Nghiên cứu điều kiện tách chiết dịch chiết từ lá Xạ đen (Celastrus hindsu Benth) có hoạt tính chống oxi hóa

Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của lá Xạ đen khô được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH A và tổng năng lực khử B...39 Hình 3.3.. Nội dung của đề tài

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này,

Trước hết, em xin gửi tới Ban Giám hiệu- Trường Đại Học Nha Trang, Lãnhđạo phòng Đào tạo Đại học và Lãnh đạo khoa Công nghệ thực phẩm lời cám ơn,niềm kính trọng và lòng tự hào vì được học tập tại Trường trong những năm qua

Xin gởi lòng biết ơn sâu sắc xin được gửi tới cô Vũ Lệ Quyên đã tận tìnhhướng dẫn em trong suốt thời gian làm đồ án vừa qua

Xin cảm ơn các cán bộ các phòng thí nghiệm: Công nghệ chế biến thủy sản,Công nghệ thực phẩm, phòng Hóa sinh-Vi sinh, phòng Hóa Phân Tích và phòngCông nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi , hướng dẫn cho em hoàn thành đềtài

Tiếp thep em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn công nghệchế biến thủy sản và các thầy cô trong nhà trường đã giảng dạy em trong nhữngnăm tháng qua

Và cuối cùng xin tỏ lòng biết ơn cha mẹ và gia đình đã tạo điều kiện cho emđược học tập và xin cám ơn bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong quá trình học tậpvừa qua

Sinh viên

Đoàn Hồng Thạch

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cây Xạ đen 3

1.1.1 Sự phân bố của xạ đen[22] 3 1.1.2 Đặc điểm của cây xạ đen[22] 4 1.1.3 Thành phần hóa học của xạ đen 4 1.1.4 Công dụng của xạ đen[22] 5 1.1.5 Tình hình ngiên cứu và sử dụng xạ đen tại Việt Nam 6 1.1.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây xạ đen ở nước ngoài 6 1.2 Quá trình oxy hóa và một số hợp chất chống oxy hóa hiện nay 8

1.2.1 Quá trình oxy hóa và các gốc tự do 8 1.2.1.1 Quá trình oxy hóa 8

1.2.1.2 Gốc tự do [3] 8

1.2.1.3 Ảnh hưởng của gốc tự do tới cơ thể [5] 8

1.2.2 Một số hợp chất chống oxy hóa hiện nay [2], [5]10 1.3 Một số phương pháp chiết xuất 12

1.3.1 Cơ sở của phương pháp tách chiết [5] 13 1.3.2 Chọn dung môi để chiết xuất [5] 13 1.3.3 Một số phương pháp chiết tách [1], [3] 16 1.3.3.1 Chiết bằng chất chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extrac-tion) 16 1.3.3.2.Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm 18

1.3.3.3.Phương pháp chiết hỗ trợ vi sóng 19

1.3.3.4 Chiết dưới áp suất cao 20

1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết [1] 21

1.4.1 Dung môi 21 1.4.2 Nhiệt độ chiết 22 1.4.3 Thời gian chiết xuất 23 1.4.4 Độ mịn của dược liệu 23 1.4.5 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 24 1.4.5 pH dung môi 24 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Hóa chất và thiết bị 25

2.2.1 Hóa chất 25 2.2.2 Thiết bị 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp phân tích 25 2.3.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm 25

2.3.1.2 Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH 25

2.3.1.3 Xác định tổng năng lực khử 25

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 26 2.3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

2.3.2.3 Thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp 28

2.3.2.4 Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp 30

2.3.2.5 Thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp 32

2.3.2.6 Thí nghiệm xác định tỷ lệ DM/NL chiết thích hợp 34

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Hàm lượng ẩm trong một số bộ phận của cây xạ đen 36

3.2 Hoạt tính chống oxi hóa của cây xạ đen ở các bộ phận khác nhau 36

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của dich chiết lá

xạ đen 40

3.5 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá xạ đen 42

3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá xạ đen 44

3.7 Đề xuất quy trình chiết hoạt tính chống oxy hóa lá xạ đen 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

1 KẾT LUẬN 48

2 KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hợp chất polyphenol trong một số loại trái cây 11Bảng 1.2 Bảng tính chất của một số dung môi phổ biến 14Bảng 1.3 Độ nhớt () và sức căng bề mặt () của một số dung môi thường gặp ở nhiệt độ 20oC (xếp theo thứ tự tăng dần) 22Bảng 3.1 Hàm lượng ẩm trong một số bộ phận của cây xạ đen 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hoa và lá xạ đen 4

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy 27

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp 28

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp 30

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp 32

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ chiết thích hợp 34

Hình 3.1.Hoạt tính chống oxy của dịch chiết từ lá khô, lá tươi và thân cây Xạ được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) 37

Hình 3.2 Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của lá Xạ đen khô được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) 39

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa của lá xạ đen khô được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) 41

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của lá xạ đen khô được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) 43

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL đến hoạt tính chống oxy hóa của lá xạ đen khô đươc xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) 45

Hình 3.6 Quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ lá xạ đen 47

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

TCA Axit trichloracetic

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylMĐC Mẫu đối chứng

LỜI MỞ ĐẦU

Nước ta có khí hậu và thảm thực vật khá phong phú và đa dạng Dân tộc ViệtNam có truyền thống về sử dụng các loại thảo mộc làm thuốc chữa bệnh Nhữngnăm gần đây, xu hướng tìm kiếm một số loài thảo mộc có hoạt tính sinh học ngănngừa bệnh tật ngày càng được quan tâm nhiều hơn

Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12,000loài, trong đó có trên 3,200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong y hoc dângian

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quantrọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người Ngày nay những hợp chất tự nhiên

có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiềungành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức khỏe con người Chúng đượcdùng để trị bệnh cho con người, làm thực phẩm chức năng, làm nguyên liệu chongành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm Mặc dù ngày nay các loại thuốc tâyđược sản xuất từ công nghệ tổng hợp hóa học, đã đóng góp quan trọng cho việcchữa bệnh nhưng không vì thế mà những đóng góp của dược thảo mất đi vị thế bởitính ưu việt của nó là khả năng không gây những phản ứng phụ có hại cho cơ thểcon người

