồn bỏ vảy, chặt vây, cắt làm 2-3 khúc; lágiang rửa sạch, vò giập Nước đun sôi, cho cá vào, sau đó cho lá giang và bột canh

(muối, bột ngọt), có thể thêm nắm gạo làm tăng phần đậm đặc của nồi canh Khibắc ra, cho thêm trái ớt đập giập.

- Chữa viêm bàng quang bằng canh gà lá giang (công dụng thanh nhiệt giảiđộc dùng cho các trường hợp lao thương khí huyết, phong hàn thấp tí; sản hậu bănghuyết, huyết trắng, hội chứng lỵ xuất huyết, trĩ xuất huyết, suy nhược cơ thể): Gà

600 g, lá giang 100 g, gia vị vừa đủ Gà rửa sạch, để ráo chặt miếng; lá giang bánh

tẻ rửa sạch Cho thịt gà cùng 1 lít nước, đun sôi, vớt bọt, thêm mắm và gia vị vừa

ăn Khi thịt gà chín mềm, cho lá giang đã vò nát vào, đun sôi; trước khi bắc ra thêm

ít rau thơm vừa ăn

Không chỉ được biết đến với công dụng dùng làm gia vị quen thuộc cho cácmón ăn món lẩu, canh chua, lá giang còn được biết đến với tác dụng chữa đượcnhiều căn bệnh, đặc biệt là các bệnh về đường tiết niệu, bệnh sỏi thận Điều này làhoàn toàn có thể và đã được nghiên cứu, chứng minh Người bệnh sỏi thận có thể ápdụng bài thuốc từ cây lá giang để trị bệnh cùng với các phương pháp điều trị chính

có tác dụng nhanh chóng loại bỏ sỏi thận ra khỏi cơ thể

Loại lá này trong dân gian còn được gọi là lá vang, tên khoa học của nó làEcdysanthera rosea, thuộc họ trúc đào, mọc hoang ở vùng đồi núi, bìa rừng Với vaitrò dùng làm thực phẩm và thuốc chữa bệnh, hiện nay lá giang có mặt phổ biến vàtrở nên quen thuộc trong cuộc sống hàng ngày

Theo Đông y, lá giang có vị chua, tính bình, không độc, có tính năng thanhnhiệt, giải độc, lợi tiểu, kháng viêm diệt khuẩn, giảm đau… Đặc biệt, nó còn có tácdụng chữa viêm đường tiết niệu, có sỏi, viêm thận mạn tính, viêm ruột, phong thấp,sưng tấy…

Về mặt sinh học, lá giang không có độc tính, có tác dụng ức chế 9 loại vikhuẩn có nhiều saponin, flavonoid, sterol, coumarin, tamin, chất béo, axit hữu cơ và

12 nguyên tố vi lượng có tác dụng chữa viêm đường tiết niệu, có sỏi, viêm thận mạntính… Các nghiên cứu, thử nghiệm về tác dụng làm tan sỏi thận của lá giang cũngcho kết quả quan giúp khẳng định loại lá này có tác dụng làm giảm các cơn đau,

triệu chứng bệnh sỏi thận và đặc biệt những người bệnh thử nghiệm theo cách nàycũng nhận thấy sỏi thận đã được đào thải ra ngoài qua đường nước tiểu[100], [102].

1.2 Gốc tự do và chất chống oxy hóa

1.2.1 Gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp ngoàicùng chứa các điện tử không ghép cặp (điện tử đơn độc) Chúng có thể mang điệntích âm hoặc không mang điện và có khả năng phản ứng cao Vì vậy, gốc tự dothường bất ổn cả về năng lượng cũng như động học Nó có khuynh hướng đạt tới sự

ổn định, thời gian tồn tại rất ngắn, hoạt tính rất mạnh Quá trình sinh gốc tự do làmột quá trình chuyển hóa bình thường của cơ thể [16], [30], [84]

Gốc tự do có xu hướng mất điện tử để trở thành gốc khử hoặc nhận điện tử để trởthành gốc oxy hóa Gốc tự do không ghép cặp nên dễ dàng tấn công vào các phân tửtạo ra các phân tử mới, gốc tự do mới và gây ra phản ứng dây chuyền Các gốc tự dochủ yếu là các dạng oxy hóa hoạt động được hình thành qua chuỗi hô hấp tế bào, trongquà trình peroxy háo lipid của các acid béo chưa bão hòa [3], [16], [30]

1.2.2 Quá trình hình thành các gốc tự do

Các gốc tự do trong cơ thể được tạo ra thường xuyên qua chuỗi hô hấp tế bào,tác nhân phóng xạ, hội trứng viêm, trong hiện tượng thiếu máu cục bộ - tưới máulại, các tác nhân xenobiotic và một số tác nhân khác

1.2.2.1 Chuỗi hô hấp tế bào

Hô hấp được thực hiện trong ty thể, bao gồm các phản ứng oxy hóa khử oxy

để sinh ra nước và năng lượng dưới dạng ATP (phản ứng oxy hóa khử là quá trìnhcho và nhận điện tử, do vậy sản sinh ra các gốc), O2 mà chúng ta hít thở nhận mộtđiện tử ở bước đầu tiên tạo ra O-