Trong thế giới thưc vật muôn màu muôn vẻ, nhiều loại cây đã được sử dụngnhư những dược liệu quý Trong đó nổi bật lên là cây Xạ đen Loài cây này mọcnhiều ở Việt Nam Dân gian thường dùng cây xạ đen như một bài thuốc nam để trị

và phòng ngừa các bệnh u bứu, mụn nhọt, ung thũng, huyết áp cao Trong xạ đen cóchứa các chất như flavonoid, saponin triterpenoid , alkaloid, diphenylpropane Cácchất này có hoạt tính kháng khuẩn và chống oxi hóa, và hạn chế sự phát triển củamột số tế bào ung thư [8,9,10] Tuy nhiên, điều kiện tách chiết và tinh chế ảnhhưởng rất nhiều đến hoạt tính sinh học của những chất cần chiết Từ những phântích trên, kết hợp với những kiến thức đã học, bước đầu làm quen với công tácnghiên cứu dưới sự hướng dẫn của cô Vũ Lệ Quyên, em đã thực hiện đề tài “

Nghiên cứu điều kiện tách chiết dịch chiết từ lá Xạ đen (Celastrus hindsu Benth) có hoạt tính chống oxi hóa’’

Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hoạt tính

chống oxi hóa của dịch chiết từ cây Xạ đen trồng tại Khánh Hòa

Nội dung của đề tài

- Nghiên cứu xác định dung môi chiết thích hợp

- Nghiên cứu xác định tỉ lệ dung môi chiết và nguyên liệu thích hợp

- Nghiên cứu xác định nhiệt độ và thời gian chiết thích hợp

Ý nghĩa khoa học: Đề tài là tài liệu tham khảo về điều kiện tách chiết thích hợp

phục vụ cho công tác thu hồi dịch chiết có hoạt tính chống oxi hóa để ứng dụng đểbảo quản thực phẩm hoặc chữa bệnh

Ý nghĩa thực tiễn: Việc nghiên cứu đề tài trên quy mô phòng thí nghiệm sẽ làm cơ

sở để ứng dụng và triển khai với quy mô công nghiệp để tách chiết và tinh chế dịchchiết từ lá xạ đen ứng dụng làm thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây Xạ đen

Cây xạ đen có tên khoa học là Celastrus hindsii Trong xạ đen có chứa các chất:

Flavonoid (chất chống oxy hóa có tác dụng phòng chống ung thư),

Saponin Triterpenoid (có tác dụng kháng khuẩn); Quinone (có tác dụng làm cho tếbào ung thư hóa lỏng dễ tiêu), alkaloid, diphenylpropane (ức chế sự phát triển của 4loại tế bào ung thư khác nhau là ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư phổi vàung thư gan), Triterpene (rất tốt cho hệ tiêu hóa, tăng cường chức năng tiêu hóatrong cơ thể,ngăn ngừa các biểu hiện khó chịu, đồng thời giúp phòng chống các thểbệnh liên quan như viêm dạ dày, ung thư dạ dày, ung thư đại tràng,….) [8], [9],[10] Trong cuộc sống thì cây xạ đen được dùng để điều trị vết thương và cầm máu,ngoài ra còn có tác dụng tiêu viêm giải độc, mát gan, ăn ngủ tốt, tăng cường sức đềkháng của cơ thể

1.1.1 Sự phân bố của xạ đen[22]

Cây xạ đen được phân bố ở nhiều nước như: Trung Quốc, Việt Nam, mar, Thái Lan

Myan-Ở Trung Quốc, loại cây này thường mọc ở độ cao từ 1.000 - 1.500m Còn ởnước ta, xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Hà Nam, Quảng Ninh, Ninh Bình, HòaBình, Vườn Quốc gia Cúc Phương, Vườn Quốc gia Ba Vì, Thừa Thiên-Huế, GiaLai Đặc biệt được tìm thấy nhiều nhất ở vùng Kim Bồi tỉnh Hòa Bình và cho chấtlượng thuốc tốt nhất vì phù hợp với khí hậu nơi đây Cây mọc tự nhiên trong rừng

và rất dễ trồng

1.1.2 Đặc điểm của cây xạ đen[22]

1.1.3 Thành phần hóa học của xạ đen

Đã phát hiện trong xạ đen có Flavonoid, các polyphenol, tannin, acid amin,đường khử, cyanoglycosid, saponin triterpenoid, alkaloid, Triterpene, diphenyl-propane Trong đó, flavonoid là chất chống oxy hóa có tác dụng phòng chống ungthư, saponin triterpenoid có tác dụng chống nhiễm khuẩn, diphenylpropane (ức chế

sự phát triển của 4 loại tế bào ung thư khác nhau là ung thư vú, ung thư buồngtrứng, ung thư phổi và ung thư gan)…[8], [9], [10], [15]

1.1.4 Công dụng của xạ đen[22]

Theo Đông y: Cây xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có tác dụng hữu hiệutrong điều trị mụn nhọt, ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan

cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư Có tác dụng thông kinh lợi niệu Câydùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu, cầm máu vết thương.Điều trị, ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch, tiêu độc,thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an thần, tăng cườngsức đề kháng cho cơ thể

Ngày nay với nền y học hiện đại, đã có nhiều nghiên cứu sâu hơn về xạ đen,đặc biệt với công trình nghiên cứu của Giáo sư Lê Thế Trung Nghiên cứu này càngchứng tỏ thêm về tác dụng rất tốt của cây xạ đen, đặc biệt trong điều trị ung thư, xạđen được sử dụng trong các trường hợp sau: Dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thưvòm họng, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư cổ tử cung, u nang buồng trứng, u sơ

tử cung và các chứng bệnh ung thư khác Dùng làm thuốc ngăn ngừa u bướu, điềutrị các biến chứng do khối u và tiền ung thư Điều trị các loại bướu, u lành (Bướu

cổ, u mỡ) Dùng làm thuốc chống viêm, kháng khuẩn Tác dụng ổn định huyết áp,đặc biệt là huyết áp cao Giải độc mát gan, hạ men gan và gan nhiễm mỡ, hỗ trợđiều trị sơ gan, viêm gan B

Tuy nhiên, các nhà khoa học đã cảnh báo cho các người bệnh ung thư rằng,với tác dụng ức chế sự phát triển của khối u ác tính, cây xạ đen, với tư cách là mộtthực phẩm chức năng, chỉ có tác dụng hỗ trợ trong điều trị ung thư, hoàn toàn khôngphải là thuốc chữa khỏi căn bệnh này Tất cả các báo cáo khoa học đều khẳng định,cây xạ đen chỉ có tác dụng làm tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể, ức chế tiến triểncủa tế bào ung thư, không phải là thuốc có thể chữa khỏi ung thư Tác dụng chínhcủa cây xạ đen chính là làm hạn chế sự phát triển của các khối u trong cơ thể ngườibệnh

1.1.5 Tình hình ngiên cứu và sử dụng xạ đen tại Việt Nam

Hàng thập kỷ nay, cây xạ đen được người Việt Nam thường dung để uống vớimục đích mát gan, tiêu độc, phòng chữa các bệnh ung thư Xạ đen được người dântộc Mường và một số dân tộc khác ở miền núi thường dùng Còn người bệnh thìchưa biết nhiều đến tác dụng của cây này nên việc dùng nó còn nhiều hạn chế

GS.TSKH Lê Thế Trung - Chủ tịch Hội Ung thư TP.Hà đã tiến hành nghiêncứu tác dụng của cây này và đã chiết xuất được từ loài cây này một loại tinh thể cókhả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

Qua nghiên cứu thực nghiệm trên động vật được gây ung thư, các bác sĩ đãphát hiện ở loài cây này tác dụng hạn chế sự phát triển của khối u ác tính Hơn nữa,theo GS Trung, hợp chất lấy từ xạ đen nếu được kết hợp với chất Phylamin có thểkéo dài tuổi thọ trung bình của động vật bị ung thư hơn nhiều chất lấy từ cây trinh

nữ hoàng cung hay tỏi Thái Lan [21]

Đến cuối năm 1999, đề tài của các bác sĩ Học viện Quân y được nghiệm thu,cây xạ đen chính thức được công nhận là một trong không nhiều những vị thuốcnam có tác dụng điều trị hỗ trợ bệnh nhân ung thư

Trong những năm gần đây, người Việt Nam đã sử dụng cây xạ đen thay nướcuống hàng ngày để phòng chống ung thư, mát gan , tiêu độc

1.1.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây xạ đen ở nước ngoài

Một nghiên cứu cho thấy Triterpene là một chất có trong lá xạ đen Chất nàyđược coi là tiền thân của nhóm steroid, nhóm các chất kích thích tố ở động vật.Đồng thời với đó, thành phần các hạt triterpene hình thành nên axit ganoderic giúpgiảm nhẹ các triệu chứng di ứng, viêm nhiễm bằng cách phóng thích histamine,tăng hiệu quả trao đổi chất trong cơ thể qua sự hấp thụ oxy và tăng cường hoạt độngcủa gan Triterpene rất tốt cho hệ tiêu hóa, tăng cường chức năng tiêu hóa trong cơthể, ngăn ngừa các biểu hiện khó chịu, đồng thời giúp phòng chống các thể bệnhliên quan như viêm dạ dày, ung thư dạ dày, ung thư đại tràng…Triterpene còn cótác dụng giảm nhẹ các triệu chứng bệnh tim mạch như chống đau thắt ngực, đánhtrống ngực [ 9]

Một nghiên cứu về loài Cordia dichotoma ở Ấn Độ thuộc họ dây gối(Celastraceae) thì thấy trong vỏ cây thường làm thuốc chứa một số hóa chất baogồm allantoin, β-sitosterol và 3 ', 5-dihydroxy-4'- methoxy flavanone-7-O-alpha-L-rhamnopyranoside Trái cây và lá cây cho thấy sự hiện diện của Pyrrolizidinealkaloids, coumarin, flavonoid, saponin, terpenes và sterols Trái cây đã được xácđịnh có arabinoglucan, D-glucose (67,6%) và L-arabinose (13,2%) Lá cũng chứaquercetin và quercitrin vỏ điều tra Dịch chiết từ vỏ cây đã cho thấy khả năng

kháng khuẩn đáng kể đối với hai Vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa và hai loại vi khuẩn Gram dương Streptococcus pyogenes

và Staphylococcus aureus và cả nấm nữa [12].

Dịch chiết từ lá của C dichotoma bằng dung môi methanol được đánh giá

hoạt tính chống oxy hóa trong trong ống nghiệm mô hình viz DPPH và mô hìnhhydrogen peroxide Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa là rất tốt [12]

Các nghiên cứu từ cây Gymnosporia montana và một số loài khác của Gymnosporia như G ovata Laws, G diversifolia thuộc họ dây gối (Celatraceae)

cho thấy trong lá, thân, rễ chứa các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa như:flavonoid, triterpenoids – maitenin, triterpene quinone methides, một số alkaloidssesquiterpene pyridin như emarginatine A, B, E, F, G và một ester sesquiterpene[13]

Số hợp chất hoạt tính sinh học có hoạt tính dược lý khác nhau đã được báocáo từ các loài khác nhau của họ dây gối, ví dụ: triepoxides diterpene,quinonemethides triterpenoid (được gọi là celastroloids) có tác dụng kháng sinh vàkìm hãm phát triển tế bào ung thư Sesquiterpene pyridin alkaloids với các hoạtđộng tăng cường miễn dịch hoặc kháng u