2 được xúc tác bởi enzyme SOD, chuyển thành H2O2theo cơ chế tự oxy hóa khử

2 không đến được màng tếbào, vượt ra màng tế bào do vậy dịch ngoại bào hầu như không có O-

2[32], [81]

H2O2 thường xuyên sinh ra do sự phân hủy O

-2, nồng độ H2O2 (10-8mol/L) và

O

-2 (10-12mol/L) trong tế bào tương đối ổn định Tuy nồng độ thấp như vậy, nhưng

sự tồn tại đồng thời của chúng trong môi trường sinh học là rất nguy hại Phản ứnggiữa chúng sinh ra những sản phẩm 1O2 cũng rất nguy hại, gốc ᵒOH với hoạt tínhcao, có khả năng phá hủy những cấu trúc hữu cơ bền vững nhất của cơ thể và gây racác quá trình bệnh lý

Khi không có mặt cuat ion Fe2+, Cu2+ thì phản ứng này xảy ra chậm, gọi làphản ứng Harber-Weiss

O

-2 + H2O2 HOᵒ + HO- + O

-2 Khi có mặt của các ion Fe2+, Cu2+ thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh (phảnứng Fenton) Hai tiểu phân O-

2 và H2O2 không độc có thể tạo ra 1O2, ᵒOH coa khảnăng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxide và

từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào

2 O

-2 + 2H+ HOᵒ + HO- + Fe3+

Gốc ᵒOH có khả năng phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc

độ khuếch tán, vì vậy nó thường phản ứng trước khi khuếch tán với những nơi cókhả năng gây tổn thương lớn, nhưng chỉ gây tổn thương trong phạm vị bán kính [2],[16], [32], [91]

1.2.2.2 Tác nhân phóng xạ

Các tia phóng xạ hoặc bức xạ có năng lượng cao, có khả năng bẻ gãy một phân

tử tạo ra 2 hay nhiều gốc tự do Trong cơ thể chúng ta chiếm phần lớn là nước, do

vậy khi các bức xạ có năng lược cao tác động trên cơ thể, sẽ phân hủy nước tạothành các phân tử khác và sản sinh gốc tự do [2], [76].

1.2.2.3 Trong hội trứng viêm

Theo Almagor và cộng sự, 1984 [25], hội trứng viêm là một phản ứng tự vệ của

cơ thể khi có các tác nhân lạ xâm nhập vào cơ thể Khi các tác nhân (là các khángnguyên) xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bắt giữ, đồng thời lạikích hoạt bạch cầu đa nhân trung tính tăng tiêu thụ oxy, kích thích eym của màng tếbào là NADPH-oxidase, từ đó gây phản ứng xúc tác bởi enzyme này, kết quả cuốicùng là tạo ra O-

2 Nếu số lượng gốc tự do sinh ra quá nhiều sẽ gây nên một tỷ lệ bạchcầu bị chết, giải phóng các gốc ROS ra ngoài gây nên hiện tượng viêm

1.2.2.4 Trong quá trình thiếu máu cục bộ và tưới máu lại

Khi thiếu máu cục bộ do long mạch máu bị hẹp hoặc có cục máu đông, cácchất xanthine được tích lũy do tăng thoái hóa ATP và xanthine oxidase được hoạthóa Khi có sự tưới máu trở lại, với sự có mặt của oxy, xanthine oxidase xúc tácphản ứng chuyển điện tử từ hypoxanthine và xanthine sang O2 và phản ứng oxy hóaxảy ra rất mạnh, một lượng lớn gốc O-

2 hình thành lại chuyển thành H2O2, ᵒOH và

có thể gắn thêm nhóm –OH, -NH2, =SH, -COOH… tạo thành các chất dễ tan trongnước và tiếp tục liên hiệp với các chất, đào thải ra khỏi cơ thể

2H+

Trong quá trình chuyển hóa các chất xenobiotic, tạo ra các dạng ROS như O

-2,

1O2… có độc tính cao và gây ra tình trạng stress oxy hóa Các chất chống oxy hóatrong cơ thể như SOD, catalase, protein có nhóm SH, ceruloplasmin trong hồng cầu

và gan nhạy cảm với các xenobiotic Do vậy, khi có các xenobiotic xâm nhập vào

cơ thể, các chất chống oxy hóa này sẽ thay đổi theo hướng chống lại các tác nhân đó[54], [84]

1.2.2.6 Một số tác nhân khác

Trong một số bện lý bện đái tháo đường, xơ vữa động mạch, bệnh lý nhãn khoa,lão hóa, bệnh Parkinson và Alzheimer… cũng tăng cao các dạng ROS [11], [16]

1.2.3 Ảnh hưởng của gốc tự do tới cơ thể

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mớisinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Ở tuốitrung niên cơ thể mạnh trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao sức yếu gốc tự dolấn áp gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ Nếu không kịp kiểm soát, kiềmchế gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suyyếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộphận người cao niên

Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăngtrưởng, tu bổ, rồi chết Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có nhữngvết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp cácphân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào Nó gây đột biến gen ởnhiễm thể, ở DNA, RNA Nó làm chất collagen, Elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến

da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây:Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã vàtiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vở nguồncung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kíchthích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được

Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tửvong Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô tế bào Theo bác sĩDenham Harman, các gốc tự do là một trong những nguyên nhân gây ra sự hóa già

và sự chết của các sinh vật Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổnthương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nênbất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng

Do quan sát, người ta thấy gốc tự do ít ở các sinh vật chết non, có nhiều ở sinhvật sống lâu Người cao tuổi có nhiều gốc tự do hơn là khi người đó còn trẻ

Cơ chế gốc tự do gây bệnh ung thư

- Gây tổn thương AND, gây đột biến phân tử, tế bào

- Kích hoạt gen gây ung thư, còn gọi là oncogenne

- Ức chế hệ miễn dịch làm hệ miễn dịch của cơ thể suy yếu dẫn đến một loạtbệnh nguy hiểm như: HIV/AIDS, viêm gan virut B, C [12]

Hình 1.2 Quá trình gây hại của gốc tự do đối với màng tế bào

1.2.4 Chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cảnhoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể

(Jovanovic và Simic, 2000 [59]; Lachaman và cộng sự, 2000 [63]; Singh và Rajini,

2004 [87]), có thể bảo vệ con người khỏi các bệnh nghiêm trọng như khối u ác tính,rối loạn tim mạch, đái tháo đường, viêm và các bệnh thoái hóa thần kinh Dựa trênnguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại; các chấtchống oxy hóa bậc I và các chất chống oxy hóa bậc II Các chất chống oxy hóa bậc

I khử hoặc kết hợp với các gốc tự do, do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dâytruyền phản ứng của quá trình oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc II kìm hãm sựtạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt

sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; vô hoạt hóa đơn) (Singh và Rajini, 2004 [87])

Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hainguồn: Bên trong và bên ngoài Các chất chống oxy hóa bên trong bao gồm protein(ferritine, transferrine, albumine, protein sốc nhiệt) và các enzyme chống oxy hóa(superoxyde dismutase, glutathione peroxydase, catalase) Các chất chống oxy hóabên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn bao gồmvitamine E, vitamine C, các carotenoid và các hợp chất phenoic (Niki và cộng sự,

1995 [76]) Các chất này có nhiều trong rau quả là con đường đơn giản và hữu hiệunhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh

có nguồn gốc stress oxy hóa

1.2.5 Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa

1.2.5.1 Các chất chống oxy hóa bậc 1: Vô hoạt các gốc tự do

Khử các gốc tự do:

L* + AH LH + A*

LOO* + AH LOOH + A*

LO* +AH LOH + A*Tạo hợp chất với các gốc tự do:

A* + LOO* LOOA

A* + LO* LOA

1.2.5.2 Các chất chống oxy hóa bậc 2: Ngăn chặn sự tạo các gốc tự do

Superoxid dismutase

Superoxid dismutase (SOD) là enzyme chống oxy hóa có chứa kim loại thuộcloại oxidoreductase, nó xúc tác cho phản ứng chuyển hóa superoxid O2 và H2O2:

Me3+ + O−2 Me2+ + O2

Me2+ + O−2 + 2H+ Me3+ + H2O2Đầu tiên Me3+ bị khử bằng cách nhận một điện tử của gốc O−2 và trở thànhdạng oxy hóa Me2+, còn O−2 chuyển thành O2 Khi đó Me2+ tiếp tục tương tác vớimột gốc O2− và nhường điện tử cho nó, với sự có mặt của H+ chúng kết hợp vớinhau để tạo thành H2O2 Qúa trình này tiếp tục lặp đi, lặp lại tạo nên một chu trìnhphản ứng khép kín Chu trình bán hủy của SOD từ vài phút đến vài giờ, nó phụthuộc vào nhóm SOD khác nhau SOD không qua được màng tế bào nên chỉ có tácdụng cải thiện khả năng chống oxy hóa nội bào [16], [32]

Catalase (CAT)

Catalase là enzym xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 và chỉ hoạt động khi H2O2

ở nồng độ cao (lớn hơn 10-8 mmol/L), catalase không phân hủy được peroxide hữu

cơ và H2O2 ở nồng độ thấp vì chúng chỉ được hoạt hóa khi H2O2 ở nồng độ cao

H2O2Catalase    H2O + ½ O2

Catalase có mặt trong hầu hết các tế bào và các mô động vật nhưng hoạt tínhmạnh nhất là ở gan và thận, ít nhất là ở mô, catalase có chủ yếu trong các ty thể vàperoxisome [12], [39], [88], [138].

Peroxidase

Peroxidase là một nhóm enzym xúc tác các phản ứng oxy hóa khử, thuộc lớpoxidoreductase, xúc tác cho phản ứng sau

AH2 + H2O2peroxidase A + 2H2ONhững gốc O−2 được sinh ra từ O2 trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SODphân hủy, nhưng lại tạo ra nhiểu H2O2 Vì vậy việc loại bỏ H2O2 là rất cần thiết, đảmbảo hoạt động nội bào diễn ra bình thường Peroxidase sử dụng H2O2 như là mộtchất nhận điện tử xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hóa khử khác nhau, khi đó H2O2

Glutathione peroxidae (GPx)

GPx là eym xúc tác cho phản ứng loại bỏ các peroxid, hoạt động ở các mô vàhồng cầu khi nồng độ H2O2 thấp.