Sự hiện diện của hai hợp chất chống ung thư cụ thể là diterpenoid epoxidetriptolide và quinine triterpene celastrol đã được tìm thấy từ dược liệu thảo mộcTripterygium Hook wilfordii Trung Quốc ( Celastraceae-họ dây gối) [13]

1.2 Quá trình oxy hóa và một số hợp chất chống oxy hóa hiện nay

1.2.1 Quá trình oxy hóa và các gốc tự do

1.2.1.1 Quá trình oxy hóa

Trong cuộc sống chúng ta thể sống thiếu khí oxy, chúng ta có thể nhịn ănnhung không thể nhịn thở được, khí oxy giúp chúng ta vận động, suy nghĩ và lànguyên liệu giúp tạo nên các quá trình, phản ứng trong cơ thể Nhưng cũng chínhchúng là nguyên nhân gây nên hiên tượng oxy hóa xảy ra trong cơ thể hóa như oxyhóa protein lipid, vitamin và sắc tố Quá trình oxy hóa này sẽ tạo ra các sản phẩmcấp thấp, các gốc tự do Thêm vào đó, stress, thói quen lạm dụng độc chất (thuốc lá,

cà phê, dược phẩm, mỹ phẩm ), dinh dưỡng sai lầm, tia tử ngoại, nhiễm khuẩn, ônhiễm môi trường là yếu tố tích cực tiếp tay cho tình trạng bội tăng chất oxy hóa.Tác nhân làm tăng cường quá trình oxy hóa chính là gốc tự do [17]

dễ tạo phản ứng Chúng luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân

tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn cho sinhhoạt bình thường của tế bào

Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, làkhoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể, với nguy cơgây ra nhũng tổn thương cho tế bào Trước đó người ta cho rằng gốc tự do này chỉ

có ngoài cơ thể

1.2.1.3 Ảnh hưởng của gốc tự do tới cơ thể [5]

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con ngườimới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục nghìn gốc tự do mỗi ngày Ởtuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc

tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ Nếu không bị kiểm soát,kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch,làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan

bộ phận người cao niên

Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dường thất thoát, tế bào không tăngtrưởng, tu bổ, rồi chết Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có nhữngvết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp cácphân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào Nó gây đột biến ở gene, ởnhiễm thể, ở DNA, RNA Nó làm chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến

da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây:Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã vàtiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồncung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kíchthích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được

Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tửvong Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào Theobác sĩ Denham Harman[24], các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra

sự hoá già và sự chết cuả các sinh vật Ông cho rằng gốc tự do phản ứng lên ty lạpthể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiếnchúng trở nên bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng

Do quan sát, người ta thấy gốc tự do có ít ở các sinh vật chết non, có nhiềuhơn ở sinh vật sống lâu Người cao tuổi có nhiều gốc tự hơn là khi người đó còn trẻ

Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkin-son, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan

Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại Đôi khi chúng cũng

có một vài hành động hữu ích Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng

lượng cho cơ thể; tạo ra chất mầu melanine cần cho thị giác; góp phần sản xuấtprostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng; tăng cường tính miễn dịch; làm dễdàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt.

Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là peroxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốcrất phản ứng và gây ra nhiều tổn thương

su-1.2.2 Một số hợp chất chống oxy hóa hiện nay [2], [5]

 Một số hợp chất tự nhiên trong thực vật

Polyphenol phân bố rộng rãi ở thực vật, có hoạt tính chống oxy hóa và đượcnghiên cứu rất nhiều Polyphenol được chia thành các nhóm chính sau: Flavonoid,acid phenolic, tannin

Flavonoid: là một trong những hợp chất phong phú và đa dạng vào bậc nhấttrong thiên nhiên , có mặt không những chỉ trong những thực vật bật cao, mà còntrong một số thực vật bật thấp, thậm chỉ còn có trong những loài tảo Hơn một nữarau quả thông thường có chứa flavonoid Chúng cũng là thành phần hay gặp trongdược liệu có nguồn gốc thực vật Đến nay, flavonoid vẫn là hợp chất được các nhàhóa học quan tâm nghiên cứu, có khoảng trên 11,000 hợp chất flavonoid đã đượcbiết về cấu trúc Flavonoid không những có gia trị về mặt cảm quan mà được khaithác sử dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm và đặc biệt trong y học.Với các nhà hóa sinh thi flavonoid là một chất chống oxy hóa lý tưởng

Acid phenolic: được chia thành hai loại dẫn xuất của acid benzoic, chẳng hạnnhư acid gallic,và các dẫn xuất của acid cinnamic, acid caffeic và các acid ferulic.Các acid cinnamiac phổ biến hơn Thực phẩm giàu acid phenolic có lợi cho sứckhỏe, chúng có khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa tổn thương tế bào do phản ứngoxy hóa các gốc tự do Acid phenolic chiếm khoảng một phần ba của hợp chất phe-nol trong chế độ ăn uống, có thể có mặt ở thực vật trong các hình thức tự do và liênkết với các thành phần khác Phenol có thể được liên kết với các thành phần thựcvạt khác nhau thông qua các liên kết este, ether Các acid hydroxybenzoic gallic, p-hydroxy, benzoic, protocatechuic, vanillic syringic acid, phổ biến cấu trúc C6-C1

Hydroxycinnamic acid là những hợp chất thơm với một chuỗi bên ba carbon C1), caffeic, ferulic, p-coumaric và các acid sinapic là phổ biến nhất.

(C6-Tannin: nhóm quan trọng thứ ba của phenolics, có thể chia thành drolysable và tannin cô đặc Ngiên cứu rộng rãi nhất là catechin Các tannin hy-drolysable là các dẫn xuất của acid gallic (3, 4, 5 trihydroxyl acid benzoic) Acidgallic este hóa polyol lõi và các nhóm alloy có thể được tiếp tục este hóa hoặc ox-idativelycrosslinked để tạo thành các tannin hydrolysable phức tạp hơn Tannin cótác dung đa dạng trên các hệ thống sinh học vì chúng là chất ion hóa kim loại, tạokết tủa với protein và chất chống oxy hóa sinh học Acid phenolic, tannin vàflavonoid thường gặp trong một số trái cây sau

hy-Bảng 1.1 Hợp chất polyphenol trong một số loại trái cây.

Hợp chất phenol Loại trái cây

Flavanone Cam, quýt, cà chua, bạc hà

flavonol Táo, quất, rau đắng, rau diếp, hành, ô liu, hạt

tiêu, cà chua

Flavone Cam, quýt, cần tây, rau mùi tây

Tannins

condensed Táo, nho, mận, măng cụt, lê, sơri

 Một số chất chống oxy hóa tự nhiên được sinh tổng hợp

Vitamin C: là chất khử trong cơ thể, đóng vai trò rất quan trọng trong việcngăn chặn quá trình sản xuất các gốc tự do, bảo vệ acid béo không no của màng tế

bào, đồng thời bảo vệ vitamin E là chất chống oxy hóa chính trong màng tế bào,ngăn chặn không cho gốc này xâm nhập các phân tử cholesterol LHD Chúng tăngcường sự bền bỉ của mao mạch, đẩy mạnh mau lành vết thương, kích thích sản xuấtkháng thể acetylcholine, ngăn chặn tác dụng có hại của oxygen.

Vitamine E: Được tìm thấy đầu tiên năm 1929 bởi Evans và Bishop là loạivitamime tan trong dầu có mặt trong nhiều loại thực phẩm đặc biệt trong các loạihạt là dầu mỡ Vitamine E được biết đến là chất chống oxy hóa mạnh có thể ngăncản tác động có hại của các chất oxy hóa sinh ra bởi quá trình chuyển hóa trong cơthể hoặc khi cơ thể bị nhiễm khuẩn Qúa trình tích lũy của các chất chuyên hóa nàylâu dần sẽ dẫn đến quá trình lão hóa trong cơ thể hoặc sẽ trở thành yếu tố nguy cơcủa các bệnh lý như: tim mạch, ung thư Vì thế việc bổ sung chất chống oxy hóangoại sinh như vitamin E sẽ góp phần chống lão hóa trong đó có lão hóa da và đẩylùi nguy cơ bệnh lý mãn tính

Beta-caroten: Được khám phá ra cách đây hơn 150 năm từ lớp màu cam của

củ cà rốt, beta-caroten hiện giờ là loại chống oxy hóa được tiêu thụ rất nhiều trên thịtrường Chất này cần cho sự tăng trưởng và cho chức năng của mô, của xương, tăngcường tính miễn dịch, giảm nguy cơ gây ung thư, giúp thị lực tốt hơn, nó có thểbiến đổi thành sinh tố A

Các chất chống oxy hóa khác gồm có: Selenium, bioflavonoid và ubiquinone cũngđược quảng cáo chống lão hóa, nhưng không phổ biến như vitamin C, E và beta-caroten

1.3 Một số phương pháp chiết xuất

Trong nhiều năm qua, các công trình liên quan đến việc chiết xuất các hợpchất phenol tự nhiên đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt Chiết xuất là một bướcrất quan trọng trong sự cô lập, xác định và sử dụng các hợp chất phenol Có rấtnhiều phương pháp chiết xuất và có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả chiết chất

1.3.1 Cơ sở của phương pháp tách chiết [5]

Phương pháp chiết là phương pháp thu lấy một hay nhiều chất từ hỗn hợp đãtách biệt, cô lập và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng

Quá trình chiết gồm hai giai đoạn như sau:

Giai đoạn 1: dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu, sau đó thấm sâu vàobên trong do quá trình thẩm thấu tạo ra dung dịch chứa các hoạt chất Sau đó dungmôi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí chiếm đầy trongcác khe vách trống của tế bào

Giai đoạn 2: Giai đoạn tiếp tục hòa tan các hoạt chất trong các ống mao dẫncủa nguyên liệu nhờ vào dung môi đã thấm sâu vào các lớp bên trong

1.3.2 Chọn dung môi để chiết xuất [5]

Dung môi dùng để chiết các hợp chất ra khỏi nguyên liệu rất đa dạng và thayđổi tùy theo bản chất của mỗi loại nguyên liệu Cơ sở để lựa chọn một dung môichiết xuất là tính phân cực của hợp chất tự nhiên chứa trong nguyên liệu và củadung môi

Dung môi có thể chia thành hai loại: phân cực và không phân cực, độ phâncực được tính bằng hằng số điện môi, hằng số điện môi của dung môi phản ánh sơ

bộ tính phân cực của dung môi Tính phân cực mạnh của nước được lấy làm chuẩn,

ở 20°C, hằng số điện môi là 80

Bảng 1.2 Bảng tính chất của một số dung môi phổ biến

trong chiết xuất hợp chất tự nhiênDung môi Công thức hóa học Điểm sôi Hằng số điện

môi

 Chất tan trong nước và dung môi phân cực

Các chất điện ly như các muối vô cơ đều tan trong dung môi phân cực Chấtphân cực: Các hợp chất hữu cơ nói chung không ion hóa nhưng nếu chúng có chứacác nhóm hoặc nguyên tử mang điện ân có thể hình thành dãy nối hydro với phân tửnước thì chúng sẽ tan được trong nước Những nhóm có khả năng tạo dãy nối hydronhư: - OH, CO, NO, NH2, và các halogen gọi là nhóm phân cực Càng có nhiềunhóm phân cực thì phân tử ấy càng dễ hòa tan trong nước Nhưng nếu mạch hydrocacbon của phân tử càng dài thì độ hòa tan càng giảm