Glutathione có bản chất là một tripeptide (L- γ-glutamyl cysteince), chính nhờ

sự liên kết γ-peptide giữa glutamic acid và cysteine đó mà glutathione được bảo vệ,tránh khởi sự phân hủy bởi amino peptidase Glutathione tồn tại ở 2 dạng; dạng khử(thiol GSH) và oxy hóa (disulfide GS-SG) Cơ chế phản ứng của glutathione thamgia vào quá trình phân giải hợp chất peroxide như sau:

Hệ thống glutathion peroxidase gồm: glutathion peroxidase, glutathionreductase, glucose-6-phosphat dehidrogenase Hoạt độ của GPx và catalase phụthuộc vào nồng độ H2O2, khi nồng độ H2O2 cao ức chế GPx và hoạt hóa catalasehoạt động và ngược lại khi nồng độ H2O2 thấp chỉ có GPx hoạt động và catalase

bị ức chế, điều này rất quan trọng vì nó tiết kiệm glutathion dạng khử cho cơ thể[3], [83]

1.2.5.3 Tạo phức với kim loại

Ion sắt và đồng xúc tác phản ứng Fenton, tạo nên hai dạng oxy hoạt động rất độchại cho cơ thể là gốc hydroxyl (•OH) và oxy đơn bội Ion sắt nếu tạo được phức qua

đủ 6 liên kết phối trí thì không có khả năng xúc tác phản ứng trên nữa Một số chấttạo phức chelat với sắt có đủ 6 liên kết phối trí như:

+ Transferrin: là dạng protein vận chuyển sắt của huyết tương, ở người khỏe

mạnh chỉ cần huy động 20 - 30% lượng transferrin là đủ làm mất hoạt tính xúc táccủa sắt Trong một số trường hợp quá tải sắt (hồng cầu vỡ nhiều trong huyết tán,uống thuốc chứa sắt quá nhiều, tổn thương cơ ), huyết tương không đủ transferrin

và phản ứng Fenton xảy ra rất mạnh

+ Lactoferin: có nhiều trong dịch sữa, dịch nước mắt, nước mũi, nước bọt.

Lactoferin làm mất hoạt tính xúc tác của sắt trong các dịch trên

+ Ceruloplasmin: là một protein chứa đồng, có khả năng tạo phức với đồng và

làm mất hoạt tính xúc tác phản ứng Fenton của đồng, nó cũng oxy hóa Fe2+ thành Fe3+,ngăn cản sự tạo thành các gốc oxy hoạt động từ phản ứng Fenton [32], [58]

- Nhóm các thiol

Có cấu trúc RSH (R: gốc hydrocarbon), có tính khử mạnh Nhóm các thiol cùngvới vitamin C chuyển vitamin E từ dạng oxy hóa sang dạng khử, hồi phục chức năng,dập tắt mạch peroxy hóa lipid của vitamin E [2], [12]

Các thiol có khả năng trung hòa gốc tự do như •OH tạo ra gốc thyil

Selen là một thành phần của nhiều enzym, tạo ra các nhóm chức -S-Se,

-S-Se-S là những tâm hoạt động sinh học mạnh -S-Se-Selen là một thành phần trong GPx, có tácdụng loại bỏ gốc tự do, đặc biệt là phá hủy H2O2, dập tắt các gốc L•, LOO• của acidbéo, bảo vệ màng tế bào và ADN GPx chứa selen tập trung nhiều ở gan để phângiải các chất độc [2], [16], [84]

1.2.6 Một số chất chống oxy hóa

1.2.6.1 Acid ascorbic (Vitamin C)

Vitamin C hay Acid ascorbic là chất có khả năng vô hoạt các gốc tự do rất tốt

do nó có thể chuyển cho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của nó và khi đó nó trởthành dehydroasorbic (Pincemail & công sự, 1998 [78])

Ngoài khả năng vô hoạt trực tiếp các gốc tự do, vitamin C còn có khả nănghoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác trong cơ thể như vitamine E,carotenoid và flavonoid Khi có sự tiếp xúc giữa vitamine E và gốc tự do peroxidecủa acid béo, vitamine E chuyển điện tử của nó cho gốc tự do nhưng đồng thời nótrở thành gốc tự do tocopheryl (vitamine E ở dạng oxy hóa) Vitamine C tiến hànhkhử gốc tocopheryl thành vitamine E nguyên dạng, sẵn sàng vô hoạt các gốc tự doperoxide mới các carotenoid và các flavonoid khi vô hoạt các gốc tự do cũng đượchoàn nguyên với cơ chế tương tự bởi vitamine C điều này góp phần hạn chế sự tựkích hoạt oxy hóa (pro-oxydante) của các gốc vitaine E và flavonoid (Burke vàcộng sự, 2001 [37]; Jovanovic và Simic, 2000 [59])