Thực nghiệm cho thấy, một nhóm phân cực trong phân tử có khả năng hình thànhliên kết hydro với phân tử H2O sẽ làm cho phân tử ấy tan được trong nước nếu số

cacbon của mạch không quá 5 hoặc 6 nếu phân tử có thêm mạch nhánh Nếu phân

tử có nhiều nhóm phân cực (2 nhóm trở lên) thì tỷ lệ này giảm xuống Một nhómphân cực cho 3 hoặc 4 cacbon trong mạch thì phân tử ấy tan được trong nước

 Chất tan trong ete và dung môi không phân cực

Các hợp chất hữu cơ không chứa nhóm phân cực gọi là các chất không phâncực Nói chung chất không phân cực đều tan trong ete và dung môi không phân cực.Đồng thời chúng không tan trong nước và các dung môi phân cực khác Các chất

mà phân tử chỉ có một nhóm phân cực yếu cũng có thể tan trong ete Hầu hết cácchất hữu cơ tan trong nước thì đều không tan trong ete Nếu chất vừa tan trong nướcvừa tan trong ete thì chất đó phải là chất không ion hóa, có số cacbon không quá 5,

có một nhóm phân cực tạo dây nối hydro nhưng không phải là nhóm phân cựcmạnh

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của nhóm hợp chất ta có thể đoán sự

có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết

+ Trong phân đoạn chiết ete và ete dầu sẽ có các hydro cacbon béo hoặc thơm,các thành phần của tinh dầu như monotecpen, các chất không phân cực như chấtbéo, carotene, các sterol, các chất màu thực vật và chlorophyl

+ Trong dịch chiết chloroform sẽ có mặt sesquitecpen, ditecpen, cumarin,quinol, các aglycol do glucid thủy phân tạo ra, một số ancaloid bazo yếu

+ Trong dịch chiết cồn sẽ có mặt glucozit, ancaloid, flavonol, các hợp chấtphenol khác, nhựa, acid hữu cơ, tannin

+ Trong dịch chiết nước sẽ có các glucozit, tannin, đường, các hợp chấtcacbonhydrat phân tử như: pectin, nhầy, gôm, các protein thực vật và muối vô cơ

 Yêu cầu về dung môi trong quá trình chiết xuất

Dung môi dùng cho quá trình chiết phải được lựa chọn cẩn thận và đảm bảo các yêucầu sau:

+ Dung môi hòa tan chất đang nghiên cứu

+ Dễ dàng được tách ra khỏi dịch chiết

+ Có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu)

+ Không độc, không dễ bốc cháy

+ Có độ nhớt kém để không làm cản trở quá trình khuếch tán

+ Các dung môi cần có độ tinh khiết nhất định để không là ảnh hưởng đếnhiệu quả và chất lượng của dịch chiết

Trong thực tế một số dung môi bán trên thị trường thường có lẫn một số chấtdẻo như các diankylphtalat, tri-n- butyl acetylcitrat và tributylphosphat Các chất lẫnnày có thể là do quá trình sản xuất và bảo quản Methanol và chloroformm thườngchứa dioctylphtalat, di-2-etylhexyl phalat Các chất này làm sai lệch kết quả phânlập trong quá trình nghiên cứu

1.3.3 Một số phương pháp chiết tách [1], [3]

1.3.3.1 Chiết bằng chất chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction)

Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE) có thể là một phương pháp mang lạilợi ích thay thế cho các phương pháp chiết thông thường sử dụng dung môi hữu cơ:phương pháp SFE xảy ra nhanh chóng, tự động, có chọn lọc, không gây cháy nổ vàtránh việc sử dụng một số lượng lớn các dung môi độc hại

Siêu chất lỏng dễ dàng tách chất cần chiết do dung môi thay đổi thuộc tínhnhanh chóng chỉ với các biến đổi áp lực nhẹ Chất lỏng siêu tới hạn (SCFs) đangngày càng thay thế dung môi hữu cơ như n-hexane, dichloromethane, chloroform,

và những dung môi khác thường được sử dụng trong chiết công nghiệp, lọc, vì quyđịnh và sức ép môi trường về các hợp chất hữu cơ và khí thải

Cho đến nay dung dịch quan trọng được sử dụng nhất là carbon dioxide siêu

tới hạn (SC-CO2), do thân thiện với với môi trường, độc tính thấp, và khả năngtương thích với chế biến thực phẩm Hơn nữa CO2 có thể dễ dàng tách ra từ các chấthòa tan và rất rẻ tiền Trong tự nhiên sản xuất chiết xuất và cô lập chất lỏng siêu tớihạn (SFE), đặc biệt là sử dụng CO2 siêu tới hạn, đã trở thành phương pháp phổ biến.Công nghệ hiện đại cho phép điều chỉnh chính xác sự thay đổi nhiệt độ và áp suất,giúp tách lấy các sản phẩm tự nhiên dễ dàng Phương pháp carbon dioxide siêu tớihạn (SC-CO2) lý tưởng cho việc chiết xuất các sản phẩm từ nguyên liệu thực vật vàđặc biệt được dùng để chiết xuất hợp chất thermolabile ở nhiệt độ thấp Ngoài ra,phương pháp này cho phép thu được chất cần chiết và loại dung môi mà không cần

sử dụng thêm hóa chất

Ưu điểm:

- Khả năng khuếch tán tốt

- Độ nhớt thấp, áp suất hơi cao, điểm quá tới hạn của CO2 dễ đạt

- Độ chọn lọc cao với các loại hợp chất cần thiết Vì thế chất chiết

tương đối sạch

- Dễ áp dụng ở quy mô công nghiệp

- Thân thiện với môi trường

- Tốc độ phản ứng lớn

- Tc = 31,1oC nên hòa tan chất dễ phân hủy ở nhiệt độ cao

- Có khả năng tái sử dụng vì vậy chi phí rẻ hơn

Nhược điểm:

- Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền

- Không thích hợp với các mẫu chiết dạng lỏng

- Khó lường được khi chiết trên một mẫu mới Cần có nhiều nghiên cứu

tìm các thông số tối ưu để chiết thành công

Ở Việt Nam, các nghiên cứu ban đầu về việc sử dụng CO2 siêu tới hạn đểtách các dịch chiết quý đã được tiến hành tại viện Hóa học công nghiệp Việt Nam,viện Dược liệu

1.3.3.2 Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm

Đây là kỹ thuật chiết thay thế rẻ tiền, đơn giản và hiệu quả Sóng siêu âmthường được sử dụng để cải thiện việc chiết lipid, protein và các hợp chất phenolic

từ thực vật khảo nghiệm quá trình chiết xuất các hợp chất phenol từ Folium eucommiae sử dụng sóng siêu âm, và thu được hiệu quả hơn so với chiết chất bằng

cách gia nhiệt, bổ sung enzyme hỗ trợ chiết tách Sóng siêu âm có khả năng phá vỡmàng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho sự xâm nhập của dung môi vào bêntrong tế bào dễ dàng hơn Ngoài ra siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn manh dungmôi do đó làm tăng sự tiếp xúc của dung môi và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết.Chiết suất anthocyanin từ vỏ nho bằng cách sử dụng bể siêu âm ở tần số 35 kHztrong 30 phút sau đó khuấy ở nhiệt độ 700oC

- Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu quả

là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly

- Thời gian lọc dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất mộtlượng dịch chiết hoặc dịch chiết có thể bị nhiễm bẩn

1.3.3.3 Phương pháp chiết hỗ trợ vi sóng

Vi sóng (micro-onde, microwave) là sóng cực ngắn hay còn gọi là sóng siêutần, sóng UHF (Ultra High Frequence wave) Trong lĩnh vực ISM(Industry, Sci-

ence, Medicine) trên thế giới người ta quy ước sử dụng các loại vi sóng có tần số

915, 2450, 5800, 24125MHz Trong các tần số trên chỉ có tần số 2450 MHz là được

sử dụng rộng rãi Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vòng visóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịuđồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng củađiện trường Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm choviệc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyềnthống

Trong chiết xuất, trong chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểuphân nguyên liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực

sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dungmôi Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm cácchất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyểnthành hòa tan đơn giản Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũnglàm dịch chiết nhiều tạp chất hơn Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuấtnguyên liệu ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho chiết xuấttruyền thống (như chiết bằng Soxhlet) do rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vàichục giây tới 15-20 phút Cũng đã có những thiết bị chiết vi sóng ở quy mô lớn.Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng cũng có nhược điểm đó là các tạp chất trong dịchchiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp tiếp theo Thiết bị chiết hỗ trợ bằng visóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn theo hơinước Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm lượng tinh dầu thu được thườngcao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn Cũng có báo cáo

về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương pháp này như chiết saponin, thraquinon, alkaloid

an-Ưu điểm:

- Không có quán tính nhiệt

- Hiệu suất chiết cao hơn so với một số phương pháp thông thường.

- Sản phẩm trích ly chất lượng tốt

- Thiết bị dễ sử dụng, an toàn và bảo vệ môi trường ( Năng lượng sạch,

dễ chế tạo, dễ kiểm soát)

- Thời gian chiết nhanh

- Có tác dụng đặc biệt với các phân tử phân cực

Nhược điểm:

- Không áp dụng cho các phân tử không phân cực

- Khó áp dụng cho quy mô công nghiệp vì đầu tư cho thiết bị tạo vi sóng là khôngnhỏ để có đủ công suất

- Nhiệt độ sôi của các dung môi đạt được rất nhanh, có thể gây nổ

1.3.3.4 Chiết dưới áp suất cao

Bên cạnh 3 phương pháp chiết xuất trên, ngày nay chiết dưới áp suất cao(pressurized liquid extraction – PLE) là một kỹ thuật chiết được sử dụng trong chiếtxuất hiện đại Khả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vàonhiệt độ Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng Vì thế, trong chiết xuất,người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giả thờigian chiết Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ để chiết cógiới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi Khi hóa hơi, dung môi không còn khảnăng hòa tan các chất nữa Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chấtdưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suấttăng Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới áp suất

Khi nhiệt độ tăng lên 10oC, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi.Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần vớivùng tới hạn Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán củadung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80 –200oC và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết

So với SFE, PLE có sự linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi do đó cóthể chiết các chất trong một giới hạn rộng hơn về độ phân cực Các thiết bị cũngkhông cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt như SFE nên dễ dàng áp dụng thực tế trênquy mô lớn.

Một biến thể của PLE cũng được áp dụng trong chiết xuất nguyên liệu làchiết bằng nước nóng dưới áp suất (pressurized hot water extraction, PHWE) Dodiểm tới hạn của nước khá cao nên trong PHWE người ta dùng áp suất thấp hơnnhiều (chỉ vào khoảng 20 bar) ở nhiệt độ thay đổi từ trên 100 – 200oC Đặc tính (độphân cực) của nước thay đổi rất nhiều trong điều kiện này làm cho nước có thể chiếtđược các chất kém phân cực hơn Trong PHWE, sự phân hủy các chất có thể xảy ra

1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết [1]

1.4.1 Dung môi

Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năngchiết tách không giống nhau Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quátrình chiết xuất là: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt

Độ phân cực của dung môi: dung môi kém phân cực thì dễ hòa tan nhữngchất không phân cực, dung môi càng phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phâncực.Độ nhớt và sức căng bề mặt: độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏthì dung môi càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chấtcần chiết Độ nhớt cao sẽ cản trở quá trình khuếch tán của chất

Bảng 1.3 Độ nhớt () và sức căng bề mặt () của một số dung môi thường

gặp ở nhiệt độ 20oC (xếp theo thứ tự tăng dần)

Dung môi  (cp) Dung môi  (dyn/cm)

 Đối với hợp chất kém bền ở nhiêt độ cao: nhiêt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một

số hoạt chất như vitamine, glycosid, alkaloid

 Đối với tạp chất: Khi nhiêt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng

của tạp chất cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp chất Nhất là đối vớimột số tạp như gôm, chất nhầy khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa,

độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế

 Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi

dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi

 Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độ tăng, độ

tan của chúng lại giảm Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên thấy tùy từng trường hợp cụ thể mà lựu chọn nhiệt

độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dungmôi, phương pháp chiết.).