Hình 1.3 Cấu trúc của Vitamin C

Vitamin C có hoạt chất chống oxy hóa khi nó làm giảm oxy hóa chất nhưhydrogen peroxide Ngoài ra, nó cũng làm giảm các ion kim loại tạo ra các gốc tự

do thông qua các phản ứng Fenton

2Fe3+ + ascorbate 2Fe2+ + dehydroascorbate2Fe2+ + 2H2O2 2OH• + 2 OH ‾

Tocopherol (Vitamin E)

Vitamin E tồn tại ở tám dạng trong tự nhiên: bốn dạng tocopherol và bốn dạngtocotrienol Cả tám dạng này đều chứa một vòng thơm và một chuỗi mạch thẳng 16carbon Các hợp chất tocotrienol khác với các tocopherol là có thêm ba nối đôi ởchuỗi mạch C thẳng Nhóm hydroxyl gắn với vòng thơm quyết định tính chống oxyhóa của vitamin E trong khi mạch C đảm bảo khả năng hòa tan trong chất béo củachúng (Huang và cộng sự, 2002 [56])

Tính chất hòa tan trong chất béo của vitamine E giúp chúng có khả năng thâmnhập sâu vào các màng sinh học vốn chứa nhiều acid béo không no và ngăn cảnchuỗi phản ứng oxy hóa lipit Các vitamine E sẽ chuyển hydro của nó cho gốc tự doperoxide Gốc tocopheryl tạo thành được khử về trạng thái ban đầu nhờ vitamine C(Niki và cộng sự, 1995 [76]; Huang và cộng sự, 2002 [55]; Pincemail, 2006 [78]).Tocopherol – OH + LOOo Tocopherol- O + LOOH

Với LOO: gốc tự do peroxide

Khả năng chống oxy hóa của vitamine E phụ thuộc vào mức độ cản trở khônggian của các nhóm methyl ở vị trí ortho đối với nhóm hydroxyl ở vòng thơm Nhómhydroxyl càng bị cản trở ít (trường hợp δ-tocopherol và δ-tocotrienol), khả năngchống oxy hóa càng cao (Huang và cộng sự, 2002[56])

Các thực phẩm nguồn gốc thực vật giàu vitamin E như: đậu xanh (4-6mg%),

xà lách (3mg%), lạc, lúa mì, ngô hạt, cà rốt… Đặc biệt vitamin E có rất nhiều ởmầm của các loại hạt: giá đỗ xanh, giá đỗ tương, mầm hạt ngô (15-25mg%), mầmlúa mỳ (25mg%)… Vitamin E cũng có trong một số thực phẩm nguồn gốc động vậtnhư: trứng gà, thịt bò, cá mè…

Hình 1.4 Cấu trúc của vitamine E (α-tocopherol) 1.2.6.2 Carotenoid

Carotenoid là các hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh vật cókhả năng quang hợp tùy thuộc vào sự có mặt hay không của nhóm hydroxyl ở cấutrúc vòng mà các carotenoid được chia thành carotene và xanthophylle Đối với conngười, các carotenoid là các chất chống oxy hóa quan trọng vì nó có mặt trongnhiều loại thực phẩm đồng thời nó có khả năng hoạt động trong môi trường chất béo

là nới rất dễ xảy ra sự oxy hóa và gây hậu quả nghiêm trọng (màng tế bào)

Cơ chế hoạt động chống oxy hóa của các carotenoid bao gồm (Sergio vàRobert, 1999 [85]; Mortensen và cộng sự, 2001 [73]; Stahl và Sies, 2003 [90]) Vôhoạt hóa đơn

Vô hoạt hóa các gốc tự do

Oxi đơn (1O2) là sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa sinh học và là một cấu tử

có mặt trong không khí (Jovanovic và Simic, 2000 [58]; Corol và cộng sự,2002[46]) Dưới tác dụng của tia cực tím A (UVA, λ = 320 – 400nm), các phân tửribofavine, flavinmononucleotid (FMN) và flavin adenine dinucleotid (FAD) hấpthụ năng lượng và lên trạng thái kích thích Các chất này chuyển năng lượng chooxy phân tử để trở lại trạng thái bình thường Oxy khi nhận năng lượng của các chấtnày trở thành oxy đơn (Krinsky, 1998 [62]) Để chuyển một phân tử oxy bìnhthường thành oxy đơn cần một năng lượng 22 kcal Phân tử oxy đơn không ở dạngnghịch từ như bình thường mà ở dạng nghịch từ Chính do vậy chúng rất dễ dàng

phản ứng với AND, lipid, các phân tử không no của màng tế bào và gây bệnh(Corol và cộng sự, 2002 [46]).

Trong số tất cả các chất chống oxy hóa tự nhiên, các carotenoid có khả năng

vô hoạt oxy đơn mạnh nhất (Krinsky, 1998 [62]) bởi một cơ chế vật lý Năng lượng

dư của oxy đơn được chuyển cho carotenoid, oxy trở về trạng thái bình thường của

nó khi carotenoid được chuyển lên trạng thái kích thích Các carotenoid này sau đóquay trở lại trạng thái bình thường của nó bằng cách phát ra môi trường năng lượng

dư thừa mà nó nhận được từ oxy đơn Khả năng vô hoạt oxy đơn của carotenoidphụ thuộc vào số liên kết đôi có trong mạch C của nó Mỗi phân tử carotenoid cókhả năng vô hoạt 1.000 phân tử oxi đơn trước khi tham gia vào các phản ứng hóahọc và bị biến đổi thành các hợp chất khác (Krinsky, 1998 [62])

1O2 + Car 3O2 + Car

3Car Car + nhiệt

Ngoài khả năng vô hoạt oxy đơn, các carotenoid còn vô hoạt các gốc tự dobằng cách kết hợp với các gốc này theo một trong các cơ chế sau (Britton, 1995[35]; Mortensen và cộng sự, 2001 [73]):

1- Chuyển điện tử : Car + ROO Car+ + ROO

-2- Chuyển hydro : Car + ROO Car + ROOH

3- Cộng hợp : Car + ROO ROOCar

Trong cơ thể, các carotenoid hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóakhác Các gốc tocopheryl được khử thành dạng hoạt động tocopherol nhờ nhậnđược hydro từ vitamine C với chất vận chuyển trung gian là carotenoid [76]; [90].Khác với polyphenol và vitamine C không được tích lũy trong cơ thể mà bịthải ra ngoài qua con đường nước tiểu, các carotenoid với đặc điểm hòa tan trongchất béo được tích lũy trong cơ thể, xâm nhập dễ dàng vào các vị trí dễ bị oxy hóacủa chúng cao hơn các chất oxy hóa hòa tan trong nước [55]

Hình 1.5 Một số hợp chất carotenoid

Polyphenol là hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng Benzen, trong

đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm Hydroxyl Dựa vào đặc trưng cấu tạo hóahọc, người ta chia các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính:[12]

 Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid Galic

 Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid Cafeic

 Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6: Catechin, Flavonoid

Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên chúng có thểtham gia phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng cộng và ngưng tụ

Polyphenol được chú ý đến bởi khả năng oxy hóa của chúng Chúng có khảnăng chuyển electron trong chuỗi hô hấp bình thường định cư trong ti thể Chúng cóđược khả năng đó là do chúng có khả năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do

đó làm mất hoạt tính xúc tác của chúng, đồng thời chúng có khả năng nhận các gốc

tự do tức là có khả năng dập tắt các quà trình tạo ra gốc tự do

Ngoài ra polyphenol còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm nhiềupolyphenol có hoạt tính vitamine P, nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi vàchuẩn hóa tính thẩm thấu của vi ti huyết quản

Hiện nay kể cả trong nước và ngoài nước nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol

có khả năng chống oxy hóa của chúng như:

- Nghiên cứu của Anesini và cộng sự (2003) [26] nghiên cứu hàm lượng

polyphenol và khả năng chống oxy hóa của trà (Camellia sinensis).

- Nghiên cứu của Chakraborty và cộng sự (2013) [39] xác định hàm lượngpolyphenol và khả năng chống oxy hóa từ rong nâu

- Nghiên cứu của Trương Thị Thương (2011) [23] xác định động thái biến đổihợp chất polyohenol và khả năng chống oxy hóa của quả sim thu hái tại Hải dương

- Nghiên cứu của Đàm Kim Nhung và cộng sự (1995) [18] nghiên cứu các

chất polyphenol ở một số cay họ cúc (Asteraceae).

1.2.6.4 Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa [1]

- Cây chè: Trong trà xanh chứa nhiều EGCG (Epigallocatechin-3-gallate) làmột trong bốn loại polyphenol bao gồm epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC),epicatechin–3-gallate (ECG), và EGCG (Epigallocatechin-3-gallate)

Trước kia, các nhà nghiên cứu không đánh giá cao EGCG, thậm chí còn chorằng nó làm giảm vị ngon của trà Sau này, với sự nghiên cứu của các nhà khoa họcNhật Bản về vai trò của trà xanh với sức khỏe, người ta mới khẳng định công dụngcủa hoạt chất này Ngày nay, EGCG được coi là một chất chống oxy hóa cực hữuhiệu, gấp 100 lần so với vitamine C và 25 lần so với vitamine E ngoài ra EGCGcòn ngăn ngừa bệnh ung thư Ngăn ngừa nguy cơ tiểu đường theo nghiên cứu mớinhất của tiến sĩ Zhuo Fu (2010), EGCG hạ thấp lượng đường trong máu ở nhữngcon chuột ăn thức ăn có bổ sung EGCG Hơn nữa, nó còn chống lại sự phá hủy tếbào –một loại tế bào đặc biệt làm nhiệm vụ sản xuất insulin

- Gấc: trong quả gấc chứa nhiều lycopen Theo tỷ lệ khối lượng nó chứa nhiềulycopen gấp 70 lần cà chua Người ta cũng phát hiện thấy nó chứa beta-carotennhiều gấp 10 lần cà rốt hoặc khoai lang

Ngoài ra, các carotenoit có mặt trong gấc liên kết với các acid béo mạch dài,tạo ra kết quả là nó có tính hoạt tính sinh học cao hơn Một nghiên cứu gần đây chothấy gấc chứa các loại protein có thể ngăn cản sự phát triển của các tế bào ung thư

Beta-carotene là một loại chất có khả năng chống oxy hóa rất cao Nó có tácdụng chống lại sự lão hóa và các bệnh lý ở phổi, tim, mạch máu, thần kinh… dotiến trình oxy hóa gây ra.