1.4.3 Thời gian chiết xuất

Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽđược hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tửlượng lớn (thường là tạp như nhựa, keo ) Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ khôngchiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫnnhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại, cần lựa chọn thờigian chiết, thành phần dược liệu dung môi, phương pháp chiết phù hợp

1.4.4 Độ mịn của dược liệu

Khi kích thước của nguyên liệu chiết thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướtđược dược liệu, hoạt chất khó hòa tan vào dung môi Khi độ mịn của dược liệu tănglên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu chiết và dung môi tăng lên; theo định luậtFick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết sẽ nhanhhơn Tuy nhiên thực tế nếu nguyên liệu chiết quá mịn sẽ gặp một số bất lợi sau:

- Bột nguyên liệu bị dính bết vào nhau tạo thành dạng bột nhão vón cục, khi đó sẽlàm chậm quá trình chiết xuất Mặt khác khi lọc dịch chiết dịch sẽ chảy chậm hoặckhông chảy được vì bột nguyên liệu dính kết vào nhau và do các hạt kích thước nhỏbít kín lỗ chảy của màng lọc

- Nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp, gây khó khăn choquá trình tinh chế và bảo quản

- Từ đó phải lựa chọn độ mịn nguyên liệu thích hợp, tùy trường hợp cụ thế, tùyvào nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết Vd: với nguyên liệu đã giàcần xay mịn; với nguyên liệu nhiều chất nhầy, chất nhựa nên xay thô Với dung môi

dễ hòa tan nhiều tạp hoặc chiết ở nhiệt độ cao thì nguyên liệu không nên quá mịn

0 1.4.5 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

0 Tỷ lệ DM/NL góp phần quan trọng trong việc chiết xuất, tạo điều kiệnkhuếch tán các chất từ trong tế bào ra ngoài dung môi Nếu tỷ lệ DM/NL quá thấpdẫn đến tốc độ khuếch tán cơ chất chậm, có thể dẫn đến hiệu suất chiết thấp, ngượclại nếu tỷ lệ DM/NL cao quá sẽ tạo ra hiệu suất cao thời gian ngắn, nhưng tốn kémtrong thu hồi dung môi và tốn dung môi

1.4.5 pH dung môi

pH dung môi có ảnh hưởng đến khẳ năng chiết chất hợp chất tự nhiên Trongmôi trường kiềm việc hút cation mạnh hơn anion, còn trong môi trường acid thìngược lại

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Xạ đen (Celastrus hindsu) sử dụng trong nghiên cứu được thu hái tại KhánhHòa

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), K3(Fe[CN]6), FeCl3, axit racetic (TCA), NaH2PO4, Na2HPO4, cồn 99.5% Tất cả hóa chất sử dụng trongnghiên cứu đều đạt hạng phân tích Được mua tại cửa hàng hóa chất và dụng cụ thínghiệm Hoàng Trang 42-Hoàng Hoa Thám-Phường Lộc Thọ-Nha Trang-KhánhHòa

trichlo-2.2.2 Thiết bị

Sử dụng các thiết bị chủ yếu: bể ổn nhiệt, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm,máy so màu UV- VIS, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, phễulọc, pipet hiện có tại các phòng thí nghiệm của trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.3 Xác định tổng năng lực khử

Tổng năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) [12] vớimột vài hiệu chỉnh nhỏ Cách tiến hành được mô tả trong phụ lục 1.3

2.3.2 Bố trí thí nghiệm.

2.3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Cách tiến hành: Lá hoặc thân xạ đen được thu hoạch đưa về phòng thí nghiệm, tiến

hành xay nhỏ đến kích thước nhất định, chiết bằng một số dung môi khác nhau nhưnước và cồn ở thời gian nhất định Sau đó, tiến hành lọc bằng giấy lọc whatman để

Bã

thu dịch lọc và tiến hành xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ lá xạđen.

2.3.2.2 Thí nghiệm xác định bộ phận chiết thích hợp

1

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy

hóa của dịch chiết từ một số bộ phận cây xạ đen Tiến hành:

Chuẩn bị 3 bình tam giác 250ml , bình thứ nhất cho 2g lá khô đã xay nhỏ, bìnhthứ 2 cho vào 7g là tươi đã xay nhỏ và bình thứ 3 cho vào 7g thân cây đã cắt nhỏ,

bổ sung 60ml nước, đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để

ổn định nhiệt độ chiết là 100oC Sau 15 phút lấy ra, để nguội, lọc bằng giấy man 01, lọai bỏ bã thu lấy dịch chiết Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Tỷ lệ DM/NL: 30/1Thay đổi nguyên liệu chiết:

lá khô, lá tươi, thân

Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Chọn thông số thích

hợp

Bã

Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn nguyên liệu chiết thíchhợp nhất và tiến hành cho các thí nghiệm sau.

2.3.2.3 Thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp

Tỷ lệ DM/NL: 30/1

Ethanol 70%

Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Bã

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp

 Cách thực hiện

Cho 2g lá khô đã chuẩn bị vào bình tam giác 250ml, bổ sung 60ml

ethanol 70%, đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổnđịnh nhiệt độ chiết là 60oC Sau 40 phút lấy ra, để nguội, lọc bằng giấy whatman 01,lọai bỏ bã thu lấy dịch chiết Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Tiến hành làm lần lượt với ethanol 90% và nước Cách làm tương tự nhưtrên

Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn dung môi chiếtthích hợp nhất và tiến hành cho các thí nghiệm sau

2.3.2.4 Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp

 Dung môi chiết: nước

 Thời gian chiết: 20 phút

 Tỷ lệ DM/NL: 30/1

Xác định hoạt tínhchống oxy hóa

70oC

Bã