- Nho: nho xanh (hay trắng) cũng đều có chứa chất chống oxy hóa Một nghiêncứu mới đây khi nhìn vào tổng khả năng chống oxy hóa (theo như cách đo củaORAC) đã tìm thấy mức độ đáng kể của nho xanh và nho; khả năng chống oxy hóacủa nho đỏ là 2016 trong khi của nho xanh là 1789 Nho chứa một hợp chấtpolyphenol phong phú bao gồm các Flanvoratrol dược biết đến như là chất chốngoxy hóa và có đặc tính chống viêm nhiễm

- A-ti-sô: Cung cấp một lượng đáng kể chất chống oxy hóa Trong đósilymarin là chất chống oxy hóa chính, có khả năng chống bệnh ung thư da và giảmcholesterol

1.3 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa của các dịch trích từ thực vật[70]

1.3.1 Phương pháp xác định trực tiếp hoạt tính chống oxy hóa.

1.3.1.1 Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): Xác định

hoạt tính chống oxy hóa so với khả năng chống oxy hóa của Trolox [99]

Cation ABTS+[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] làmột gốc tự do bền đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấpthụ 372nm Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chốngoxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS Đo độ giảm độ hấp thụ của dung dịch ở bướcsóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóa trong sự so sánh với chấtchuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid] Trong môitrường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền hai ngày ở nhiệt độ phòng trong tối

1.3.1.2 Phương pháp DPPH(Scavenging ability towards radicals): Khả năng khử

gốc tự do DPPH [80]

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, do màu tía và có

độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bịkhử thành 2,2-Diphenyl-1-picryldrazine (DPPH-H), khi bị khử màu sắc của dung

dịch mất dần từ màu tím sang màu vàng [39], [88] do độ giảm độ hấp thụ bằng máyquang phổ (Huang và cộng sự, 2005) ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khửgốc DPPH của chất chống oxy hóa [28].

Hình 1.6 Phản ứng giữa DPPH và một số chất chống oxy hóa

Khả năng khử gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giáhoạt tính chống oxy hóa trong vitro thường sử dụng nhất trong nghiên cứu, có đến90% các nghiên cứu về chất chống oxy hóa sử dụng phép phân tích này (Joon-Kwan và Takeyuki, 2009) [10]

1.3.1.3 Phương pháp ORAC(oxygen radical absorbance capacity): xác định khả

năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động [70],[99]

phương pháp này có mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sựhiện diện của peroxy Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứngtrong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamine E) và trong hiện diện củamẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt tính Khi fluorescein bị oxy hóa,cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi Tiến hành đo cường độ phát quang này liêntục trong 35 phút sau khi them chất oxy hóa vào Khi có mặt chất chống oxy hóa, sựphân giả fluorescein sẽ chậm hơn Xây dựng đường cong biễu diễn sự phụ thuộc độgiảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán.Kêt quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu

Ưu điểm của phương pháp ORAC là xác định được có hoặc không có sự trễ phatrong mẫu chứa các chất chống oxy hóa Đây là một điều rất thuận lợi khi đo các thựcphẩm chứa cả những hợp chất chống oxy hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều.

Hình 1.7 Đồ thị miêu tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian

1.3.1.4 Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): khả

năng chống oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do [70]

Phương pháp TRAP sử dụng các gốc tự do được tạo thành từ amidinopropane) dihydrochlorinde) (AAPH) Khi AAPH vào môi trường plasma,các chất khử sẽ bị oxy hóa Quá trình oxy hóa này được đo đạt thông qua hàmlượng oxy tiêu thụ bằng một điện cực khi có mặt chất chống oxy hóa trong môitrường plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn Giá trị TRAP của mẫu thínghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dai pha lag củamẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox Kết quả tính toán

2,2-azobuis(2-là mmol trolox/kg mẫu lỏng

1.3.1.5 Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): Lực chống oxy

hóa bằng phương pháp khử sắt [70], [99]

FRAP được đánh giá bằng phươbg pháp quang phổ theo Benzie và Strain(1993)

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này là dựa trênkhả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử phức Fe3+ -TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+ -TPTZ (màu xanh) ở pHthấp Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa

có trong nguyên liệu Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 593nmtrong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butyllated HydroxyToluene)

Khi cho phức Fe3+ -TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chấtchống oxy hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+ -TPTZ cùng lúc Đây

là một hạn chế của phương pháp FRAP

1.3.2 Phương pháp xác định gián tiếp hoạt tính chống oxy hóa

1.3.2.1 Phương pháp cân khối lượng

Trong giai đoạn đầu tiên của quá trình oxy hóa, khối lượng dầu tăng liên tục

do phản ứng giữa các acid béo và oxy để hình thành nên hydroperoxide Vì vậy, cóthể đánh giá sự oxy hóa dầu bằng cách cân khối lượng của nó.[99]

1.3.2.2 Chỉ số peroxide (PV)

Chỉ số peroxide vẫn là một phương pháp đo trực tiếp sự phân hủy dầu dooxy hóa Mặc dù các hydroperoxide bị phân hủy thành một hỗn hợp các sảnphẩm bay hơi và chúng có thể phản ứng với nhau để hình thành nên cácendoperoxide, chỉ số PV vẫn là một phương pháp rất hữu ích Tuy nhiên, phươngpháp này cần kết hợp với các phương pháp khác để cung cấp nhiều thông tin hơncho tiến trình oxy hóa dầu

Phương pháp truyền thống để xác định chỉ số peroxide là phương pháp chuẩn

độ Khi có mặt KI, hydroperoxide sẽ oxy hóa iodide thành iod tự do Định phân iodtạo thành bằng thiosulphate để xác định hàm lượng hydroperroxide [99]

1.3.2.3 Chỉ số para-anisidine

Para-anisidine sẽ phản ứng với aldehyde để tạo thành một sản phẩm có cự đại hấpthụ ở bước sóng 350nm Chỉ số p-anisidine được định nghĩa là một độ hấp thu củadung dịch từ phản ứng của 1g chất béo trong 100ml isooctane với p-

anisidine(0,25% trong acid acetic băng) Sản phẩm hình thành bởi phản ứng giữa anisidine và andehyde không bão hòa (2-ankenal) hấp thụ mạnh tại bước sóng nàynên phản ánh được sự oxy hóa Mặc dù phương pháp này không phân biệt các sảnphẩm bay hơi hay không bay hơi nhưng phản ứng giữa andehyde bay hơi không bãohòa xảy ra nhiều hơn so với andehyde bay hơi bão hòa Vì vậy, chỉ số p-anisidineđược dùng để đánh giá sự hình thành các sản phẩm bậc 2 [99].

p-1.3.2.4 Chỉ số acid thiobarbituric (TBA)

Manlonaldehyde có thể hình thành từ các acid béo tự do có ít nhất 3 liên kếtđôi Nồng độ của malonadehyde có thể được tính toán thông qua phản ứng của nóvới acid thiobarbituric Phản ứng giữa hai chất này cho ra một sản phẩm màu đỏ, cócực đại hấp thụ ở bước sóng 532-535nm Tuy nhiên, phản ứng này không đặc hiệu.Thiobarbituric có thể phản ứng với các thành phần khác như 2,4 Alkadienal (2,4-decadienal), protein sản phẩm Maillard [99]

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá rình chiết

1.4.1 Lựa chon dung môi trích ly

Dung môi trích ly là dung môi hòa tan được các chất cần trích ly Cácpolyphenol là các hợp chất phân cực nên chủ yếu sử dụng các dung môi phân cựcnhư: Nước, Ethanol, Acetone, Ethyl acetate… Chủ yếu người ta dùng Ethanol.[1],[22]

1.4.2 Diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi

Cần tăng diện tích này để làm tăng hiệu quả quá trình chiết đối với nguyênliệu rắn để làm tăng diện tích này thì có thể nghiền hoặc băm nhỏ nguyên liệu Mặtkhác, nghiền hoặc băm có tác dụng làm vỡ tế bào làm thúc đẩy quá trình tiếp xúctriệt để giữa nguyên liệu và dung môi Tuy nhiên, kích thước và hình dạng củanguyên liệu làm nhỏ cũng có giới hạn Vì nếu chúng quá mịn sẽ bị lắng đọng lênlớp nguyên liệu, tắc các ống mao dẫn hoặc bị dòng dung dịch có nhiều cặn và làmphức tạp cho quá trình xử lý tiếp theo [1]

1.4.3 Độ ẩm của nguyên liệu

Độ ẩm của nguyên liệu giảm thì tốc độ trích ly tăng, vì độ ẩm tác dụng vớiprotein và các chất háo nước khác, ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâuvào trong nguyên liệu sẽ làm chậm quá trình khuếch tán [1]

1.4.4 Nhiệt độ trích ly

Theo công thức tính hệ số khếch tán của Eintein, nhiệt độ tăng thì hệ sốkhuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên.Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiệnthuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi choquá trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:

+ Đối với hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: Nhiệt độ cao sẽ gây phá hủy một

số hoạt chất như Vitamine, glycoside, alkaloid…

+ Đối với tạp: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng

của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một số tạpnhư gôm, chất nhầy… khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớtcủa dịch sẽ tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế

+ Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ tấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi

sễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và có bộ phận hồi lưu dung môi

Từ những phân tích trên tùy từng trường hợp cụ thể mà chọn lựa nhiệt độ chiếtsao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dung môi, phươngpháp chiết…) [22]

1.4.5 Thời gian trích ly

Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽđược hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tửlượng lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo…) Do đó nếu thời gian chiết ngăn sẽkhông chiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết áu dài thì dịch chiết sẽlẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại, cần lựa chọnthời gian chiết, thành phần dược liệu dung môi, phương pháp chiết… phù hợp [22]